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Bioengineering

Microscale भंवर की सहायता अनुक्रमिक आण्विक डिलिवरी के लिए electroporator

Published: August 7, 2014 doi: 10.3791/51702
Automatic Translation
1, 1
1The Rowland Institute, Harvard University

Summary

एक microfluidic भंवर सहायता electroporation मंच सटीक और स्वतंत्र खुराक नियंत्रण के साथ समान सेल आबादी में कई अणुओं की अनुक्रमिक डिलीवरी के लिए विकसित किया गया था. सिस्टम के आकार के आधार लक्ष्य सेल शुद्धि कदम पूर्ववर्ती electroporation आणविक वितरण दक्षता और संसाधित सेल व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए सहायता प्राप्त.

Abstract

यह शारीरिक रूप से कोशिकाओं में गैर permeant बहिर्जात आणविक जांच शुरू करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली तकनीक है क्योंकि electroporation, पिछले कुछ वर्षों में बढ़ती ध्यान दिया गया है. इस काम के सटीक और आणविक निर्भर पैरामीटर नियंत्रण के साथ स्तनधारी कोशिकाओं के लिए कई अणु वितरण प्रदर्शन करने में सक्षम एक microfluidic electroporation मंच की रिपोर्ट. समान आकार वितरण के साथ कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रणाली की क्षमता को देखते हुए बिजली के क्षेत्र ताकत प्रति electroporation दक्षता में कम बदलाव के लिए अनुमति देता है; इसलिए नमूना व्यवहार्यता बढ़ाया. इसके अलावा, अपने प्रक्रिया दृश्य सुविधा दक्षता बढ़ाने के लिए बगल में शीघ्र आणविक वितरण पैरामीटर समायोजन परमिट जो वास्तविक समय में फ्लोरोसेंट आणविक तेज प्रक्रिया के अवलोकन के लिए अनुमति देता है. सूचना मिली मंच की विशाल क्षमताओं को दिखाने के लिए, विभिन्न आकार और विद्युत शुल्क के साथ बड़े अणुओं (जैसे, dextran 3,000 और 70,000 दा की मेगावाट) के साथ थेसभी परीक्षण के अणुओं के लिए उच्च वितरण क्षमता (> 70%) के साथ मेटास्टैटिक स्तन कैंसर कोशिकाओं को दिया. विकसित मंच पर चिप electroporation तकनीक फायदेमंद हो सकता है, जहां अनुसंधान क्षेत्रों के विस्तार में उपयोग के लिए अपनी क्षमता साबित कर दी है.

