Summary
대뇌 피질의 네트워크는 억제의 interneurons의 작지만 다양한 설정에 의해 제어된다. 의 interneurons의 기능 조사 그러므로 표적으로 기록하고 엄격한 확인이 필요합니다. 세포 내 라벨, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 신경 세포의 단일 또는 시냅스 결합 쌍에서 전체 셀 녹음을 포함하는 통합 접근 방식은 여기에 설명한다.
Abstract
GABA 성 억제의 interneurons은 뇌의 신경 회로 내에서 중심 역할을한다. 의 interneurons는 신경 세포의 인구 (10 ~ 20 %)의 작은 부분 집합을 포함하지만, 자신의 다양한 기능을 반영, 생리 학적 및 신경 화학적 이질성의 높은 수준을 보여줍니다. 따라서,의 interneurons의 조사가 중요한 조직 원리에 대한 통찰력과 신경 회로의 기능을 제공합니다. 그러나, 이것은 개별 interneuron 종류의 선택 및 식별을위한 통합 및 해부학 적 생리 학적 접근을 요구한다. interneuron 특정 마커의 발기인에서 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 동물의 급성 뇌 조각에서 기록 전체 세포 패치 클램프, 대상 및 electrophysiologically 특정 interneuron 유형의 고유 및 시냅스 속성을 특성화 할 수있는 효율적인 방법을 제공한다. 세포 내 색소 표지와 결합이 방법은 사후 MO로 확장 될 수있다rphological 및 면역 조직 화학적 분석, 기록 된 신경 세포의 체계적인 식별을 가능하게한다. 이러한 방법은 피질 뉴런의 다양한 유형의 기능성에 관한 과학적인 문제의 넓은 범위에 맞게 맞춤화 될 수있다.
Introduction
해마 신경 회로 긴 인해 인간 및 설치류 모두에서 학습 및 기억에 중요한 역할뿐만 아니라 공간적 내비게이션으로 해부학 및 생리학, 모두에 대하여, 강한 조사의 대상이되어왔다. 마찬가지로, 해마의 눈에 띄는하지만, 간단한 층류 조직이 지역 대뇌 피질 네트워크의 구조 및 기능적 특성을 다루는 연구가 선호 될 수 있습니다.
해마 회로는 흥분성 주요 세포 (> 80 %)와 작은 (10 ~ 20 %) 만 억제의 interneurons 1-3의 매우 다양한 집단으로 구성되어있다. 의 interneurons 빠른 이온 성 GABA 수용체에 역할을 자신의 축삭 터미널에서 γ-아미노 낙산 (GABA) (GABA 루피) 느린 대사 GABA의 B 수용체 (GABA B의 R을) 발표 4. 이러한 억제 자극 메커니즘을 상쇄하고 주체 세포의 흥분성을 조절하고, 따라서적외선 타이밍과 방전의 패턴입니다. 그러나,의 interneurons에서 방출 GABA는 주요 세포뿐만 아니라, 자신의 interneurons 5,6에뿐만 아니라 역할을합니다. 사전 및 시냅스 후 수용체는 interneuron의 여러 유형 중 피드백 규제와 억제 상호 작용을 중재. interneuron 네트워크에서 선택된 억제 메커니즘은 다른 주파수 7에 특히 진동의 발생 및 인구 활동 패턴의 형성에 중심이 될 것으로 믿어진다.
전체 세포 패치 - 클램프 녹음은 고유 특성과 신경 세포의 시냅스 상호 작용의 시험에 대한 잘 확립 된 방법이다. 그러나, interneuron 유형의 높은 다양성으로 인해, 억제의 interneurons의 조사가 기록 된 세포의 엄격한 확인이 필요합니다. 해마 interneuron 유형은 별개의 형태 학적 특징 및 신경 화학적 마커의 발현, 결합 해부학 적 및 면역 조직 화학적 전자에 의해 특징으로xamination 정확한 interneuron 6,8,9 아이덴티티를 결정하는 수단을 제공 할 수있다.
본 논문에서는 느린 GABA B의 특성을 허용 단일 신경 세포 나 시냅스 결합 쌍에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음이 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 한 후, 세포 내 라벨과 결합 된 실험적인 접근 방식을 설명 수용체가 확인의 interneurons의 억제 효과를 중재. 예로서, 우리는 시냅스 대상 소마 근위 수지상 innervates 및 "빠른 스파이크"(FS)에 의해 특징된다 interneuron의 하나의 주요 유형, 소위 "바구니 세포"(BC)의 서브 세트, 초점 칼슘 결합 단백질 parvalbumin (PV) 10, 11의 패턴 밀도가 세포체 층을 포함 축삭, 표현을 방전 시키십시오. 이들의 interneurons 큰 시냅스 억제 전류뿐만 아니라, 눈에 띄는 사전을 표시GABA B R 활성화 (12)에 응답하여 자신의 시냅스 출력의 시냅스 변조. 여기에 설명 된 기술들의 조합이 다른 식별 된 신경 세포 유형의 다양한 극한 또는 시냅스 메카니즘을 조사하기 위해 동일하게 잘 적용될 수있다.
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Protocol
윤리 정책 : 모든 절차와 동물 유지 관리 기관 지침에 따라 수행되었다, 독일어 동물 복지법, 유럽 이사회 (European Council) 동물의 보호에 관한 지침 609분의 86 / EEC 및 지방 자치 단체 (베를린, T-0215 / 11에서 가이드 라인 )
급성 - 해마 조각의 1 준비
- 대뇌 피질의 억제의 interneurons 13의 대부분을 레이블 vGAT 프로모터, 아래의 형광 비너스 / YFP의 단백질을 발현, (17-24일 이전) 형질 전환 쥐를 가져 가라. 쥐의 목을 벨. 신속 carbogenated, semifrozen (95 %, O2 / 5 % CO 2) 자당 기반 인공 뇌척수액 (자당 ACSF, 그림 1A)로 뇌 (<40 초)을 해부하다.
