Summary
Bir mikro-akışkan girdap eliyle elektroporasyon platformu kesin dozaj ve bağımsız kontrolü ile aynı hücre popülasyonlarına dağılımını çok sayıda molekülün ardışık olarak verilmesi için geliştirilmiştir. Sistemin büyüklüğü göre hedef hücre saflaştırma adımı önceki elektroporasyon moleküler verme etkinliğini ve işlenmiş hücre canlılığı arttırmak için destekli.
Abstract
Fiziksel hücrelerine olmayan geçirgenler dışsal moleküler problar tanıtmak için çok güçlü bir tekniktir çünkü elektroporasyon, geçmiş yıllarda artan ilgi görmüştür. Bu çalışma, hassas ve moleküler bağlı bir parametre kontrol memeli hücreleri için birden fazla molekül teslimat gerçekleştirebilen bir mikroakışkan elektroporasyon platformu bildirir. Üniform bir boyut dağılımı ile hücreleri izole etmek için etme kabiliyeti verilen elektrik alanı gücüne göre elektroporasyon verimlilikte az varyasyona izin verir; Bu nedenle örnek canlılığı artırmıştır. Dahası, bu süreç de görselleştirme özelliği verimliliğin arttırılması için in situ moleküler hızlı teslimat parametre ayarlaması izin gerçek zamanlı flüoresan molekül alım işlemi, gözlem için izin verir. Bildirilen platformunun geniş yeteneklerini göstermek için, farklı boyutlarda ve elektrik ücretleri ile Macromolecules (örneğin, Dextran'ın 3.000 ve 70.000 Da MW ile) vardıtest edilen tüm molekülleri için yüksek bir uygulama randımanı (>% 70) ile metastatik meme kanserli hücrelere verilebilir. Geliştirilen platform-chip elektroporasyon teknikleri yararlı olabilir araştırma alanları genişleme kullanım potansiyelini kanıtlamıştır.
Introduction
Son yıllarda, hücre dışı molekülleri sitosolik sağlanmasının kolaylaştırılması için elektrik darbeleri kullanımı memeli hücreleri manipüle çekici bir araç haline gelmiştir. 1 ayrıca elektroporasyon gibi bilinen bu yöntem, tersine çevrilebilir şekilde erişim elde etmek için doğal olarak zarın geçirgen moleküller sağlayan, hücresel membran permeabilizes hücrelerin hücre içi muhitine. Hemen hemen herhangi bir molekül, elektroporasyon kullanılarak hücre herhangi bir tip membran geçici oluşturulan gözenekler yoluyla sitosol içine sokulabilir için, teknik olarak rapor edilmiş olan, daha fazla tekrarlanabilir evrensel olarak uygulanabilir, ve virüs aracılı, kimyasal mekanizmayı da içeren diğer yöntemlere göre daha verimli Hücreler, canlı ve sağlam tutarken ve optik yaklaşımlar. 2-3 Bu teknik, floresan molekülleri yerleştirilebilir 4 ilaçlar 5 ve nükleik asitler 6-7 kullanılmıştır. Bu faydaları göz önüne alındığında, elektroporasyon ortak emek olarak kabul edilmiştirDNA, transfeksiyonu için atory teknik, in vivo gen terapisi 8 ve hücre aşı çalışmaları. Başarılı elektroporasyon için gerekli olan elektrik alan gücü yakından hücrenin çapı ilişkilidir, çünkü geleneksel elektroporasyon sistemleri aynı zamanda boyut olarak büyük heterojenlikleriyle bu numuneler için pratik etkinlik ve canlılığı elde etmek için olması, yine de, zordur. Ayrıca, bu sistemlerin çoklu moleküler miktarlarda hassas kontrolü toplu Stokastik moleküler teslimat sürecinde güven nedeniyle teslim izin vermez. 9 bu sorunları ele almak için bir çok grup, alt gözeneklendirmenin gerilimlerinin avantajı sunan, mikrofluidik elektroporasyon platformları geliştirdik Daha iyi transfeksiyon verimi, hücre ölüm oranlarında önemli bir azalma ve çoklu molekülleri iletme kabiliyeti. 10-13 Bu avantajlar, elektrot aralığı olan mikro elektro sistemleri az yer kaplayan sayesinde mümkün olmuşturuzunlukları ölçüde başarılı teslimat için gerekli gerilimleri azalan, alt milimetre. Ayrıca, bu mikro elektroporasyon sistemler dağıtım verimliliğini artırırken, indirgenmiş hücre ölümlerini, sonuçta üretilen ısıyı hızla homojen bir elektrik alan dağılımı elde edebilir. Ayrıca bu mikroçipler için şeffaf malzeme kullanımı istemi parametre değişiklikleri için elektroporasyon işleminin yerinde gözlem sağlar. 2,12 Ancak, hassas dozaj kontrolü ve araştırma ve tedavi uygulamaları, 6 gelişmekte için gerekli moleküllü ve hücresel-bağımlı parametre kontrolü, 14-16 hala çözülmemiş kalır.