Introduction

हाल के वर्षों में, कोशिकी अणुओं की साइटोसोलिक प्रसव की सुविधा के लिए बिजली दालों का उपयोग स्तनधारी कोशिकाओं को जोड़ तोड़ की एक आकर्षक साधन बन गया है. 1 भी electroporation के रूप में जाना जाता है इस प्रक्रिया, reversibly पहुँच प्राप्त करने के लिए स्वाभाविक झिल्ली अभेद्य अणुओं के लिए अनुमति देता है, सेलुलर झिल्ली permeabilizes 'कोशिकाओं intracellular परिवेश को. वास्तव में किसी भी अणु electroporation का उपयोग कोशिकाओं के किसी भी प्रकार की झिल्ली में अस्थायी बनाया pores के माध्यम से cytosol में पेश किया जा सकता है, क्योंकि तकनीक के रूप में बताया गया है किया जा रहा है, अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सार्वभौमिक रूप से लागू है, और वायरस की मध्यस्थता, रासायनिक सहित अन्य तरीकों की तुलना में अधिक कुशल कोशिकाओं व्यवहार्य और बरकरार रखते हुए और ऑप्टिकल दृष्टिकोण. 2-3 इस तकनीक, फ्लोरोसेंट अणुओं को पेश करने के लिए 4 दवाओं 5 और न्यूक्लिक एसिड 6-7 उपयोग किया गया है. इन लाभों को देखते हुए, electroporation एक आम श्रम के रूप में अपनाया गया हैडीएनए अभिकर्मक के लिए atory तकनीक, vivo में जीन थेरेपी 8 और सेल टीकाकरण पढ़ाई. सफल electroporation के लिए आवश्यक बिजली के क्षेत्र ताकत बारीकी सेल के व्यास के साथ संबद्ध क्योंकि पारंपरिक electroporation सिस्टम एक साथ आकार में बड़ी विविधता के साथ नमूने के लिए व्यावहारिक दक्षता और व्यवहार्यता को प्राप्त करने के लिए यह अभी भी, हालांकि, मुश्किल है. इसके अलावा, उन प्रणालियों कई आणविक मात्रा का सटीक नियंत्रण थोक स्टोकेस्टिक आणविक वितरण की प्रक्रिया पर निर्भरता की वजह से दिया जा रहा है की अनुमति नहीं है. 9 इन मुद्दों का समाधान करने के लिए, कई समूहों, कम poration voltages के लाभ की पेशकश की, microfluidic electroporation प्लेटफॉर्म विकसित किया है बेहतर अभिकर्मक दक्षता, सेल मृत्यु दर में एक बड़ी कमी है, और कई अणुओं देने की क्षमता. 10-13 ये लाभ जिसका इलेक्ट्रोड पिच microscale electroporation सिस्टम के छोटे पैरों के निशान के कारण ही संभव बनाया गयालंबाई नाटकीय रूप से सफल प्रसव के लिए आवश्यक voltages कम, उप मिलीमीटर हैं. इसके अलावा, इन microscale electroporation सिस्टम वितरण दक्षता बढ़ाने, जबकि कम सेल मृत्यु दर उपज उत्पन्न गर्मी नष्ट तेजी वर्दी बिजली के क्षेत्र वितरण को प्राप्त कर सकते हैं. आगे इन माइक्रोचिप्स के लिए पारदर्शी सामग्री का उपयोग शीघ्र पैरामीटर संशोधन के लिए electroporation प्रक्रिया के सीटू अवलोकन में अनुमति देता है. 2,12 हालांकि, सटीक खुराक नियंत्रण और अनुसंधान और चिकित्सीय अनुप्रयोगों, 6 उभरते के लिए आवश्यक molecular- और सेलुलर निर्भर पैरामीटर नियंत्रण,, 14-16 अभी भी अनसुलझे रहते हैं.

इस काम के क्रमिक रूप से लक्ष्य कोशिकाओं के एक पूर्व चयनित समान जनसंख्या में कई अणु देने में सक्षम एक microfluidic भंवर की सहायता electroporation प्रणाली, प्रस्तुत करता है. समान आकार वितरण के साथ कोशिकाओं को पहले से सूचना दी एसआई का उपयोग पूर्व electroporation को अलग कर रहे हैंज़ी चयनात्मक फँसाने तंत्र. 17-18 एक समान आकार के वितरण, कम भिन्नता electroporation दक्षता में और हासिल किए गए थे दिया बिजली क्षेत्र की ताकत के अनुसार बढ़ाया व्यवहार्यता होने से. 19 इसके अलावा, लगातार microscale भेंवर का उपयोग फंस कोशिकाओं आंदोलनकारी भर में अणुओं की वर्दी वितरण के लिए अनुमति दी परिणाम के साथ समझौते में पूरे cytosol, इससे पहले, इस प्रणाली सामान्यतः जैविक अनुप्रयोगों में उपयोग अणुओं की एक व्यापक श्रृंखला के लिए लागू किया जाएगा दिखाना है कि. एक और भंवर की सहायता electroporation के मंच का उपयोग कर 20 की सूचना के लिए दिया गया आणविक वजन की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ बड़े अणुओं मेटास्टैटिक स्तन कैंसर की कोशिकाओं. इसके अलावा, वास्तविक समय प्रक्रिया की निगरानी की सहायता के साथ, यह काम मुख्य रूप से प्रसार की मध्यस्थता. 14 बनाम वैद्युतकणसंचलन की मध्यस्थता जा रहा है, electrporation दौरान आणविक वितरण की व्यवस्था के बारे में लंबे समय से चली आ रही बहस को समाप्त करने के लिए और अधिक सबूत प्रदान करता है 6,14,21-22 दवा वितरण अनुप्रयोगों 10,19 और अनुप्रयोगों के लिए एक बहुमुखी उपकरण के रूप में व्यावहारिक क्षमता है.