- , 램프 및 515 방출 필터를 LED 고글의 쌍에 장착 nm의 505 비너스 / YFP 형광에 대한 해부 쥐의 뇌를 평가합니다.
- 피질과 cereb의 정면 셋째 제거ellum; 모든 메스, 반구를 구분합니다. 이전 14 설명한 바와 같이, 뇌를 붙 평평한 표면을 제공하기 위해 피질의 등 표면을 제거합니다.
- vibratome에 해마 형성의 횡단면 (300 μm의) 잘라 반구가 semifrozen로 묶어야한다, 자당 ACSF (그림 1B) 14 carbogenated. 주동이 피질, 중뇌 및 뇌간의 추가 영역을 제거합니다. carbogenated 35 ºC에 가온 자당 ACSF를 포함하는 잠긴 유지 챔버에 각각의 조각을 전송합니다.
- 따뜻하게 ACSF를 입력 마지막 조각의 시간에서 30 분 동안 35 ºC에서 복구하기 위해 조각을 둡니다. 신진 대사를 활성화하고 잘라 신경 세포 프로세스의 재 밀봉을 용이하게하기 위해이 작업을 수행합니다. 그런 다음 저장 (그림 1C) 실온에 전송할 수 있습니다.
2 제작 및 녹음 피펫의 충전
- 푸(세포 내 라벨링) 0.1 % biocytin를 포함하는 세포 내 솔루션 : 여과 가득 때 2-4 MΩ의 피펫 저항이 달성 될 수 있도록 유리 모세관에서 LL 패치 피펫 (0.2 μm의 주사기 필터, 기공 크기). 그 성분의 저하를 방지하기 위해 얼음에 냉장 세포 내 솔루션을 유지합니다.
- 농도 (; 솔루션 목록을 보려면 E R (의 Cl-) = -61 MV) - 생리 학적 관련성이 낮은 염소를 포함하는 용액과 시냅스 후 전류의 식별을 위해 패치 피펫을 채 웁니다.
- 농도 (E R (의 Cl-) = - 쌍 녹음 시냅스 수용체 매개 반응을 확인하기 위해, 저 칼슘 버퍼 시냅스 송신기 릴리스와의 간섭을 방지하기 위해 용량뿐만 아니라 4 배 높은 염소를 같은과 세포 내 용액으로 패치 피펫을 채울 -20 MV)는 신호대 약리 RESP의 정확한 평가를 가능 관측 IPSCs 5 점을 개선하기 위해onsiveness. 농도 IPSC 동역학 (15)을 변경할 수 있습니다 - 염소를 변경하는 것이 있습니다.
FS-INS에서 3 전 세포 패치 클램프 녹음
- ACSF을 Carbogenate하고 (또한 흡입 라인,도 2a를 통해 기록 챔버로부터 제거 ACSF) 연동 펌프를 이용하여, 상기 기록 챔버로 관류 시스템을 통해 피드. 기록에 대비하여 설정에 대한 모든 장비의 전원을 켭니다.
- 기록 챔버에 슬라이스를 전송하고 실크의 단일 섬유와 중독 백금 반지와 장소에서 개최합니다. CA1의 지층 (STR). pyramidale 모두 STR 2 피펫으로 액세스 할 수 있도록 시야를 통해 수직으로 실행되도록 슬라이스를 배치합니다. radiatum 및 STR. oriens 동시에 (그림 2C 및 4A).
- (32 ~ 34 ° C) 기록을 설정으로 챔버를 놓고 carbogenated의 관류를 시작하고 따뜻하게50-10 ㎖ / 분의 유속으로 CSF.
- 40X 대물 배율 IR-DIC 광학 아래 슬라이스 품질을 평가하고, 디스플레이 상에 보여 CCD 카메라로 시각화. 라운드 적당히 대조 CA1 피라미드 세포 (CA1의 PC)의 다수 STR에서 알 수 있으면 좋은 슬라이스 품질을 가정한다. 부드럽고 가볍게 크레이터 표면 (그림 2C) 아래 20 ~ 30 μm의 깊이에서 pyramidale. 품질이 낮은 조각은 고르지 슬라이스 표면과 매우 대조, 수축 또는 팽창 세포의 큰 숫자를 포함합니다.
- 또는 STR 근처 큰 다극 세포체와 비너스 / YFP (그림 2B)를 표현하는 것과 같은 표면 형광 조명 아래 추정 FS의의 interneurons을 확인합니다. pyramidale. 합리적으로 깊은 순서대로 조각 (50 ~ 100 μm의 그림 2C) 내에서 셀을 선택 더 나은 자신의 형태 무결성을 유지합니다.
- headstage에 피펫 홀더에 기록 전극을 장착; 다음 응용 프로그램LY 튜브 라인을 통해, 낮은 정압 (20 ~ 30 밀리바). 조각의 표면에 피펫을 내리고, 약간 선택된 뉴런의 중심 오프셋.
- 이전에 (14, 16)을 설명하고 또한 2D 및 2E 피규어 참조로 전체 셀 녹음 구성을 얻습니다
- 셀을 대상 : 70 ~ 80 밀리바에 압력을 높이 빠르게 단지 선택된 셀 (그림 2 차원, 3 위)의 소마 위 슬라이스를 통해 피펫을 낮 춥니 다.
- 셀을 접근 : (위, 그림 2D) 그것에 "딤플"를 생산하는 세포막에 피펫을 누릅니다. 이웃하는 셀들의 biocytin 라벨링을 방지하기 위하여,이 단계를 신속하게 수행한다.
- 기가 옴 씰을 만들기 : 피펫에 20mV의 전압 명령을 적용 동시에 압력을 해제합니다. 기가 옴 씰 (1-50 GΩ, 그림 2D, 아래쪽 및 그림 2E 가운데) typic동맹은 신속하게 개발하고 있습니다. 일단 전압 지령으로 전위 예상 쉬고 막 (전형적으로 -70과 -60 MV)를 적용, 밀봉.
- 패치 돌파 : 밀봉 일단 부압의 짧은 펄스와 멤브레인 패치 파열; 따라서 전체 셀 구성 (도 2E, 아래) 달성.