Bu çalışma, ardışık olarak, hedef hücrelerin önceden seçilmiş aynı popülasyonu içine çok molekül verme yetisine sahip bir mikroakışkan girdap destekli elektroporasyon sistemi sunar. Üniform bir boyut dağılımı olan hücreler, daha önce rapor si kullanılarak Elektroporasyondan önce izole edilirze-seçici yakalama mekanizması. 17-18 bir üniform bir boyut dağılımı, daha az değişim elektroporasyon verimlilikte elde edildi ve belirli bir elektrik alanı gücüne göre geliştirilmiş canlılığı sahip olarak. 19 Bundan başka, sürekli mikro girdapları kullanılarak yakalanan hücrelerin ajite boyunca moleküllerin homojen dağılımı için bırakıldı sonuçları ile uyum içindedir bütün sitosol, daha önce, bu sistem, genel olarak, biyolojik uygulamalarda, molekül, geniş bir aralığına uygulanabilirdir olacağını saptamak. bir girdap destekli platform kullanılarak elektroporasyon 20 bilgi teslim edilmiştir molekül ağırlıkları çok geniş bir yelpazede olan makro moleküller metastatik meme kanseri hücreleridir. Ayrıca, gerçek zamanlı süreç izleme yardımı ile, bu iş ağırlıklı olarak difüzyon-aracılı. 14 karşı elektroforezi-aracılı olmak, electrporation sırasında moleküler teslim mekanizması ile ilgili uzun süredir tartışmalara bir son vermek için daha fazla kanıt sağlar 6,14,21-22 ilaç dağıtım uygulamaları 10,19 ve uygulamalar için çok yönlü bir araç olarak pratik bir potansiyele sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Hazırlanması
- Levha 1 x 10,% 10 (h / h) cenin sığır serumu ve 1 ile takviye Leibovitz L-15 Vasatı içerisinde doku kültürü T75 şişesi başına 10 ml'lik bir hacim içinde metastatik göğüs kanser hücre hattı MDA-MB-231 5 hücre / mi % penisilin-streptomisin.
- 0% CO2 ortamında 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, MDA-MB-231 hücreleri inkübe edin.
- 2 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA ile işleme tabi tutarak hücreler 2 gün sonra tohumlama deneyleri için Hücreleri, büyüme ortamı ve 8 ml eklenerek tripsin enzim aktivitesini bloke ederler.
- 5 x 10 5 hücre / ml 'lik bir nihai konsantrasyona (Ca 2 + ve Mg2 + olmaksızın DPBS, 1x) Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su içinde 200 x g ve tekrar süspansiyon 5 dakika boyunca santrifüj ile pelet hücreleri.