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Protocol

1 सेल तैयार

  1. प्लेट 1 × 10 10% (v / v) भ्रूण गोजातीय सीरम और 1 के साथ पूरक लेबोविट्ज़ एल 15 मध्यम में टिशू कल्चर T75 फ्लास्क प्रति 10 मिलीलीटर की मात्रा में मेटास्टैटिक स्तन कैंसर कोशिका लाइन एमडीए MB-231 के 5 कोशिकाओं / एमएल % पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन.
  2. 0% सीओ 2 के वातावरण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में एमडीए MB-231 कोशिकाओं को सेते हैं.
  3. 2 मिनट के लिए 0.25% trypsin EDTA के साथ कोशिकाओं के इलाज से 2 दिन बोने के बाद प्रयोगों के लिए हार्वेस्ट कोशिकाओं और विकास मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़कर trypsin के enzymatic गतिविधि निष्क्रिय.
  4. 5 × 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता (सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + बिना, DPBS, 1x) Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा में 200 × छ और resuspend पर 5 मिनट के लिए centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं.

2 डिवाइस डिजाइन और निर्माण

नोट: मुखौटा, मास्टर ढालना fabrications औरmicrochannel enclosing प्रक्रिया polydimethylsiloxane (PDMS) microchannel चयन प्रक्रिया एक नियमित प्रयोगशाला benchtop पर प्रदर्शन किया जा सकता है, जबकि एक साफ कमरे के अंदर आयोजित किया जाना है.

  1. AutoCAD के साथ चित्र 1 में सचित्र के रूप में एक microfluidic डिवाइस डिजाइन. डिवाइस (, एल = 7 मिमी डब्ल्यू = 40 माइक्रोन, और एच = 70 माइक्रोन) कई इंजेक्शन बंदरगाहों, मोटे फिल्टर और दो समानांतर सीधे आयताकार जड़त्वीय ध्यान केंद्रित चैनल के साथ एक इनलेट से मिलकर चाहिए. व्यक्तिगत सीधे चैनल एल्यूमीनियम इलेक्ट्रोड के लिए छेद के माध्यम से दो के साथ अलग 800 माइक्रोन रखा जाता है जो 5 electroporation कक्षों, (डब्ल्यू सी = 400 माइक्रोन) के होते हैं. दो transversally आसन्न electroporation कक्षों नकारात्मक इलेक्ट्रोड के लिए छेद साझा. दो सीधे चैनलों electroporation क्षेत्र के बहाव में एक दुकान में विलय.
  2. LinkCAD का उपयोग कर एक GDSII फाइल करने के लिए सूक्ष्म पैटर्न के साथ सीएडी फ़ाइल में परिवर्तित. रिक्त एक 5 "एक्स 5" photomask पर माइक्रो पैटर्न लिखेंएक लेजर मुखौटा लेखक का उपयोग कर. निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करके मुखौटा का विकास करना. नोट: मुखौटा विकास प्रक्रिया photoresist विकास, क्रोम नक़्क़ाशी और हटाने का विरोध भी शामिल है. वैकल्पिक रूप से, सूक्ष्म पैटर्न एक उच्च संकल्प पारदर्शिता पर मुद्रित (> 20,000 डीपीआई) एक तीसरे पक्ष के निर्माता से खरीदा और एक photomask के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक photomask पर अंतिम microscale सुविधाओं एक नकारात्मक photoresist की ध्रुवता मैच के लिए पारदर्शी होना चाहिए.
  3. 70 माइक्रोन की अंतिम मोटाई के लिए 2,000 rpm पर एक 4 इंच सिलिकॉन वेफर पर एक नकारात्मक photoresist काता कोट के साथ मानक नरम लिथोग्राफी तकनीक 23 का उपयोग कर डिवाइस डिजाइन के कास्टिंग मोल्ड बनाना.
  4. 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए नकारात्मक photoresist के साथ वेफर Prebake.
  5. वेफर के साथ मुखौटा संपर्क करें और एक मुखौटा aligner का उपयोग कर 80 सेकंड के लिए एक यूवी स्रोत (17.4 MJ / 2 सेमी) को बेनकाब.
  6. एक SU-8 डेवलपर में 4 मिनट के लिए खुल वेफर का विकास करना.
  7. उपायएक सतह profilometer का उपयोग कर विकसित photoresist मोटाई.
  8. एजेंट (सिलिकॉन elastomer किट) के इलाज के लिए elastomer के 1 अनुपात और PDMS प्रतिकृतियां उत्पन्न करने के लिए कास्टिंग मोल्ड पर मिश्रण डालना: कड़ाई से एक 10 मिश्रण. 30 मिनट के लिए कास्टिंग इलास्टोमेर देगास और 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में degassed इलास्टोमेर साथ कास्टिंग मोल्ड इलाज.
  9. एक पिन शिकंजा का उपयोग inlets, आउटलेट और इलेक्ट्रोड सम्मिलन के लिए मोल्ड और पंच छेद से microchannel पैटर्न के साथ ठीक PDMS प्रतिकृति delaminate. नोट: पिन शिकंजा की सामान्य अत्याधुनिक व्यास कसकर जगह में तिरछी ट्यूबिंग (1/32 के आयुध डिपो ") और एल्यूमीनियम इलेक्ट्रोड (0.029 के आयुध डिपो") आयोजित करने के लिए पर्याप्त 0.76 मिमी, होना चाहिए.
  10. क्रमश: 75 और डब्ल्यू 500 mTorr, के एक रेडियो आवृत्ति बिजली और ऑक्सीजन आंशिक दबाव में 7 सेकंड के लिए एक ऑक्सीजन प्लाज्मा क्लीनर में इलाज एक गिलास स्लाइड के लिए संबंध PDMS प्रतिकृतियां से घिरा microfluidic चैनलों बनाएँ.

