Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons

Published: September 30, 2014 doi: 10.3791/51706
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Integrative Neuroanatomy, NeuroCure Cluster of Excellence, Charité Universitätmedizin

Summary

يتم التحكم في الشبكات القشرية من قبل مجموعة صغيرة، ولكنها متنوعة من interneurons المثبطة. ولتحقيق الوظيفي للinterneurons يتطلب تسجيل المستهدفة وتحديد دقيق. الموصوفة هنا هو نهج مجتمعة تشمل تسجيلات خلية كاملة من أزواج واحدة أو جانب synaptically من الخلايا العصبية بين الخلايا مع وضع العلامات، خاصة بعد المورفولوجية والتحليل immunocytochemical.

Abstract

GABAergic interneurons المثبطة تلعب دورا مركزيا في الدوائر العصبية في الدماغ. تشمل Interneurons مجموعة فرعية صغيرة من السكان العصبية (10-20٪)، ولكن تظهر مستوى عال من الفسيولوجية، الصرفي، وعدم التجانس الكيميائية العصبية، والتي تعكس وظائفها المتنوعة. لذلك، والتحقيق في interneurons يوفر نظرة ثاقبة على مبادئ تنظيم وظيفة الدوائر العصبية. هذا، ومع ذلك، يتطلب نهجا الفسيولوجية وتشريحي عصبي متكامل لاختيار وتحديد أنواع عصبون الفردية. خلية كاملة تسجيل من شرائح الدماغ الحادة من الحيوانات المعدلة وراثيا، معربا عن بروتينات الفلورسنت تحت المروجين للعلامات عصبون محددة التصحيح، المشبك، ويوفر وسيلة فعالة لاستهداف وelectrophysiologically تميز الخصائص الذاتية ومتشابك من أنواع عصبون محددة. جنبا إلى جنب مع وضع العلامات الصبغة داخل الخلايا، ويمكن تمديد هذا النهج مع ما بعد مو خاصةتحليل rphological وimmunocytochemical، مما يتيح تحديد منهجي من الخلايا العصبية المسجلة. هذه الأساليب يمكن أن تكون مصممة لتناسب مجموعة واسعة من المسائل العلمية المتعلقة بالخصائص الوظيفية لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية القشرية.

Introduction

وكانت الدوائر العصبية قرن آمون منذ فترة طويلة موضوع تدقيق مكثف، فيما يتعلق بكل من علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء، وذلك بسبب الدور الأساسي في التعلم والذاكرة، فضلا عن الملاحة المكانية في كل من البشر والقوارض. وبالمثل، فإن منظمة الصفحي بارزة، ولكن بسيطة من الحصين يجعل هذه المنطقة وهو موضوع مفضل من الدراسات التي تتناول الخصائص التركيبية والوظيفية للشبكات القشرية.

وتتألف الدوائر من خلايا قرن آمون مثير الرئيسية (> 80٪) وأصغر (10-20٪)، ولكن فوج متنوعة للغاية من interneurons المثبطة 1-3. Interneurons الافراج حامض γ-امينوبوتيريك (GABA) من المحطات محوار بهم الذي يعمل في ionotropic سريع GABA A مستقبلات (GABA A روبية) وبطيئة metabotropic مستقبلات GABA B (GABA B روبية) 4. هذه الآليات المثبطة موازنة الإثارة وتنظيم استثارة الخلايا الرئيسية، وبالتاليتوقيت الأشعة تحت الحمراء ونمط التصريف. ومع ذلك، GABA سراحه من interneurons تعمل ليس فقط على الخلايا الرئيسية، ولكن أيضا على interneurons أنفسهم 5،6. قبل وبعد المشبكي مستقبلات توسط تنظيم ردود الفعل والتفاعلات المتبادلة المثبطة بين أنواع مختلفة من عصبون. ويعتقد أن هذه الآليات المثبطة في شبكات عصبون أن تكون مركزية في جيل وتشكيل أنماط النشاط السكاني، في التذبذبات خاصة على ترددات مختلفة 7.