- 전체 - 세포의 커패시턴스 및 직렬 저항 (R의 S)를 보상. R의 120 분까지 정상적으로 5 ~ 20 MΩ하고 안정적이다. 돌파구에 막 전위 (V M)가 -50 MV보다 비극성 화되면 세포를 포기; R S는 30 MΩ보다 초기에 큰; 기록에 걸쳐 20 % 이상 또는 R S 변화.
- (250 pA의 그림 2 층 맨 -250)에 전류 펄스를 탈분극하는 하이퍼의 가족 (전류 클램프 모드에서) 자신의 반응에 의해 FS 기능을 확인합니다. FS 기능은 상대적으로 V M을 (일반적으로 -50 t 분극이있다오 -60 MV), 짧은 막 시정 (<20 밀리 초) 및 주파수에서 활동 전위의 기차 (APS)와 전류 주입을 탈분극 500 pA의 응답> 100 Hz에서 11 (그림 2 층 바닥), 현저하게되는 CA1의 PC (그림 2 층 중앙)에서와는 다른.
(4) 세포 외 전기 자극 GABA B R 매개 응답을 연상
- STR의 경계에 슬라이스에서 :; 시냅스 유발 반응을 관찰하기 위해 세포 외 자극 전극 (0.1 ~ 0.3 MΩ 저항이 M NaCl로 가득 패치 피펫)을 배치합니다. radiatum 및 STR. lacunosum-moleculare은. 자극 아티팩트 (그림 3A)을 세포에 직접 전기 자극을 방지하고 최소화하기 위해 소마에 전극 200 ~ 300 μm의 측면을 배치합니다.
- 자극 전극을 배치하면, 전체의 셀의 기록을 구하는선택한 셀은 3.9 절 (그림 3B)에서와 같이 전류 클램프 모드에서 생리 학적 표현형을 평가합니다.
- 전압 클램프 (V의 M -65 MV)에 기록 된 신경 세포와 함께,에서 시냅스 축삭의 전기 자극을 제공하는 50 V (~ 500 μA 효과적인 자극) 절연 정전압 자극기를 사용하여 20 초마다. 하나의 자극을 사용하여 (100 마이크로 초 기간, 그림 3C, 상단)은 GABA B 형 R 매개 IPSCs을 관찰하고, 큰 송신기 릴리스를 생산하는 (200 Hz에서) 여러 자극의 기차와 인터리브.
- 고립 monosynaptic IPSC (중앙 상단 그림 3C)를 공개 :; 목욕은 이온 성 글루타메이트 수용체 길항제 (D-AP5 [50 μM] NMDA 수용체 DNQX [10 μM] AMPA 수용체)을 적용한다. 또한 GABA R 차단제의 응용 프로그램과 함께 GABA B R 매개 IPSC를 분리 (gabazine [10 μM] 그림 3C 중간 리터된 ower).
- GABA B 이후의 응용 프로그램 CGP-55845 [5 μM] (그림 3C 낮은 회색이 밑에)에 의해 R이 매개되는 등의 결과 천천히 바깥쪽으로 전류 (확장 그림 3C 낮은를) 확인
FS-IN 및 CA1 PC를 결합 시냅스의 5 페어 녹음
- 아래에 설명 된대로 시냅스 결합 IN과 PC 쌍 사이에 수행 동시 녹음과 억제 성 시냅스 전달의 GABA B R 매개 시냅스 컨트롤을 평가합니다.
- 먼저, (섹션 3에서와 같이) 시냅스 interneuron의 전 세포 기록을 설정하고 FS 표현형 (도 4a)를 확인한다.
- 그런 다음 이웃 CA1 PC (20 ~ 100 μm의 거리, 그림 4A)를 패치와 AP를 유도하기 위해 (전류 클램프 모드에서 개최) 시냅스 IN에 전류 펄스 (1 밀리 초 기간, 1-5 nA의 진폭을) 탈분극 간단한 초과 임계를 적용합니다. 시냅스의 공동 경우nnection은 전압 클램프에서 개최 된 CA1 PC에서 IPSCs에서 IN 결과에서 AP를 (약 80 % R의 S 보상) 존재한다.
- 필요한 경우 연결이 발견 될 때까지, 상기 컴퓨터 & CA1로부터 새로운 기록 전극과 기록을 채운다.
- 연결이 설정되면, 단일 시냅스 응답과 동적 거동을 모두 평가하기 위해 시냅스 FS-IN에서의 AP 쌍을 유도. 50 밀리 초 간격 (그림 4B)와 2 바꿀만한 자극의 전형적인 쌍 펄스 프로토콜을 사용합니다.
- 기준 조건에서 제어 흔적을 수집합니다. 그런 다음, 따라서 완전히 수용체 매개 효과를 차단하려면 길항제 CGP-55845 (5 μM) 다음 GABA B의 R을, 활성화, 관류 ACSF에 선택적 GABA의 B R 작용제 바클로 펜 (10 μM)을 적용한다. 각 약물의 조건 (그림 (b) 및 C)의 정상 상태시 ~ 50 트레이스를 수집합니다.
- 기록이 완료되면, 찍으 형성함으로써 신체 멤브레인을 밀봉전자 아웃 패치 : 천천히 V-클램프에 세포체에서 피펫을 철회하고 R의 S가 증가함에 따라, MV -40 V의 M을 줄일 수 있습니다. 외부 아웃 패치의 형성을 촉진하기 위해이 작업을 수행; 다음 화장실에서 피펫을 제거합니다.
전기 생리 특성의 6 분석
- 참고 : 다른 소프트웨어 패키지의 무리가 전기 생리 데이터의 취득에 사용할 수 있습니다. 여기서, WinWCP는 자유 스트래스 전기 생리학 소프트웨어 패키지에서 윈도우 프로그램은 최대 16 개의 아날로그 입력 채널에 기록 된 디지털 신호 (10)의 출력을 허용하는 데 사용된다.