2. Cihaz Tasarımı ve İmalatı
NOT: Maske, ana kalıp yapımında veMikrokanal parça işlem olup, polidimetilsiloksan (PDMS), mikrokanal döküm işlemi normal bir laboratuvar masa üstü gerçekleştirilebilir ise temiz bir oda içinde gerçekleştirilmiştir edilecektir.
- AutoCAD, Şekil 1 'de gösterildiği gibi bir mikroakışkan cihaz tasarımı. Cihaz (L = 7 mm W = 40 um arasında, H = 70 um), birden fazla enjeksiyon girişine, kaba filtre ve iki paralel düz dikdörtgen şekilli eylemsiz odaklama kanallı bir giriş oluşmalıdır. Bağımsız bir düz kanal alüminyum elektrotlar delikleri ile iki tane ayrı 800 um yerleştirilir 5 elektroporasyon odası, (W, C = 400 um) oluşur. İki çapraz bitişik kesonlar elektroporasyon negatif elektrot için delik paylaşır. Iki düz kanal elektroporasyon bölgenin mansabında bir prize birleştirme.
- LinkCAD kullanarak bir GDSII dosyaya mikro-desenli CAD dosya dönüştürme. Boş bir 5 "x 5" photomask mikro-desen yazBir lazer maske yazıcı kullanarak. Üreticinin protokolünü takip ederek, maske geliştirir. NOT: Maske gelişim süreci Photoresist gelişen, krom aşındırma ve kaldırma karşı içermektedir. Alternatif olarak, mikro-desenler yüksek çözünürlüklü bir şeffaflık üzerine basılmış (> 20.000 dpi) üçüncü taraf üreticiler satın alınan ve bir photomask olarak kullanılabilir. Bir photomask Final mikro özellikleri olumsuz Fotorezist kutuplarını maç şeffaf olmalıdır.
- 70 um son kalınlığı için 2000 rpm'de, 4 inçlik bir silikon gofret üzerinde olumsuz bir fotorezist tabaka ile bükülmüş, standart yumuşak litografi teknikleri kullanarak cihazı 23 tasarım döküm kalıbı imal.
- 95 ° C'de 20 dakika boyunca negatif fotorezist ile gofret Önceden fırınlanmış patates.
- Gofret ile maske başvurun ve bir maske hizalama kullanarak 80 saniye boyunca bir UV kaynağı (17.4 mj / cm 2) maruz.
- Bir SU-8 geliştirici 4 dakika boyunca maruz gofret geliştirin.
- Tedbiryüzey profilometre kullanarak gelişmiş Fotorezist kalınlığı.
- Madde (silikon elastomer kiti) kurutma elastomer 1 oranında ve PDMS, kopyaları oluşturmak için döküm kalıbı üzerine dökün: dikkatli bir şekilde 10 karıştırın. 30 dakika boyunca gazdan arındırın döküm elastomer ve 2 saat boyunca 70 ° C'de bir fırın içinde gazı alınmış bir elastomer ile döküm kalıbı sertleştirmek.
- Pin mengenesi kullanarak girişleri, çıkış ve elektrot ilaveler için kalıp ve zımba deliklerinden mikrokanallı desenleri ile tedavi PDMS çoğaltma delamine. Not: pim mengenenin normal kesme kenar çapı yerine sıkıca PEEK boru (1/32 OD ") ve alüminyum elektrotlar (0,029 OD") tutulması için yeterli 0.76 mm olması gerekmektedir.
- Sırasıyla 75 ve 500 W mTorr, bir radyo frekans güç ve oksijen kısmi basıncında 7 saniye boyunca bir oksijen plazma temizleyici bir cam slayt bağlama PDMS kopyalarına kapalı mikroakışkan kanal oluşturur.
3. Akış Deneyler
- Eklealüminyum elektrotlar (0.029 "OD) ve bir çıkış PEEK boru (1/32" mikrokanalda delikleri yoluyla belirlenen yerlere OD) (Şekil 3B).