خلية كاملة تسجيل التصحيح، المشبك هي طريقة راسخة لفحص الخصائص الذاتية والتفاعلات متشابك من الخلايا العصبية. ولكن نظرا لتنوع كبير من أنواع عصبون، والتحقيق في interneurons المثبطة ويتطلب التشخيص الدقيق للخلايا المسجلة. كما تتميز أنواع عصبون قرن آمون بواسطة سمات مميزة المورفولوجية والكيميائية العصبية علامة التعبير، التشريحية مجتمعة والبريد immunocytochemicalيمكن xamination توفر وسيلة لتحديد الهوية الدقيق 6،8،9 عصبون.

في هذه الورقة وصفنا هذا النهج التجريبي الذي يتم الجمع بين خلية كاملة تسجيلات التصحيح المشبك من الخلايا العصبية واحدة أو أزواج جانب synaptically مع وضع العلامات داخل الخلايا، تليها بعد خاصة التحليل الصرفي وimmunocytochemical، مما يسمح لتوصيف بطيئة GABA B مستقبلات بوساطة التأثيرات المثبطة interneurons في تحديدها. وكمثال على ذلك، ونحن نركز على نوع واحد رئيسي للعصبون، مجموعة فرعية من ما يسمى "خلايا سلة" (BC)، والتي يعصب سوما والتشعبات القريبة من أهدافها بعد المشبكي ويتميز "ارتفاعه السريع" (FS) تصريف نمط، محور عصبي تغطي طبقة كثيفة جسم الخلية، والتعبير من البروتين parvalbumin ملزم الكالسيوم (PV) 10،11. تعرض هذه التيارات interneurons المثبطة بعد المشبكي كبيرة، وكذلك قبل بارزتعديل متشابك من إنتاجها متشابك، ردا على GABA B R تفعيل 12. مزيج من الأساليب المذكورة هنا يمكن تطبيق جيد على قدم المساواة للتحقيق آليات فعلية أو متشابك في مجموعة متنوعة من غيرها من أنواع الخلايا العصبية التي تم تحديدها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات والحيوان الصيانة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، وقانون رعاية الحيوان الألمانية، المجلس الأوروبي التوجيه 86/609 / EEC فيما يتعلق بحماية الحيوانات، والمبادئ التوجيهية من السلطات المحلية (برلين، T-0215/11: بيان الأخلاق )

1. إعداد شرائح الحادة الحصين

  1. اتخاذ الفئران المعدلة وراثيا (17 إلى 24 يوما من العمر)، معربا عن بروتين فلوري فينوس / YFP تحت المروج vGAT التي تصف غالبية interneurons المثبطة القشرية 13. قطع رأس الفئران. بسرعة تشريح الدماغ (<40 ثانية) في semifrozen، carbogenated (95٪ O 2/5٪ CO 2) السائل القائم على السكروز الاصطناعي النخاعي (السكروز-ACSF، الشكل 1A).
  2. تقييم تشريح الدماغ الفئران لفينوس / YFP مضان مع 505 نانومتر مصباح LED و515 مرشح الانبعاثات، التي شنت على زوج من نظارات واقية.
  3. إزالة الثلث الأمامي من القشرة وcerebellum. ثم فصل نصفي الكرة الأرضية، مع كل مشرط. إزالة السطح الظهري من القشرة لتوفير سطح مستو لالغراء الدماغ أسفل، كما هو موضح سابقا 14.
  4. قطع شرائح عرضية (300 ميكرون) من تشكيل الحصين على vibratome، يجب أن تكون محاطة نصفي الكرة الأرضية مع semifrozen، carbogenated السكروز-ACSF (الشكل 1B) 14. إزالة مناطق إضافية من القشرة منقاري، الدماغ المتوسط ​​والدماغ. نقل كل شريحة إلى غرفة إجراء المغمورة التي تحتوي على السكروز-ACSF التي carbogenated وتحسنت إلى 35 درجة مئوية.
  5. ترك شرائح لاسترداد في 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة من الوقت للشريحة الأخيرة دخول ACSF تحسنت. هل هذا من أجل تنشيط عمليات التمثيل الغذائي وتسهيل إعادة إغلاق العمليات العصبية قطع. ثم نقل إلى درجة حرارة الغرفة لتخزين (الشكل 1C).