- 로우 패스 필터 20 kHz에서 모든 5-10 kHz에서 데이터 및 샘플.
- 오프라인 분석 제품군을 생리 학적 데이터를 분석 할 수 있습니다.
참고 : Stimfit,이 경우에 사용되는 파이썬 쉘을 포함하는 오픈 소스 소프트웨어 패키지; 그러나, 다른 대안을 용이 대신 사용될 수있다.- 수동 막 페이지 분석기록 뉴런의 roperties, 막 전위를 휴식에서, 현재의 클램프에 인수했다.
- 기록의 시작에서 기록 된 반응의 기준선 평균 쉬고 막 전위를 측정한다.
- 작은 과분극 전류 펄스 (≤ -50 PA)에 전압 응답에서, 옴의 법칙을 사용하여 입력 저항을 계산합니다. 잡음 비율, 평균 경로가 여러 개에 신호를 향상시킬 수 있습니다. 참고 : 우리의 예는 일반적으로 10 ~ 50 개인 스윕의 평균입니다.
- 과분극 작은 전류 펄스에 응답하여 감쇠 곡선을 단지 수 피팅에 의해 일정한 겉보기 막 시간을 추정한다.
- 임계 값, 진폭 (임계 피크) 및 기간 (반 높이에서 측정 폭) 전류 펄스를 탈분극 임계 수준에 의해 유발을 결정하는 활동 전위 파형을 분석 할 수 있습니다.
- GABA B R에게 전압 클램프 녹음에서 매개 IPSCs을 분석합니다. 필터에서 오프라인을 추적500 Hz에서 (가우시안 필터) 및 (적어도 10 트레이스의 평균)의 GABA B의 R 매개 반응의 피크 진폭과 지연 시간을 평가한다.
- 피크와 앞의베이스 라인 사이에서 측정 GABA R-매개 IPSCs의 피크 진폭의 변화와 같은 기능의 억제 출력에 GABA B의 루피의 효과를 감지합니다. 제어주기 및 모든 약물 시대의 정상 상태에 대한 ≥50 흔적에서 평균 진폭을 계산합니다.
7 시각화 및 면역 세포 화학 FS-기능
- 녹화 후, 4 ℃에서 0.1 M 인산염 완충액 (PB, 산도 = 7.35) O / N로 4 % 파라 포름 알데히드에 담가 조각을 수정.
- 필요한 조각을 처리하기 전에 최대 1 ~까지 일주일 동안 PB로 전송 및 저장 할 수 있습니다.
- 자유롭게 신선한 PB 및 이후 0.9 %의 NaCl 0.025 M PB 씻으 조각 (PBS, pH가 7.35).
- FO 조각을 차단, 비특이적 결합 항체를 줄이기 위해10 % 정상 염소 혈청 (NGS), 0.3 % 트리톤-X100 PBS에서 만든 NaN이 3, 및 0.05 % (막 Permeabilize 하시려면하는 세정제)를 함유하는 용액에 RT에서 R 1 시간.
- PBS에 NaN이 세 5 % NGS, 0.3 % 트리톤 - X100, 0.05 %를 함유 용액에 희석 방지 PV 단일 클론 마우스 항체를 사용, 태양 광 표현에 레이블을 지정하려면. 4 ° C (12) 2-3 일 동안 일차 항체를 품어. 철저하게 PBS에서 조각을 씻어.
- 형광 항 마우스 이차 항체를 적용 (예 : Alexafluor-546.) 바이오틴 결합 단백질 스트렙 타비 딘과 함께, 형광 색소에 결합 (예를 들어, Alexafluor-647); 및 PBS에 희석 NaN의 3 3 % NGS, 0.1 % 트리톤 - X100, 0.05 %를 함유 한 용액에서 배양하고 4 ° C에서 O / N을 품어.
- 대충 2-3 PB에 린스가 PBS에 따라 2 ~ 3 배 조각을 씻어. 유리 슬라이드에 슬라이스를 마운트합니다. 붕괴 슬라이스를 방지하기 위해 300 μm의 한천 스페이서를 사용합니다. fluores와 커버 슬립 조각네일 바니쉬 %를 장착 매체와 인감.
8 이미징 및 시각화의 재건 FS-기능
- 적절한 레이저 라인 (다이오드 레이저 Alexafluor-647에 대한 635 nm의 흥분 fluorochome 기자와 함께, 주사 공 초점 현미경을 사용하여 조각을 시각화, 금성 Alexafluor-546 PV에 대한 표시와 아르곤 488 또는 515 nm의 헬륨 - 네온 543 nm의 / YFP).
- 전체 셀의 Z-스택을 생산하는 (20X 목표를 사용하여, 일반적으로 0.5 μm의 단계) 적절한 Z-해상도에서 이미지를 가져 가라. 다중 스택은 일반적으로 이미지에 디지털 피지 / ImageJ에 소프트웨어 (그림 5A)를 사용하여 오프라인 스티치 할 수있는 전체 셀을해야합니다.
- 반자동 추적 방법을 사용하여 스티치 이미지 스택에서 셀을 재구성 (피지 / ImageJ에 소프트웨어 패키지 17 단순 돌기의 추적기 플러그인을 그림 C).
- 마지막으로, I의 PV-면역 반응성을 평가높은 개구 수 대물 렌즈 nterneuron (60X 규소 침지, NA = 1.3). PV의 체세포 세척이 너무 강한 경우 소마의 이미지, 근위 수상 돌기 근위 축삭, 또는 대안 축삭 터미널을 확인합니다. 면역 라벨이 biocytin 표지 구조 (그림 5B)에 부합하는 것으로하면 세포는 태양 광 발전에 대한 면역 간주됩니다.