3 फ्लो प्रयोगों

  1. डालेंएल्यूमीनियम इलेक्ट्रोड (0.029 "आयुध डिपो) और एक दुकान तिरछी ट्यूबिंग (1/32" microchannel में छेद के माध्यम से नामित स्थानों में आयुध डिपो) (3B चित्रा देखें).
  2. एल्यूमीनियम इलेक्ट्रोड के लिए उच्च वोल्टेज कम वर्ग तरंग दालों पैदा करने के लिए 18 जिम्मेदार विद्युत उपकरण कनेक्ट PDMS मोल्ड में समाधान बहने के साथ संपर्क में हैं कि (चित्रा 3C देखें). नोट: उपकरण एक पल्स जनरेटर और एक घर में निर्मित उच्च वोल्टेज एम्पलीफायर से मिलकर चाहिए 18.
  3. (चित्रा 3A देखें) कोशिकाओं और biomolecules के साथ चार 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र व्यक्तिगत रूप DPBS युक्त ट्यूबों, समाधान तैयार है, और साँस का प्रवाह नियंत्रण प्रणाली से जुड़े अपने संबंधित शीशी धारक को प्रत्येक ट्यूब देते हैं. 18
  4. Microfluidic डिवाइस में संबंधित इनलेट छेद में शीशी धारकों से प्रवेश तिरछी टयूबिंग कनेक्ट करें.
  5. बिजली धिक है ताकि 100 वी, वर्ग तरंग दालों, वी के परिमाण निर्धारित करेंएलडी ताकत, ई = वी / एल ई, electroporation चैम्बर भर में 0.7 केवी / सेमी के बराबर हो. नोट: यहाँ, एल ई सकारात्मक और नकारात्मक इलेक्ट्रोड बह समाधान के साथ संपर्क में हैं, जहां दो अंक के बीच की दूरी है (चित्रा 1 देखें).
  6. 40 साई के दबाव नियामक निर्धारित करें. नोट:. एक एकल मैन्युअल समायोज्य नाइट्रोजन स्रोत समान रूप से सभी नमूना शीशियों पर दबाव डालने के लिए प्रयोग किया जाता है और एक उच्च गति कई गुना समय पर कस्टम निर्मित LabVIEW सॉफ्टवेयर का उपयोग व्यक्तिगत समाधान बंदरगाहों को सक्रिय करने के लिए उपयोग किया जाता है 18
  7. वाल्व नियंत्रण के लिए, वाल्व धावक लेबल कस्टम निर्मित LabVIEW सॉफ्टवेयर को खोलने, और संचालित हकदार लटकती मेनू से चलाएँ.
  8. प्रत्येक इसी वाल्व आइकन पर क्लिक करके वाल्व चालू करें. नोट: यह सक्रिय होता है जब वाल्व आइकन हरी बारी चाहिए. सक्रिय आइकन पर क्लिक निष्क्रिय और वाल्व बंद हो जाएगा. बंद वाल्व आइकन ग्रे बारी चाहिए.
  9. (DPBS जलाशय के लिए वाल्व खोलनेयानी., 1.5 मिनट के लिए स्थिर सेल फँसाने भंवर पीढ़ी के लिए आवश्यक प्रधानमंत्री प्रवाह की गति को धोने के समाधान).
  10. 30 सेकंड (यानी, सेल को फँसाने कदम) के लिए electroporation कक्ष में जाल कोशिकाओं को सेल समाधान के लिए धोने के समाधान से सक्रिय समाधान बंदरगाह स्विच.
  11. समाधान स्विचन चरण के दौरान undisrupted प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए सेल को फँसाने कदम से पहले 10 सेकंड के लिए एक साथ डिवाइस के माध्यम से दोनों धोने और सेल समाधान प्रवाह. नोट: इस संक्षिप्त सह प्रवाह कदम प्रत्येक समाधान स्विचन कदम पर दोहराया जाना चाहिए.
  12. वाशिंग बंदरगाह पर मुड़ें और गैर फंस contaminating कोशिकाओं को हटाने के क्रम में 20 सेकंड के लिए डिवाइस फ्लश.
  13. ब्याज डिवाइस में (3000 दा तटस्थ और ऋणात्मक dextran अणुओं या 1.5 मिलीग्राम / 70,000 दा तटस्थ dextran अणु की मिलीलीटर की 0.2 मिलीग्राम / एमएल) की पहली अणु युक्त समाधान इंजेक्षन.
  14. तुरंत इंजेक्शन के बाद पांच कम दालों (Δt 2 सेकंड के अंतराल के साथ 30 मिसे =) लागू करेंआणविक समाधान और एक आस्टसीलस्कप का उपयोग वास्तविक समय में लागू बिजली दालों की भयावहता और अवधि पर नजर रखने के.
  15. 3.10 के रूप में कई बार अतिरिक्त अणुओं की संख्या के रूप में दोहराएँ कदम वितरित किया जाना है. प्रत्येक आणविक वितरण के लिए, तो आणविक समाधान में 100 एस के लिए कोशिकाओं सेते 100 S अतिरिक्त अणुओं को दूर करने के लिए धोने के समाधान के साथ डिवाइस फ्लश.
  16. 5 साई नीचे ऑपरेटिंग दबाव को कम करके बहाव के विश्लेषण के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को रिलीज. नोट: 100 कोशिकाओं के साथ समाधान के लगभग 100 μl प्रत्येक रिलीज से इकट्ठा किया जाता है.
  17. प्रयोगात्मक फ्लो के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 3.16 तीन बार के माध्यम से 3.9 कदम चलाएँ.
  18. 228 × जी पर 5 मिनट के लिए कार्रवाई की कोशिकाओं से युक्त 96 अच्छी तरह से थाली अपकेंद्रित्र.
  19. अतिरिक्त फ्लोरोसेंट अणु होता है कि सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  20. प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए DPBS में कोशिकाओं Resuspend.
  21. आणविक यू के लिए प्रवाह में लोड कोशिकाओंदक्षता विश्लेषण ptake.