2. تصنيع وتعبئة للتسجيل الماصات

  1. بوالماصات ليرة لبنانية التصحيح من الزجاج الشعيرات الدموية، بحيث يتم التوصل إلى المقاومة ماصة من 2-4 MΩ عندما تمتلئ تصفية (فلتر حقنة، حجم المسام: 0.2 ميكرون) حل داخل الخلايا التي تحتوي على 0.1٪ biocytin (لوصفها الخلايا). يبقي الحل داخل الخلايا المبردة على الجليد لمنع تدهور مكوناته.
  2. ملء الماصات التصحيح لتحديد التيارات بعد المشبكي مع محلول يحتوي على الكلور منخفضة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية - تركيز (E R (الكلورين) = -61 بالسيارات، انظر قائمة الحل).
  3. لإقران التسجيلات لتحديد مستقبلات بوساطة الردود قبل المشبكي، وملء ماصات التصحيح مع حل داخل الخلايا مع انخفاض الكالسيوم قدرة 2+ عازلة لمنع التدخل في الإفراج الارسال presynaptically، فضلا عن 4 أضعاف أعلى الكلور - تركيز (E R (الكلورين) = -20 بالسيارات) لتحسين إشارة إلى الضجيج من IPSCs المرصودة 5 السماح تقييم دقيق من التركيب الدوائيonsiveness. لاحظ أن تغيير الكلور - تركيز يمكن أن يغير حركية IPSC 15.

3. خلية كاملة تسجيل التصحيح، المشبك من FS-INS

  1. Carbogenate في ACSF وتتغذى من خلال نظام نضح إلى غرفة تسجيل، عن طريق مضخة تحوي (الذي يزيل أيضا ACSF من غرفة تسجيل من خلال خط الشفط، الشكل 2A). تشغيل جميع المعدات على الإعداد استعدادا للتسجيل.
  2. نقل شريحة إلى غرفة تسجيل وعقد في مكان مع خاتم البلاتين موتر مع الألياف واحدة من الحرير. ضع شريحة بحيث تكون الطبقة (شارع). الهرمية CA1 من يدير عموديا عبر مجال الرؤية، مما يتيح الوصول مع 2 الماصات على كل من شارع. المشععة وشارع. oriens في وقت واحد (أرقام 2C و4A).
  3. وضع الغرفة في الإعداد والبدء نضح من carbogenated وحرارة (32-34 درجة مئوية) تسجيل وCSF بمعدل تدفق 5-10 مل / دقيقة.
  4. تقييم جودة شريحة تحت البصريات في مدينة دبي للإنترنت-IR 40X التكبير موضوعي، وتصور مع كاميرا CCD عرضها على الشاشة. نفترض جودة شريحة جيدة اذا يمكن رؤية عدد كبير من الخلايا الهرمية CA1 يتناقض معتدلة مستديرة (PC CA1) في شارع. الهرمية في أعماق 20-30 ميكرومتر أدناه سطح أملس وذا الفوهات طفيفة (الشكل 2C). شرائح نوعية رديئة تحتوي على أعداد كبيرة من يتناقض إلى حد كبير، وخلايا منكمشة أو تورم، مع سطح شريحة متفاوتة.
  5. تحديد FS interneurons المفترض تحت epifluorescence إضاءة كتلك التعبير عن فينوس / YFP (الشكل 2B)، مع somata متعدد الأقطاب كبير في أو بالقرب من شارع. الهرمية. حدد الخلايا معقول في أعماق شريحة (50-100 ميكرون، الشكل 2C) من أجل الحفاظ على أفضل سلامتها المورفولوجية.
  6. جبل القطب تسجيل في حامل ماصة على headstage. ثم التطبيقلاي منخفضة، وضغط إيجابي (20-30 ميللي بار) من خلال خط الأنبوب. خفض ماصة لسطح شريحة، ويقابل قليلا إلى مركز الخلايا العصبية المحدد.
  7. الحصول على خلية كاملة التكوين تسجيل كما هو موضح سابقا 14،16 وانظر الشكلين أيضا 2D و 2E:
    1. استهداف خلية: زيادة الضغط على 70-80 ميللي بار وخفض بسرعة ماصة من خلال شريحة إلى ما فوق سوما من الخلية المحددة (الشكل 2D، أعلى).
    2. الاقتراب من الخلية: اضغط على ماصة ضد غشاء الخلية لإنتاج "الدمل" على ذلك (الشكل 2D، أعلى). تنفيذ هذه الخطوة على وجه السرعة، من أجل منع وضع العلامات biocytin من الخلايا المجاورة.
    3. إنشاء ختم جيجا أوم: الافراج عن الضغط وتطبيق في وقت واحد أمر الجهد 20 فولت إلى ماصة. ختم جيجا أوم (1-50 GΩ. الشكل 2D، وأسفل الشكل 2E الأوسط) typicحليف يتطور بسرعة. مرة واحدة مختومة، وتطبيق غشاء يستريح المتوقع المحتملين (عادة بين -70 و -60 بالسيارات) كأمر الجهد.
    4. اختراق التصحيح: مرة واحدة مختومة، تمزق غشاء التصحيح مع نبضة قصيرة من الضغط السلبي. وبالتالي تحقيق تكوين خلية كاملة (الشكل 2E، أسفل).
  8. تعويض السعة خلية كاملة وسلسلة المقاومة (R S). R ق عادة 5-20 MΩ ومستقرة لمدة تصل إلى 120 دقيقة. التخلي عن الخلايا إذا غشاء المحتملة (V M) على كسر من خلال استقطابها لأكثر من -50 بالسيارات. R S هو أكبر من 30 MΩ في البداية. أو تغييرات R S بأكثر من 20٪ على مدار التسجيل.
  9. تحديد FS الإضافية من خلال ردهم (في وضع المشبك الحالي) إلى عائلة من فرط لإزالة إستقطاب البقول الحالية (-250 إلى +250 السلطة الفلسطينية، الشكل 2F، أعلى). FS-INS واستقطابها نسبيا V M (عادة -50 رس -60 بالسيارات)، غشاء القصير وقت ثابت (<20 مللي ثانية) وترد على السلطة الفلسطينية إزالة إستقطاب 500 حقن الحالي مع قطار من إمكانات العمل (الجزائرية) على ترددات> ​​100 هرتز 11 (الشكل 2F، القاع)، والتي هي بشكل ملحوظ تختلف عن تلك الموجودة في أجهزة الكمبيوتر CA1 (الشكل 2F والمتوسطة).