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Representative Results
제공되는 슬라이스 품질이 모두 CA1 PC와 FS 인 최소한의 어려움을 달성 할 수에서 기록, 상당히 좋은 것입니다. vGAT 발기인 13에서 비너스 / YFP을 표현 형질 전환 쥐 라인은 명백하게 FS-INS, 또는 실제로 수익 증권을 식별하지 않습니다. 그러나 및 STR 주변 기능에서 녹음. pyramidale, FS 인의 농도는 일반적으로 높은 일이고, FS 기능 (도 2B)를 선택할 확률이 높은 결과. FS - 인 CA1 PC 및 RS 기능 모두에 대하여 다른 특성들은 생리적 특성에 의해 구별 될 수있다. 그들은 상대적으로 분극이 휴식 잠재적 인 멤브레인 (-58.9 ± 1.5 MV, 15 세포, 대 CA1의 PC 26 세포에서 -62.6 ± 1.1 MV), 낮은 입력 저항을 (92 ± 12 MΩ 대 103의 PC에서 ± 14 MΩ) 빠른 명백 막 시상수 (15.4 ± 2.6 대 밀리의 PC에서 22.0 ± 2.7 밀리 초), resul순간 전압 응답 팅은 전류 펄스 (그림 2 층)를 과분극합니다. FS - 인 (진폭 22.6 ± 2.9 MV를 의미) 매우 눈에 띄는 빠른 afterhyperpolarization 다음에 상대적으로 낮은 진폭 (82.8 ± 1.0 MV)의 아주 짧은 활동 전위 (0.38 ± 0.01 밀리 초)을 배출된다. (: 왼쪽 그림 2D; 34-128 Hz에서 범위 82 ± 10 Hz에서) 큰 탈분극 전류 펄스 (250 PA)에 대응하여, FS-INS는 높은 주파수에서졌습니다.
FS-INS에서 GABA B 형 R 매개 시냅스 후 전류를 평가하기 위해, 약리학 고립 시냅스 응답은 STR에서 억제 섬유의 세포 외 자극에 의해 유발되었다. radiatum / lacunosum-moleculare 테두리.도 3은 화합물 시냅스 반응 성분의 순차 봉쇄 monosynaptic GABA B의 R-매개 느린 IPSC를 분리하는 FS-IN의 예를 나타낸다. 시냅틱 응답은 일라이이었다하나의 자극 또는 STR에 (200 Hz에서 전달 50 V 강도, 0.1 밀리 초 시간) 3-5 자극의 열차에 의해 인용. lacunosum-moleculare / radiatum 테두리 (그림 3A). 흥분성과 억제 두 구성 요소 (그림 3C, 위)을 포함하여 초기 화합물 응답은 강하게 (그림 3C, 중 각각 DNQX, 10 μM 및 AP-5, 50 μM) AMPA 및 NMDA 수용체 길항제 목욕 응용 프로그램에 의해 감소되었다. (-이 실험에서 약 -60 MV의 반전 가능성, 유지 가능성 -65 MV에서 매개 현재 추정 안쪽으로 염소를) 및 현재의 느린 바깥쪽으로 (추정에 의해 매개 잔류 monosynaptic IPSC는 내향 전류 초기 빠른을 구성 K + 100 MV에 반전 가능성이 가까이와 전도). 선택적 GABA R 길항제 gabazine의 응용 프로그램 (SR-95531, 10 μM)를 떠나, 빠른 IPSC 폐지느린 GABA B R 매개 IPSC (그림 3C, 아래, 검은 색 추적을) 격리; 이는 자극의 짧은 열차에 응답하여보다 명확하게 하나의 자극에 대한 응답 관찰 되었으나. 그것은 강력하고 선택적 길항제 CGP-55845 (CGP, 5 μM, 그림 3C, 아래쪽, 회색 추적)에 의해 차단되었을 때이 응답은, GABA B 형 R 활성화 K + 전도도로 확인되었다. FS 수익 증권은 일반적으로 우리의 최근 간행물 12에 도시 된 바와 같은 큰 진폭의 GABA B의 R-매개 IPSCs을 보여준다.
FS가 된 GABA B의 루피에 의해 억제 출력 쌍 녹음이 시냅스 결합 FS-IN 및 CA1의 PC에서 수행 하였다 연접 규제를 평가합니다. 이전에 1,3 같이 FS의 수익 증권 CA1 PC의 사이의 시냅스 연결이 상대적으로 높다. 이전과 같이이 음반에서, 결합 확률은 밀접하게 위치하고 셀 쌍 (≤50 μm의 사이에 50 % 이상이다
녹음이 완료되자, 외부 아웃 패치가 성공적으로 형성 조각 밤새 고정 이후 시각화하고 분석 기록 된 세포의 형태를 자신의 신경 화학적 마커의 컨텐츠를 결정합니다. 그림 5A는 한 대표 FS BC의 형태를 설명하기 위해 처리 된 공 초점 현미경에 얻어진 합성 화상 스택 투영. PV의 셀의 표현은 세포체를 통해 일반 면역 신호와의 근위 수상 돌기를 준 면역 세포 화학 라벨에서 확인 된 기록 biocytin 라벨링 된 셀 (도 5b). 세포의 3 차원 재구성은 피지 소프트웨어 (그림 5C) 17의 간단한 돌기의 추적기 플러그인을 사용하여 스티치 이미지 스택에서 수행 하였다. 축삭 및 STR 담보 근처의 높은 밀도를 보였다. pyramidale와 &# 8220; 추정되는 BC로이 세포를 식별, CA1의 PC (그림 5A, 삽입)의 세포체 주위에 형성 바구니 ". 또한, 소마의 현지화 근처 str을합니다. pyramidale 및 CA1의 모든 계층에 걸쳐 방사상 중심의 수상 돌기는 FS 수익 증권 10의 전형적인 형태 학적 특징에 잘 대응한다.
요약하면, 확인 FS의 PV + 수익 증권에서 얻은 전체 셀 녹음에, 우리는이 세포가 큰 진폭 GABA B 형 R 매개 느린 IPSCs을 표현하고 자신의 시냅스 출력도 크게 시냅스 GABA B 형 루피의 활성화에 의해 억제되는 것을 증명하고있다.