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Representative Results

विकसित समानांतर microfluidic electroporator मेटास्टैटिक स्तन कैंसर जीवित कोशिकाओं में विभिन्न आकार और विद्युत शुल्क के साथ बड़े अणुओं को जन्म दिया. सफल आणविक वितरण गुणात्मक बगल में electroporated परिक्रमा कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन की निगरानी के द्वारा निर्धारित और प्रवाह cytometry विश्लेषण के माध्यम से मात्रात्मक माप द्वारा पुष्टि की गई. -4 ए इलाज कोशिकाओं के 90% 70,000 दा तटस्थ dextran तेज है कि पता चलता है. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, प्रत्येक फ्लोरोफोरे के लिए एक तीव्रता दहलीज unprocessed जीवित कोशिकाओं का बहुमत (> 99%) सीमा से नीचे गिना जाता है कि इस तरह स्थापित किया गया था (चित्रा 4 (ग देखें)). दक्षता कोशिकाओं की संख्या के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है सफलतापूर्वक संसाधित कोशिकाओं की कुल संख्या के हित के अणुओं को ले जा. 4B चित्रा दक्षता काफी आणविक आधार पर बदलती नहीं है कि दिखाता हैवजन या विद्युत शुल्क (> 0.1 पी). सभी परीक्षण dextran अणुओं 70% से अधिक दक्षता के साथ cytosol में कर दिया गया. इसके अलावा, चित्रा 4D अनुक्रमिक आणविक वितरण सफलतापूर्वक anionic और समान आणविक वजन (मेगावाट = 3000 डीए) के साथ तटस्थ dextrans का उपयोग कर 56% की दोहरी अणु वितरण क्षमता के साथ प्रदर्शन किया गया था कि दर्शाती है. साथ कोशिकाओं प्रक्रिया कर सकते हैं वर्तमान प्रणाली पहले से सूचना दी प्रणाली 18 से अधिक throughput और बहु अणु वितरण दक्षता 10 गुना और इस सुधार (क्रमशः, anionic और तटस्थ dextran के लिए 82% और 70%) एकल अणु वितरण को प्रभावित नहीं करता.