4. خارج الخلية الكهربائية تحفيز لاستحضار الردود GABA B R بوساطة

  1. لمراقبة استجابات أثار synaptically، ضع إلكترود خارج الخلية التحفيز (ماصة التصحيح مليئة 2 M كلوريد الصوديوم، المقاومة: 0.1-0.3 MΩ) في شريحة عند حدود شارع. المشععة وشارع. -الجوبية الجزيئية. اضبط القطب 200-300 ميكرون الجانبي إلى سوما لمنع التحفيز الكهربائي المباشر من الخلية وتقليل التحف التحفيز (الشكل 3A).
  2. مرة واحدة يتم وضع القطب التحفيز، الحصول على تسجيل خلية كاملة منالخلية اختيار وتقييم النمط الظاهري الفسيولوجية في وضع المشبك الحالي كما في القسم 3.9 (الشكل 3B).
  3. مع الخلايا العصبية المسجلة في الجهد المشبك (V M -65 بالسيارات)، وتقديم التحفيز الكهربائي من المحاور قبل المشبكي في 50 V (~ 500 أمبير التحفيز الفعال) كل 20 ثانية، باستخدام معزولة مشجعا ثابت الجهد. استخدام المحفزات واحدة (100 μsec المدة، والشكل 3C، أعلى) لمراقبة GABA B R IPSCs بوساطة، وتعشيق مع القطارات من المحفزات متعددة (في 200 هرتز) لإنتاج أكبر الإفراج الارسال.
  4. حمام تنطبق ionotropic مضادات مستقبلات الغلوتامات (أمبا مستقبلات: DNQX [10 ميكرومتر]. NMDA مستقبلات: D-AP5 [50 ميكرومتر]) للكشف عن معزولة الأحادي المشبك IPSC (الشكل 3C، العلوي الأوسط). تزيد من عزلة IPSC GABA B R بوساطة مع تطبيق مانع GABA A R (gabazine [10 ميكرومتر]، الشكل 3C المتوسط ​​لOWER).
  5. تأكيد الناتجة بطيئة الخارجي الحالي (الشكل 3C أقل، وسعت) كشخص GABA B R بوساطة من قبل التطبيق اللاحق لCGP-55،845 [5 ميكرومتر] (الشكل 3C أقل، تحتها باللون الرمادي)