- Alüminyum elektrotlara yüksek gerilim kısa kare dalga darbeleri üretmek için 18 sorumlu elektrik donanımı bağlayın PDMS kalıp çözeltilerin akıtılmasıyla ile temas halinde olduğu (Şekil 3C). NOT: ekipman darbe jeneratörü ve bir in-house inşa yüksek gerilim amplifikatör oluşmalıdır 18.
- (Şekil 3A) hücreleri ve bir molekül olarak dört adet 50 ml'lik bir santrifüj tek DPBS ihtiva eden tüpler, çözeltiler hazırlayın ve pnömatik akış kontrol sistemine bağlı olarak, ilgili şişe tutucu için her bir tüpe takmak. 18
- Mikroakışkan cihaz ilgili giriş deliklerine flakon sahiplerinden giriş PEEK hortumu bağlayın.
- Elektrik Bes olması için 100 V, kare dalga darbeleri, V büyüklüğünü ayarlamaLD gücü E = v / l, e elektroporasyon bölmesi üzerinde 0.7 kV / cm eşdeğer olduğu. Not: Burada, Y e pozitif ve negatif elektrotlar akan çözeltisi ile temas halinde olan iki nokta arasındaki mesafedir (Şekil 1 e bakınız).
- 40 psi'ye kadar basınç regülatörü ayarlayın. NOT:. Tek elle ayarlanabilir azot kaynağı muntazam tüm numune şişeleri basınç vermek için kullanılan ve yüksek hızda manifoldu zamanında ısmarlama LabVIEW yazılımı aracılığıyla bireysel çözüm noktalarını etkinleştirmek için kullanılır 18
- Valf kontrolü için, Vana Runner etiketli ısmarlama LabVIEW yazılımı açın ve işletmek başlıklı açılır menüden çalıştırmak tıklatın.
- Her gelen valf ikonuna tıklayarak vanalar açın. NOT: aktive olduğunda vana simgesi yeşil dönmelidir. Etkin simgesini tıklayıp devre dışı ve vanasını kapatın olacaktır. Kapalı vana simgesi gri dönmelidir.
- (DPBS rezervuar vanasını açınyani., 1.5 dakika boyunca sabit bir hücre hapsi girdap oluşumu için gereklidir ana akış hızına yıkama çözeltisi).
- 30 saniye (örneğin, hücre yakalama adım) için elektroporasyon bölmesi içinde tuzak hücrelere hücre çözeltisine yıkama çözeltisi, aktif solüsyon noktası geçin.
- Çözüm anahtarlama adım sırasında undisrupted akışını sağlamak için hücre hapsi aşamasından önce 10 saniye aynı anda cihaz yoluyla hem yıkama hem de hücre çözümler akış. NOT: Bu kısa eş akış adım, her bir çözelti anahtarlama adımında tekrar edilmelidir.
- Yıkama portu açın ve non-tuzak kirlenmesine neden olan hücreler ortadan kaldırmak amacıyla 20 saniye boyunca cihazı yıkayın.
- Çevrede cihazına (3000 Da nötr veya anyonik dekstran molekülleri ya da 1.5 mg / 70000 Da nötr dekstran molekülün ml 0.2 mg / ml) ilk molekülü içeren çözelti enjekte edilir.
- Derhal enjeksiyonundan sonra beş kısa darbeleri (Dt 2 sn aralıklarla 30 msn =) UygulaMoleküler çözümü ve bir osiloskop kullanarak gerçek zamanlı olarak uygulanan elektrik akımı büyüklüğünü ve süresini izlemek.
- 3.10 birçok kez ek moleküllerin sayısı olarak adımı tekrar teslim edilmesi. Her moleküler dağıtım için, bu durumda moleküler bir solüsyon içinde 100 sn için kuluçkalayın 100 temizle fazla molekülleri uzaklaştırmak için yıkama çözeltisi ile yıkayın cihazı.