चित्रा 1
चित्रा 1 (ए) microfluidic electroporation प्रणाली का एक योजनाबद्ध, (सी के रूप में चिह्नित) कोशिकाओं के लिए inlets से मिलकर अणु (एम 1 और M2 के रूप में चिह्नित) और एक फ्लश solutआयन (एफ के रूप में चिह्नित), जड़त्वीय ध्यान केंद्रित होती है जहां दो सीधे चैनलों, इलेक्ट्रोड और एक दुकान से 10 electroporation कक्षों. एक 1μM FITC समाधान और एक फ्लश समाधान (DPBS) का उपयोग कर प्रवेश पर (बी) समाधान विनिमय प्रदर्शन इंगित करता सक्रिय समाधान है कि समान रूप से नीचे की ओर कक्षों के सभी सरणियों को इंजेक्ट किया जा सकता है. छवि के विपरीत देखो तालिका (lut) का समायोजन करके बढ़ाया है. स्केल सलाखों 250 माइक्रोन हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2 सकारात्मक 10 (+) और पांच नकारात्मक इलेक्ट्रोड से मिलकर लघु पल्स उच्च वोल्टेज आवेदन के लिए उपयोग 15 पिन इलेक्ट्रोड की एक तस्वीर, (-). प्रत्येक के लिए सकारात्मक इलेक्ट्रोड एक नकारात्मक इलेक्ट्रोड से 2 मिमी अलग स्थान, और ई हैएक ही polarity के ACH इलेक्ट्रोड 1.35 मिमी अलग स्थान है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा प्रयोगात्मक तंत्र के 3 योजनाबद्ध, (ए) तरल पदार्थ नियंत्रण इकाई, (बी) microfluidic electroporator, और (सी) विद्युत उपकरण से मिलकर. अणु, कोशिकाओं और स्वच्छ बफर के साथ समाधान युक्त (ए) शीशियों व्यक्तिगत रूप से दबाव रहे हैं LabView नियंत्रित वायवीय प्रवाह प्रणाली का उपयोग करते हुए मांग पर. दबाव शीशी से समाधान. स्थापित एक जाँच वाल्व के साथ तिरछी ट्यूबिंग के माध्यम से microfluidic electroporator में इंजेक्शन (बी) और (सी) विद्युत संकेतों च के साथ संपर्क में 15 पिन इलेक्ट्रोड के लिए भेजा जाता हैelectroporation कदम दौरान microfluidic प्रणाली में lowing समाधान. क्रमादेशित अवधि के साथ बिजली दालों पल्स जनरेटर और बिजली नाड़ी की भयावहता उच्च वोल्टेज एम्पलीफायर द्वारा 100 वी परिलक्षित होता है का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं. सभी लागू बिजली के मानकों एक आस्टसीलस्कप का उपयोग वास्तविक समय में निगरानी कर रहे हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4 प्रतिनिधि डेटा प्रवाह cytometry. (ए) को सफलतापूर्वक नियंत्रण समकक्ष की तुलना में, 70,000 दा anionic dextran अणु लिया जो एमडीए MB-231 कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट संकेत. (बी) क्षमता प्रत्येक तबादला dextran अणु के लिए निर्भर आणविक महत्वपूर्ण प्रदर्शन नहीं करतेभिन्नता (p> 0.1). (सी) electroporation (नियंत्रण) के साथ इलाज नहीं किया गया है, जो कोशिकाओं के लिए प्रोफाइल, cytometry प्रतिनिधि प्रवाह. सफल आणविक वितरण का संकेत फ्लोरोसेंट सीमा नियंत्रण के नमूने से संकेत सीमा से नीचे पाया जाता है कि इस तरह के डेटा से निर्धारित है. क्रमिक electroporated कोशिकाओं के लिए डेटा cytometry (डी) प्रतिनिधि प्रवाह. सही साइड पर भूखंड और फ्लोरोसेंट लकीर छवियों प्रवाह cytometry में, हरे, लाल और पीले बॉक्स क्रमश: 3,000 दा तटस्थ dextran केवल, anionic dextran केवल और दोनों dextran अणुओं uptaking कोशिकाओं से फ्लोरोसेंट संकेत का प्रतिनिधित्व करते हैं. स्केल बार 100 मीटर है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