5. المقترنة تسجيلات Synaptically إلى جانب FS-IN وCA1 أجهزة الكمبيوتر

  1. تقييم GABA B R بوساطة السيطرة من قبل المشبكي المثبط انتقال متشابك مع التسجيلات في وقت واحد، إلى جانب أداء بين synaptically-IN وPC أزواج كما هو موضح أدناه.
  2. أولا، إنشاء تسجيل خلية كاملة من عصبون قبل المشبكي (كما في القسم 3) وتأكيد النمط الظاهري FS (الشكل 4A).
  3. ثم التصحيح وCA1 PC المجاورة (20-100 ميكرون المسافة، الشكل 4A) وتطبيق suprathreshold موجز إزالة إستقطاب البقول الحالية (1 مدة ميللي ثانية، 1-5 غ السعة) إلى IN قبل المشبكي (الذي عقد في وضع المشبك الحالي) إلى انتزاع نقاط وصول. إذا كان المشارك متشابكnnection هو الحاضر، نقاط وصول في النتيجة في في IPSCs في PC CA1، الذي عقد في الجهد المشبك (تعويض R S إلى حوالي 80٪).
  4. إذا لزم الأمر، وملء القطب تسجيل جديد وتسجيل المزيد من أجهزة الكمبيوتر CA1 حتى تم العثور على اتصال.
  5. مرة يتم تأسيس اتصال، انتزاع أزواج من نقاط وصول في قبل المشبكي FS-IN لتقييم كل من استجابة متشابك وحدوية والسلوك الديناميكي. استخدام بروتوكول نموذجي إقران النبض من 2 المحفزات إزالة إستقطاب مع فاصل زمني 50 مللي ثانية (الشكل 4B).
  6. جمع آثار تحكم في ظروف خط الأساس. ثم، تطبيق GABA B باكلوفين R ناهض انتقائية (10 ميكرومتر) إلى ACSF perfusing، وبالتالي تفعيل GABA B روبية، تليها خصم CGP-55845 (5 ميكرومتر)، لمنع تماما مستقبلات بوساطة الآثار. جمع 50 ~ آثار خلال حالة مستقرة من كل شرط المخدرات (الشكل 4B و C).
  7. بمجرد اكتمال التسجيل، وختم الغشاء الجسدية بتشكيل خارج منالإلكترونية من التصحيح: سحب ببطء ماصة من جسم الخلية في V-المشبك وكما يزيد R S، M خفض V إلى -40 بالسيارات. نفعل ذلك لتسهيل تشكيل التصحيح الخارجي بها؛ ثم إزالة ماصة من الحمام.