- 5 psi değerinin altında ve çalışma basıncı düşürerek alt analizi için 96 oyuklu bir plaka içerisinde hücreleri bırakın. Not: 100 hücre ile çözelti yaklaşık 100 ul her yayın toplanır.
- Deneysel akış sitometri için yeterli hücreleri toplamak için 3.16 üç kez ile 3.9 adımları çalıştırın.
- 228 x g'de 5 dakika boyunca işlenen hücreleri ihtiva eden 96 oyuklu bir plaka santrifüj.
- Aşırı floresan moleküller içerir süpernatantı.
- Flow sitometri analizi için DPBS'de süspansiyon hücreleri.
- Moleküler u sitometrede akışında yük hücreleriverimlilik analizi emme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geliştirilen paralel mikroakışkan Electroporator metastatik meme kanseri hücrelerini canlı olarak çeşitli boyutlarda ve elektrik ücretleri makromolekuller teslim. Başarılı moleküler teslimat yerinde niteliksel elektroporasyona yörüngedeki hücrelerinin floresan yoğunluğundaki değişmeler izlenerek tespit ve akış sitometresi analizi ile ölçümü ile teyit edilmiştir. 4A muamele edilen hücrelerin% 90 70000 Da nötr dekstran alımı olduğunu göstermektedir. İstatistiksel analiz için, her flüorofor için bir yoğunluk eşik işlenmemiş canlı hücrelerin çoğunluğu (>% 99) eşiğinin altında sayılır şekilde kurulmuştur (Şekil 4 (c)). Verim hücre sayısına oranı olarak tanımlanmaktadır başarılı bir şekilde işlemden geçirilmiş hücrelerin toplam sayısı, ilgi konusu molekülleri yer kaplamaz. Şekil 4B, verimi büyük ölçüde moleküler bağlı olarak değişiklik göstermektedir değilağırlık veya elektrik ücretleri (> 0.1 P). Test edilen dekstran molekülleri% 70 daha büyük verimlilik ile sitozolüne teslim edildi. Buna ek olarak, Şekil 4D ardışık iletim başarıyla molekül anyonik ve aynı molekül ağırlığı (Mw = 3,000 Da), nötr dekstranlar ile% 56 arasında bir ikili molekül temin verimi ile gerçekleştirildiğini gösterir. Hücreler işleyebilir mevcut sistem daha önce bildirilen sistemi 18 daha yüksek verim ve çok moleküllü iletim verimliliği 10-kat ve bu iyileşme (sırasıyla, anyonik ve nötral dekstran% 82 ve% 70), tek bir molekül teslimat etkilemez.
Şekil 1. (A) mikroakışkan elektroporasyon sisteminin şematik bir (C olarak gösterilen) hücreleri için girişler oluşan moleküller (M1 ve M2 olarak da belirtilmektedir) ve bir gömme solutiyon (F olarak gösterilen), atalet odaklama gerçekleşir, iki düz kanal, elektrot ve bir çıkış 10 elektroporasyon odaları. bir 1 uM FITC çözeltisi ve bir yıkama solüsyonu (DPBS) ile giriş (B) Çözüm değişimi gösterir gösteri etken solüsyon olduğu eşit alt gözlerin tümünde diziler enjekte edilebilir. Görüntü kontrast look-up tablosu (LUT) ayarlayarak tarafından geliştirilmiştir. Ölçek çubukları 250 mikron. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. 10 pozitif (+) ve negatif elektrotlar, beş oluşan kısa darbeli yüksek voltaj uygulama için kullanılan 15 kutuplu bir elektrodun bir fotoğrafı, (-). Her bir pozitif elektrodun bir negatif elektrottan 2 mm aralıklarla yerleştirilmiş, ve E,Aynı polarite ach elektrot 1.35 mm aralıklı edilir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Deney düzeneğinin şematik, (A) akışkan kontrol birimi (B) mikroakışkan Electroporator ve (C), elektrik ekipman kapsayan. Molekülleri, hücre ve temiz bir