Throughput और बहु अणु वितरण की दक्षता में नए parallelized electroporation मंच, 10 गुना वृद्धि के साथ पहले से विकसित एकल कक्ष प्रणाली प्रदान करता है कि सभी गुण के अलावा हासिल की थी. 18 पहले उपलब्ध गुण (i) पूर्व शुद्धि शामिल व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए एक समान आकार के वितरण, (द्वितीय) सटीक और व्यक्तिगत आणविक खुराक नियंत्रण, और (iii) कम परिचालन बिजली के वर्तमान के साथ कोशिकाओं को लक्षित. वे आणविक भार, संयुग्मित फ्लोरोफोरे प्रकार, और बिजली के आरोपों की एक विस्तृत श्रृंखला में आसानी से उपलब्ध हैं, क्योंकि fluorescently लेबल dextrans ब्याज के अणुओं के रूप में चुने गए हैं. इन स्थूल अणुओं. फ्लोरोसेंट dextran, ऊष्मायन समय के 24 इष्टतम एकाग्रता वे स्वाभाविक हैं जीवित कोशिकाओं के लिए अभेद्य झिल्ली और cytotoxicity का प्रदर्शन नहीं करते हैं क्योंकि इस तरह के एक अध्ययन के लिए अच्छा उम्मीदवार हैं, और बिजली के मानकों मौजूदा प्रणाली से पहले टी के लिए पहचान की गईelectroporation प्रयोगों ओ. अनुकूलन की प्रक्रिया के कारण वास्तविक समय में आणविक तेज प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए मंच की क्षमता के लिए नहीं बल्कि सरल और कुशल था. इस प्रक्रिया के दृश्य थोड़ा करने वाली कोई electroporation के मापदंडों के ज्ञान के साथ एक अणु या सेल प्रकार का परीक्षण किया जा रहा है अगर बहुत फायदेमंद है. परीक्षण सभी अणुओं के लिए ऊष्मायन समय सफल आणविक प्रसव के पूरा होने का संकेत है, सभी 10 कक्षों में फंस कोशिकाओं वास्तविक समय में पता लगाने योग्य फ्लोरोसेंट तीव्रता संकेत दिखा रहे हैं जिसके द्वारा 100 S होना तय किया गया था. इस आणविक वितरण के लिए आवश्यक न्यूनतम ऊष्मायन अवधि नहीं है कि ध्यान दें.

यह केवल प्रसार 4,19,25 द्वारा या वैद्युतकणसंचलन द्वारा मध्यस्थता है, चाहे electroporation का उपयोग आणविक प्रसव प्रक्रिया के बारे में एक लंबे समय से चली आ रही बहस हुई है. आणविक वितरण की प्रभावी तंत्र की 26 पहचान की तुलना, श्रमसाध्य व्यक्ति परीक्षण की एक श्रृंखला शामिल टीवह आणविक आकार, विद्युत शुल्क और electroporation मापदंडों के आधार पर परिणामों. लेखक 'ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, इन श्रमसाध्य अनुकूलन प्रक्रियाओं पारंपरिक electroporation सिस्टम के साथ सूचित नहीं किया गया. 4,26-28 विकसित प्रणाली के सरल पैरामीटर अनुकूलन क्षमता electroporation दक्षता में की जांच विविधताओं से, प्रमुख आणविक वितरण तंत्र की पहचान के लिए अनुमति दी आणविक और बिजली मापदंडों पर निर्भर करता है. परिणाम anionic 3,000 दा dextran की दक्षता मनाया आणविक तेज संभवतः प्रसार द्वारा मध्यस्थता गया था, सुझाव है कि अपनी तटस्थ समकक्ष (क्रमशः 83 और 75%) की तुलना में काफी अलग नहीं था कि पता चला है. अन्य electroporation प्रणालियों के विपरीत, संसाधित कोशिकाओं लगातार इस प्रणाली में electroporation प्रक्रिया में उत्तेजित थे. परिक्रमा कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट संकेत में क्रमिक वृद्धि कि प्रसार सुझाव Domina होगा, मनाया गयाNT वितरण तंत्र. तटस्थ 70,000 दा dextran अणुओं के उच्च दक्षता आणविक तेज (90%) आगे भी उच्च आणविक भार में प्रसव प्रक्रिया प्रसार का एक परिणाम के रूप में होता है कि निकलता है. अन्त में, 3000 दा anionic और तटस्थ dextran अणुओं की सफल अनुक्रमिक वितरण आणविक वितरण अणुओं आरोप के बावजूद कि तब होता दावा solidifies. यह परिणाम भी झिल्ली resealing electroporation के 3 मिनट (आणविक वितरण प्रति 100 सेकंड) के भीतर पूरा नहीं कर रहा है कि पता चलता है.