급성 해마 조각의 그림 1 준비. (A) 갓 해부 쥐의 뇌. 유지, 뇌를 둘러싸고있는 얼음을 참고0 ° C에 가까운 뇌 전체의 온도. (B) 라이카 VT1200s의 vibratome에 300 μm의 해마 조각 절단. 반구는 대뇌 피질의 표면이 첫번째 절단되도록 정렬됩니다. 반구와 뇌 조각을 절단 한 후 얼음 ACSF (화살표). (C)의 지속적인 carbogenation 주변 녹은 얼음의 많은 양의 참고 따뜻하게 자당 ACSF로 이동됩니다. 슬라이스 인계 만 해마 위에 놓여 피질을 떠나, 전뇌와 중뇌을 제거하는 손질 하였다.
도 2의 interneurons에서 전체 - 셀 패치 클램프 기록. (A) 기록 챔버 주위 구성. 유입과 유출이 층류에 가까운을 달성하기 위해 상기 챔버의 반대 측면에있는 주. 또한 볼 수 recordi 아르전극 겨, headstages에 장착하고 양측의 접지 전극들뿐만 아니라, 대물 중간에 (40X, 물 침지). (B) vGAT-금성 / YFP 신호의 저전력 epifluorescent 이미지에서 슬라이스에서 해마의 CA1. 같은 지역의 (C) IR-DIC 영상. B와 C에서 화살표는 세포체 층 금성 / YFP 긍정적 interneuron를 나타낸다. (D) 패널 B에 나타낸 신경 세포의 세포체의 고출력 IR-DIC 이미지에 딤플을 형성하는 다가 패치 피펫 시험 전압 만화 반응 녹화 전체 세포 패치 - 클램프 (좌측)을 확립하는 주요 단계 중 후속면 (위쪽)과, 전체의 셀 구성 (아래)의 셀. (E) 개략도 피펫 팁 (오른쪽)에서 저항을 모니터링 -pulse. 최고 행 : 멀리 세포에서 목욕 피펫; 상단 중앙 : 딤플 형성, 함께펄스 진폭의 감소, 적당한 저항 증가를 나타낸다. 낮은 중간 : 기가 옴 밀봉 형성. 전류 펄스 진폭이 크게 감소합니다. 단지 빠른 전류 용량은 피펫 커패시턴스 보상되기 전에 펄스의 시작과 끝에서 볼 수있다. 바닥 : 전체 - 세포의 기록은 구성 피펫 팁 아래 막 뚫고 패치에 의해 달성된다. 시작과 직렬 저항 보상 전에 펄스의 끝에서 크지 만 상대적으로 느린 용량 성 전류를 적용합니다. (F)을 하이퍼의 가족에 의해 유도 된 FS-IN (위)와 CA1 PC (아래)의 대표 흔적을, - 탈분극 전류 펄스 (프로토콜은 위 그림 참조). CA1의 PC의 훨씬 느린 소성 비교 FS-IN의 초고주파 방전을 참고. 오른쪽에 세트 : CA1 PC (위)과 (검정색 PC AP에 오버레이 바닥, 회색,) FS-IN에서 AP 파형의 비교, 디를 설명AP와 AHP의 파형 fference.
그림 3 약리 화합물 시냅스 응답의 해부, FS-IN 느린 GABA B 형 R 매개 IPSCs을 분리. STR의 경계에 배치 된 기록 전극 (패치)와 기록 챔버 내의 슬라이스의 (A) IR-DIC 이미지. oriens (오리.) 및 pyramidale (피리.)와 STR의 국경에서 시뮬레이션 전극 (STIM). radiatum (. 라드) 및 lacunosum-moleculare (LM) (B) 왼쪽 :. 기록 구성의 개략도. 오른쪽 : 하이퍼의 가족에 의해 유도 된 FS-IN에 겹쳐 전압 응답은 현재 주사를 탈분극하는 세포 외 자극에 대한 응답으로 FS-IN에서 기록 (C) 대표 흔적을.. 탑 : 화합물시냅스 응답은 하나의 자극 (50 V 강도, 0.1 밀리 초 지속 시간)에 의해 유도 된 정상 ACSF에서 생산. 상단 중앙 : DNQX (10 μM) 및 D-AP-5 (50 μM) 목욕 신청 후 monosynaptic IPSC입니다. 낮은 중간 : 빠른 monosynaptic IPSCs가 화장실에 gabazine의 추가 (10 μM) 다음과 같은 차단됩니다. 아래 : (200 Hz에서) 5 자극의 기차는 화장실에 CGP의 후속 응용 프로그램 (5 μM) (중첩 회색 추적)에 의해 차단 IPSC (블랙 추적) 매개 느린 GABA B 형 R을 보여준다.
의 억제 시냅스 전달의 시냅스 변조의 그림 4 분석 결합 FS-IN 및 CA1의 PC 쌍의 기록 짝. (A) 왼쪽 패널 :이 기록 피펫의 IR-DIC 이미지의 경계 <에 FS-IN에 패치를 왼쪽으로 한 EM> STR. oriens (오리.) 및 pyramidale (피리.) 가까이 STR에 CA1의 PC에 패치 오른쪽. radiatum (라드.). 오른쪽 패널 :. 기록 구성의 회로도, 전류 펄스의 가족 FS-IN (왼쪽)와 CA1 PC (오른쪽) 대표 전압 응답과 (B) 시냅스에 유도 AP를 보여주는 대표 흔적 FS를-IN (오른쪽 5 μM) (위) 및 제어 조건 하에서 CA1 PC에서 짧은 대기 시간 단위 IPSC (아래) (왼쪽 흔적), 바클로 펜의 목욕 응용 프로그램 (10 μM을, 가운데) 후와 CGP의 후속 응용 프로그램 . CGP는 IPSC 진폭의 거의 전체 복구 결과 반면 바클로 펜은 50 % ~에 의해 IPSC 진폭을 감소합니다. 제어 흔적은이 밑에 표시됩니다. IPSC 진폭의 (C) 시간 코스 플롯은 바클로 펜 및 CGP의 효과를 보여줍니다. IPSCs는 10 초 간격으로 기록되었다.