tampon ihtiva eden çözeltiler (A), tek tek şişeler basınçlıdır LabView kontrollü pnömatik akış sistemini kullanarak talep üzerine. Basınçlı şişe den olan solüsyon. Yüklü bir çek valf PEEK boru içinden mikroakışkan elektroporatörü içine enjekte edilir (B) ve (C) elektrik sinyalleri, f ile temas halinde 15 iğneli elektrotlar gönderilirelektroporasyon aşaması sırasında mikro-akışkan sisteminde iyice silinir çözelti. Programlanmış süresi ile elektrik darbeleri sinyal oluşturucu ve elektrik akımının büyüklüğünü yüksek voltaj amplifikatörü 100 V için yükseltilir kullanılarak üretilir. Tüm uygulanan elektriksel parametreler bir osiloskop kullanarak gerçek zamanlı olarak takip edilmektedir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Temsilcisi veri akış sitometri. (A) başarıyla kontrol meslektaşı ile karşılaştırıldığında, 70.000 Da anyonik dekstran molekülü aldı MDA-MB-231 hücrelerinin Floresan sinyalleri. (B) verimlilikleri her transfer dekstran molekül için bağlı moleküler önemli göstermezlerdeğişimi (p> 0.1). (C), elektroporasyon (kontrol) ile muamele görmemiş hücrelere göre profil, Örnek sitometri akışı. Başarılı moleküler teslimat gösteren floresan eşik kontrol örneklerinden sinyalleri eşiğinin altında bulunmaktadır, öyle ki veriler ayarlanır. Ardışık elektroporate edilmiş hücrelerde için veri sitometrisi (D) Örnek akışı. Sağ taraftaki çizim ve floresan görüntü çizgi sitometri akışı, yeşil, kırmızı ve sarı kutu sırası ile, 3000 Da-dekstran, nötr, sadece anyonik dekstran ve her ikisi de sadece dekstran molekülleri iken aşırı hücrelerinden floresan sinyalleri temsil eder. Ölçek çubuğu 100 m. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verim ve çoklu teslimat molekül verimlilikte yeni paralelleştirilmiş elektroporasyon platformu 10 kat geliştirilmesi ile, daha önce geliştirilmiş tek odacıklı sistem sağladığı tüm yararları ek olarak elde edildi. 18 Daha önce hazır yararları: (i) ön-arıtılması canlılık geliştirme için üniform bir boyut dağılımı, (ii) tam bir dozaj ve ayrı ayrı moleküler kontrol ve (iii) düşük işletme elektrik akımı ile hedef hücrelere. Bu molekül ağırlıkları, konjuge florofor türleri ve bir elektrik yükü geniş kolayca elde edilebilir, çünkü, floresanla işaretlenmiş dekstranlar, ilgi konusu moleküllere olarak seçilmiştir. Bu makro-moleküller. Floresan dekstran, kuluçka süresi 24 optimum konsantrasyonu onlar doğal olarak yaşayan hücrelerin için geçirimsiz membran ve sitotoksisite sergilemek değil çünkü böyle bir çalışma için iyi bir aday ve elektriksel parametreler mevcut sistem önceki t tespit edildielektroporasyon deneyler o. Optimizasyon süreci nedeniyle gerçek zamanlı moleküler alım sürecini izlemek üzere platformun yeteneği oldukça basit ve etkili oldu. Bu sürecin Görselleştirme az-hayır elektroporasyon parametreleri bilgisine sahip bir molekül veya hücre tipi test ediliyor ise çok faydalıdır. Test edilen tüm moleküller için inkübasyon süresi başarılı moleküler teslimat tamamlandığını gösteren, 10 odaları içinde sıkışıp hücreler, gerçek zamanlı olarak tespit edilebilir sinyal floresan yoğunluğu sergileyen 100 s olarak ayarlandı. Bu moleküler teslimat için gerekli asgari kuluçka süresi olduğunu unutmayın.