प्रस्तुत आणविक वितरण मंच क्रमिक रूप से भले ही उनके विद्युत शुल्क की आणविक आकार की व्यापक रेंज प्रदान कर सकते हैं. समय पर ठीक ट्यूनिंग और व्यक्तिगत मापदंडों के संशोधन वास्तविक समय प्रक्रिया की निगरानी क्षमता द्वारा सहायता प्राप्त कम प्रयास के साथ प्राप्त किया जा सकता है. सिस्टम के आकार के आधार पर सेल शोधन प्रक्रिया श्रमसाध्य नमूना तैयार करने और समय लेने वाली centrifugation के पूर्व और बाद electroporation के लिए आवश्यकता समाप्तकदम. इसके अलावा, सिस्टम के कम परिचालन वर्तमान में काफी सेल मृत्यु दर कम कर देता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम रोलैंड जूनियर फेलो प्रोग्राम के द्वारा समर्थित है. क्रिस स्टोक्स कस्टम निर्मित, कंप्यूटर की मदद से दबाव नियंत्रण सेटअप, पीएच.डी. डायने Schaak, के विकास में उनकी मदद के लिए: लेखक हार्वर्ड में रोलैंड संस्थान में वैज्ञानिकों और कर्मचारियों के लिए आभार व्यक्त करना चाहते हैं जैविक नमूने से निपटने के लिए उसके इनपुट के लिए, Winfield हिल के लिए बिजली सेटअप, पीएच.डी. Alavaro सांचेज़, विकासशील दबाव स्थापना के लिए आवश्यक यांत्रिक पाइपलाइन घटकों मशीनिंग के लिए प्रवाह, स्कॉट Bevis, केनी स्पेंसर और डॉन रोजर्स को पहुँच देने के लिए. Microfluidic स्वामी हार्वर्ड विश्वविद्यालय में नेनो पैमाने सिस्टम के लिए केंद्र (सीएनएस) में गढ़े गए थे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDA-MB-231 cancer cell line American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
Leibovitz’s L-15 Medium Cellgro, Mediatech, Inc. 10-045-CV
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Life Technologies 16000-044
Penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Cellgro, Mediatech, Inc. 21-030
Trypsin Gibco, Life Technologies 25200-056
Flow Cytometer easyCyte HT Millipore 0500-4008
Oxygen Plasma Cleaner Technics Micro-RIE
Dektak 6M surface profiler Veeco
KMPR 1050 Microchem
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT Dow Corning
Compressed Nitrogen gas Airgas NI 300
High Pressure Regulator McMaster-Carr 6162K22
Downstream regulator McMaster-Carr 4000K563
High-speed 3/2way-8 valve manifold Festo
Inline Check Valve Idex Health and Science CV3320
5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes Pneumadyne PU-156F-0
1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes Pneumadyne PU-250PB-4
1/16" PEEK tubings Festo P1533
1/32" PEEK tubings Idex Health and Science P1569
PEEK tubing unions Idex Health and Science P881
Pulse Generator HP 8110A
Aluminum Wire Bob Martin Company 6061 ALUM
Oscilloscope Agilent DSO3062A
50 ml centrifuge tubes VWR 21008-178
15 ml centrifuge tube VWR 21008-216
T75 culture flask VWR 82050-862
Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic Gibco, Life Technologies D3307
Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral  Gibco, Life Technologies D1819
Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral Gibco, Life Technologies D3329

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 90 electroporation microfluidics सेल अलगाव जड़त्वीय ध्यान केंद्रित macromolecule वितरण आणविक वितरण प्रणाली
Microscale भंवर की सहायता अनुक्रमिक आण्विक डिलिवरी के लिए electroporator
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Vickers, D. A. L., Hur, S. C.… More

Vickers, D. A. L., Hur, S. C. Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery. J. Vis. Exp. (90), e51702, doi:10.3791/51702 (2014).

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