그림 5 시각화, 재건과 biocytin 표지 기록 FS-BC의 면역 조직 화학적 식별. (A) 공 초점 현미경에 20 배의 목적으로 이미지화 FS-IN의 이미지의 스티치 스택 투영합니다. 세포체는 STR의 경계에 위치한다. radiatum RAD (.) 및 pyramidale (피리.) CA1 영역 엑손의 대부분과 셀 바디 층의 주위에 발견되는 반면에, 돌기가 방사상으로 실행하고있는 모든 층에 걸쳐 중; 수익 증권에 일반적으로. 스케일 바 : 100 μm의. 주위 추정 CA1의 PC의 세포체 (오렌지 별표)을 형성 축삭의 일반적인 바구니를 보여주는 20 층의 높은 배율의 투영 : 인세, 오른쪽 상단. 스케일 바 :. 10 μm의 (B) IN의 biocytin 충전 전지 본체 (흰색 pseudocolour, 낮은 패널, 화살표) (녹색, 상부 패널) PV에 대한 면역 반응을 보여줍니다. 규모바 :. 셀의 3 차원 재구성 20 μm의 (C) 투사. 소마와 수상 돌기는 검은 색이며, 축삭은 붉은 색. CA1의 레이어는 파란색으로 묘사된다. 요약 : 오리, STR. oriens; STR, LM. lacunosum-moleculare. 스케일 바 : 100 μm의.
| 이름 | 구성 (MM) | 사용 | 참고 |
| 자당 - ACSF | 87 염화나트륨, 탄산 수소 나트륨, 1.25의 NaH 2 PO 4, 25 포도당, 자당 75, 7 MgCl2를, 0.5 염화칼슘이, 하나 나 피루 베이트, 한 나-아스 코르 빈산 2.5의 KCl, 25 | 준비 및 뇌 조각의 저장 | pH가 7.4; 삼투압 = ~ 350 mOsm |
| 기록 ACSF | 탄산 수소 나트륨, 1.25의 NaH 2 PO 4, 25 포도당, 하나를 MgCl 125의 NaCl, 2.5 KCl을, 25 | 뇌 조각에서 촬영 | pH가 7.4; 삼투압 = 310-315 mOsm |
| 세포 내 용액 (1) | 125 K-글루코 네이트, 10의 KCl, 10 HEPES, 10 EGTA,이 MgCl2를, 2 나-ATP, 0.3 나-GTP, 하나 나 - 크레아틴 인산 0.1 % biocytin | GABAB IPSC 녹음의 전극을 작성 | pH가 7.4; 삼투압 = 295-305 mOsm |
| 세포 내 용액 (2) | 105 K-글루코 네이트, 40의 KCl, 10 HEPES, 0.1 EGTA,이 MgCl2를, 2 나-ATP, 0.3 나-GTP, 하나 나 - 크레아틴 인산 0.1 % biocytin | 한 쌍의 녹음을 위해 전극을 작성 | pH가 7.4; 삼투압 = 295-305 mOsm |
| 인산염 완충액 (PB) | 100 밀리미터의 NaH 2 PO 4 | 고정 조각을 세척 | pH가 7.4 |
| 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) | 25 밀리미터의 NaH 2 PO 4 </ 서브>, 154 mM의 염화나트륨 (w 0.9 % / V) | 고정 조각 및 항체 배양을 세척 | pH가 7.4 |
| 파라 포름 알데히드 정착액 | 4 % w / 파라 포름 알데히드, 0.1 mM의 PB V | 뇌 조각의 고정 | pH가 7.4 |
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Discussion
우리는 기능적으로 시험 관내 및 morphologically- neurochemically 식별 된 신경 세포의 특성을 전기 생리 학적 및 해부학 적 기법을 결합하는 방법을 설명; 특히 대뇌 피질의 억제 기능의 다양한 종류. 절차의 주요 측면은 다음과 같습니다 잠재적 인 (1) 사전 선택; (2) 세포와 뉴런 기록 시각화; 그리고 마지막으로 (3) 기록 기능의 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석. 이러한 연구는 특히 PV 인을 해결 하였지만, 기재된 프로토콜은 최소한의 변형으로 또는 다른 어떤 interneuron 신경 유형에서 유사 레코딩에 사용될 수있다.
대뇌 피질의 영역에서의 interneurons의 상대적으로 낮은 수는 매우 비효율적이 세포에서 임의로 선택과 녹음을합니다. 발산 현지화 및 형태 학적 특징을 구분하고 정기적으로 일부 interneuron 유형에서 기록하는 연구자를 사용할 수있다. 인턴 그러나 조각에서, 식별및 세포체 층 근처 eurons는 FS 기능에서와 같이, 여전히 어렵다. 특정 interneuron 개체수 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스 라인의 출현은, 더 효율적이 이러한 뉴런의 예비 선택하고 기록하게 우아한 솔루션을 제공한다. 지금 많은 유전자 변형 라인, 주로 마우스,하지만 점점 또한 쥐 13의 interneurons의 조사를 용이하게 사용할 수 있습니다. 트랜스 제닉 라인을 사용하는 경우, 그러나, 범위 및 리포터 발현의 특이성을 확립하는 것이 필수적이다.
휴대 라벨 및 형태뿐만 아니라 전기 생리학 기록의 품질, 비판적 가능한 고품질의 조각에 따라 달라집니다; 하는 뇌는 신속하게 (이상적으로는 20 ~ 40 초)을 해부 매우 신중하고 지속적으로 냉장 처리 될 필요가있다. 우리는 찾아 그 전체 나트륨 농도와 신경 세포의 흥분성 따라서이 드라마 감소된다 자당 ACSF의 사용학적으로는 슬라이스와 interneuron의 생존 (18)의 품질을 향상시킵니다. 그러나, 많은 연구자들이 큰 효과 10,11,15에 슬라이스 준비를위한 표준 기록 ACSF의 사용을 한 것을 강조해야한다. 형태학 무결성 슬라이스 13 절단하는 각도에 크게 의존한다; 어떤 지역 및 세포 유형에 따라 다릅니다. 그러나 대부분의 interneurons 확실하게, 가로 관상 또는 시상 조각에서 기록 할 수 있습니다. 더 수상 돌기 및 축삭, 깊은 조직에서 세포가 IR-DIC 품질과 기가 옴 인감 형성의 신뢰성을 희생이라도 대상으로한다 퇴직을 최소화합니다. CA1 피라미드 세포 모두에서 이러한 상황의 기록에서 FS 인은 확실하게 얻을 수있다.