O sadece difüzyon 4,19,25 veya elektroforez aracılı olup olmadığını, elektroporasyon kullanarak moleküler teslim sürecine ilişkin uzun soluklu bir tartışma olmuştur. Moleküler teslimat baskın mekanizmasının 26 Kimlik karşılaştırarak, zahmetli bireysel testlerin bir dizi içerir tO moleküler boyutlarda, elektrik ücretleri ve elektroporasyon parametrelere bağlı olarak belirsizdir. Yazarların bilgimize için, bu zahmetli optimizasyon süreçleri geleneksel elektroporasyon sistemleri ile bildirilmemiştir. 4,26-28 geliştirilen sistemin basit bir parametre optimizasyon yeteneği elektroporasyon verimliliği inceleyerek değişikliklerden, baskın moleküler dağıtım mekanizmasının belirlenmesi için izin Moleküler ve elektrik parametrelerine bağlı olarak. Sonuçlar anyonik 3.000 Da dekstran verimliliği gözlenen moleküler alım muhtemelen difüzyon aracılık olduğunu düşündüren, onun nötr meslektaşı (sırasıyla 83 ve% 75) önemli ölçüde daha farklı olmadığını göstermiştir. Diğer elektroporasyon sistemlerin aksine, işlenmiş hücrelerin sürekli olarak bu sistemde elektroporasyon işlemi boyunca ajite edilmiştir. Yörüngedeki hücrelerin floresan sinyalleri kademeli artış olduğunu yayılmasını düşündüren domina olurdu gözlendint dağıtım mekanizması. Nötr 70,000 Da dekstran molekülleri yüksek verim moleküler alımı (% 90) daha fazla, hatta yüksek molekül ağırlıklarında teslim işlemi difüzyon sonucu ortaya çıktığını göstermektedir. Son olarak, 3000 Da anyonik ve nötral dekstran moleküllerin başarılı sıralı teslim moleküler teslim molekülleri ücret rağmen meydana iddiasını katılaşır. Bu sonuç aynı zamanda membran mühürleme Elektroporasyonun 3 dakika (moleküler doğum başına 100 sn) içinde tamamlanması olmadığını göstermektedir.
Sunulan moleküler dağıtım platformu sırayla bakılmaksızın elektrik yüklerinin moleküler boyutlarda geniş aralıkları sunabilirsiniz. Zamanında ince ayar ve bireysel parametrelerin değiştirilmesi gerçek zamanlı çalışma izleme yeteneği ile destekli az çaba ile elde edilebilir. Bu sistem özellikle esaslı hücre saflaştırma işlemi laboratuarda örnek hazırlama ve zaman alıcı bir santrifüj öncesi ve sonrası elektroporasyon için olan ihtiyacı ortadan kaldırıradım. Ayrıca, sistemin düşük işletme akımı önemli ölçüde hücre ölümlerini azaltmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Rowland Yeni Fellow programı tarafından desteklenmektedir. Chris Stokes özel yapılmış, bilgisayar destekli basınç kontrolü kurulumu, Ph.D. Diane Schaak, gelişmesinde yaptığı yardım için: Yazarlar Harvard'da Rowland Enstitüsü bilim adamları ve personel için minnettarlığını ifade etmek istiyorum biyolojik numune taşıma için onun girişi için, Winfield Tepesi için elektrik kurulumu, Ph.D. Alavaro Sanchez, gelişmekte Basınç kurulumu için gerekli mekanik tesisat bileşenleri işlemek için sitometrede akış, Scott Bevis, Kenny Spencer ve Don Rogers erişim verilmesi için. Mikroakışkan ustaları Harvard Üniversitesi'nde Nano Sistemleri Merkezi (MSS) de imal edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| High-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| Oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 ml centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