라벨과 뉴런의 시각화는 30 분 이상 지속되는 일반적인 레코딩 세션에 따라 이루어집니다. 기록이 30 분 미만 동안 지속하면 바이오 가능하도록 고정하기 전에이 시간을 허용 할 필요가있다cytin 완전 충전하고, 따라서 셀의 사후 시각화 보장 및 축색 돌기 말단 프로세스로 확산한다.
전체 셀 녹음에서 낮은 안정 시리즈 저항을 유지하는 것은 시냅스와 고유 특성의 정확한 생리 학적 측정뿐만 아니라, 신경 세포의 철저한 라벨에 필수적입니다. 그러나, 저 저항의 전극은 피펫 내에 포함 된 용액과 세포 내 세포질의 급속한 투석을 허용한다. ATP 용액으로 세포를 보충, 및 GTP 포스 포 확실히 에너지 공급과 기록 품질을 유지하는 데 도움. 그러나, 신경 화학 물질과 단백질의 투석은 감소 된 반응으로 이어질 가소성 (19)을 감소도 신경 화학적 식별을 방해 할 수 있습니다. 예를 들어 태양 광 발전은 지속적으로 더 이상 실험의 과정을 통해 신경 세포에서 세척한다. 따라서 말단 돌기 또는 축삭 프로세스의 검사를 dete해야 할 수 있습니다 기록 된 신경 세포의 rmine 면역. 투석은 관심사가 같은 경우, 세포 내 환경 (20)을 보존하기 위해 이용 될 수 천공 패치 구성을 사용하여 녹음 그러나 패치 레코딩의 끝 또는이어서 전체 셀 구성에서 "repatched"신경 많음해야 biocytin 작성을 허용합니다.
기록 된 신경 세포의 약리 조사 기능의 고유 및 시냅스 활동을 형성에 발산 neuromodulatory 메커니즘의 기능적인 중요성을 평가하는 유용한 방법입니다. 상술 한 방법에서, 약물 및 페어링 분리 녹음 각각 작성자 및 GABA 시냅스의 B R-매개 된 효과를 평가하기 위해 사용된다; 그러나 용이 한 예 카나비노이드 시스템 (21)에 대해, 다른 수용체 패밀리의 역할을 평가하기 위해 수용체 작용제 및 길항제의 조합을 변경할 수있다.
"> 조직 학적 및 기록 세포의 면역 세포 화학 처리는 프로토콜이 확립되고 나면. 여기에 기재된 면역 세포 화학 프로토콜 신경 화학적 콘텐츠를 식별하는 데 사용되는 항체의 조합에 대해서, 슬라이스 두께 및 요건 조정 된, 신뢰성이 높은 것이다. 우리는 정상 염소 혈청을 이용 사용 된 모든 이차 항체가 염소에서 발생하는 바와 같다. 대안으로서,이 차단제로서 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 분유를 사용하는 것도 가능하다.이 프로토콜은 항체 인큐베이션 인산염 완충 식염수 (PBS)를 사용된다는 사실을 주목해야한다 그러나 대안 하나는 단순히 PBS 대신에 0.1 M PB를 사용할 수있다. 세제의 비교적 높은 농도를 사용하여 (0.3 % 트리톤-100) 슬라이스의 제 100 μm의 표면층에 항체의 침투를 허용하면서, 외관상 항원 성을 감소하지 않는다 신경 세포가 일상적으로 깊은 세포를 기록합니다. 기록, 또는 조각이 두꺼운 곳, 그것은 resecti하는 것이 좋습니다슬라이스, 저온 유지 장치 또는 vibratome를 사용하고 얇은 (40 ~ 70 μm의) 섹션에 immunolabeling을 수행합니다. 300 μm의 조각은 항체의 긴 배양 (4 ºC에서이 조각의 구조적 무결성을 유지하기 위해) 신뢰성이 높은 면역 조직 화학적 결과를 얻을 수 있습니다.신경 세포의 식별 녹화, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석에서 얻어진 결합 된 정보에 의존합니다. 해마에 의한 엄격한 층류 조직으로, 축삭 분포의 interneurons의 시냅스 대상의 좋은 지표입니다. 축삭 또는 수상 돌기를 절단하지만, 식별이 어렵거나 불가능 할 수 있습니다. 또한, 일부 모호함은 전체 축삭 현지화에 의한 유사성 PV + 수익 증권 AXO-axonic의 interneurons을 감별 예를 들어 남아있다. 마지막으로 최종 확인은 시냅스 대상 1,3 O를의 전자 현미경 분석을 필요로또한 면역 조직 화학적 박리 (22) r에.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 그녀의 뛰어난 기술 지원을 인애 볼터을 감사드립니다. VGAT - 금성 형질 전환 쥐 박사에 의해 생성되었다. 박사 A. 미야 와키에서 제공 PCS2-비너스를 사용하여 Y. 야나가와, M. 히라 바 야시와 국립 생리 과학 연구소, 오카자키, 일본 Y. 가와구치.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | see Uematsu , et al., 2008 | ||
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| Dissection tools | i.e. FST | For brain removal | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | Custom-made in lab | ||
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. | |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | Custom made | ||
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | ||
| Isolated constant voltage stimulator |  Digitimer Ltd. |
DS-2A | |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5,000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | Any high quality brand | ||
| Glass coverslips | Usually 22 x 22 mm | ||
| Agar spacers | Agar block, cut on vibratome to 300 μm | ||
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | See Schindelin et al., 2012 |
References
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