6. تحليل الخصائص الكهربية

  1. ملاحظة: هناك العديد من حزم البرامج المختلفة المتاحة لاقتناء البيانات الكهربية. هنا، WinWCP، يتم استخدام برنامج ويندوز في حزمة ستراثكلايد الكهربية البرمجيات الحرة، والتي تسمح تسجيل ما يصل الى 16 قنوات التناظرية المدخلات والمخرجات من 10 الإشارات الرقمية.
  2. المنخفضة تمرير مرشح جميع البيانات في 5-10 كيلو هرتز و 20 كيلوهرتز في العينة.
  3. تحليل البيانات الفسيولوجية مع تحليل جناح خارج الخط.
    ملاحظة: Stimfit، حزمة برمجيات المصدر المفتوح والذي يتضمن قذيفة بيثون، ويستخدم في هذه الحالة. ومع ذلك بدائل أخرى يمكن بسهولة أن تستخدم بدلا من ذلك.
    1. تحليل السلبي غشاء صroperties من الخلايا العصبية المسجلة، حصلت في المشبك الحالي، من يستريح غشاء المحتملة.
    2. قياس متوسط ​​يستريح غشاء المحتملة من خط الأساس الردود المسجلة من بداية التسجيل.
    3. حساب المقاومة المدخلات، وذلك باستخدام قانون أوم، من الاستجابة الجهد إلى أصغر البقول الحالية hyperpolarizing (≤ -50 باسكال). لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء، متوسط ​​آثار متعددة. ملاحظة: أمثلة لدينا هي عادة متوسطات 10-50 الاحتلالات الفردية.
  4. تقدير الوقت غشاء الواضح المستمر من المناسب منحنى monoexponential إلى اضمحلال الردود على أصغر البقول الحالية hyperpolarizing.
  5. تحليل الموجي العمل المحتملين لتحديد عتبة، السعة (عتبة إلى الذروة) ومدة (عرض قياسها نصف الارتفاع) التي تسببها مستوى عتبة إزالة إستقطاب البقول الحالية.
  6. تحليل GABA B R IPSCs بوساطة من التسجيلات المشبك الجهد. تصفية اثار خارج الخط في500 هرتز (فلتر جاوس) وتقييم السعة الذروة والكمون من GABA B R استجابة بوساطة (في المتوسط ​​لا يقل عن 10 آثار).
  7. كشف تأثير GABA B روبية على الانتاج المثبطة من الوظائف على أنه تغيير في السعة الذروة من IPSCs GABA A R بوساطة قياس بين الذروة وتسبق خط الأساس. حساب السعة يعني من ≥50 آثار لفترة الرقابة ودولة مستقرة من جميع العهود الدوائية.

7. التصور وكيمياء سيتولوجية مناعية من FS-إنس

  1. بعد التسجيلات، وتحديد الشرائح عن طريق الغمر في 4٪ بارافورمالدهيد مع 0.1 M الفوسفات عازلة (PB، ودرجة الحموضة = 7.35) O / N في 4 درجات مئوية.
  2. إذا يمكن نقلها شرائح اللازمة لPB وتخزينها لمدة تصل إلى ~ 1 قبل أسبوع من المعالجة.
  3. شرائح غسل متحررا في PB الطازجة وبعد ذلك في 0.025 M PB مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم (PBS، ودرجة الحموضة = 7.35).
  4. للحد من الأجسام المضادة غير محددة ملزمة، منع شرائح FOص 1 ساعة على RT في محلول يحتوي على 10٪ مصل الماعز العادي (خ ع)، 0.3٪ تريتون-X100 (أ المنظفات لpermeabilize الأغشية) و 0.05٪ نان 3، تتكون في برنامج تلفزيوني.
  5. لتسمية للتعبير PV، استخدم مضاد-PV الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس المخفف في محلول يحتوي على 5٪ NGS، 0.3٪ تريتون-X100، 0.05٪ نان 3، في برنامج تلفزيوني. احتضان الأجسام المضادة الأولية لمدة 2-3 أيام عند 4 ° C 12. شطف شرائح بدقة في برنامج تلفزيوني.
  6. تطبيق مكافحة فأر الأجسام المضادة الثانوية الفلورية (مثل Alexafluor-546.) جنبا إلى جنب مع البيوتين streptavidin ملزم البروتين، مترافق إلى تألقي (على سبيل المثال، Alexafluor-647). واحتضان في محلول يحتوي على 3٪ NGS، 0.1٪ تريتون-X100، 0.05٪ نان 3، مخففة في برنامج تلفزيوني واحتضان O / N في 4 درجات مئوية.
  7. شطف شرائح تحرري 2-3x مع PBS تليها 2-3 يشطف في PB. تركيب شرائح على الشرائح الزجاجية. استخدام 300 ميكرون أجار فاصل لمنع شريحة من الانهيار. شرائح غطاء للانزلاق مع الفلوريةتصاعد المائة المتوسطة وختم مع مسمار الورنيش.

8. التصوير وإعادة بناء متصور FS-إنس

  1. تصور شرائح باستخدام مجهر المسح مبائر، مع مراسل fluorochome سعيدا مع خط ليزر المناسب (ليزر ديود 635 نانومتر لAlexafluor-647، هيليوم نيون 543 نانومتر لAlexafluor-546 لوسم PV والأرجون 488 أو 515 نانومتر لفينوس / YFP).
  2. التقاط صور في لZ-القرار المناسب (عادة 0.5-1 ميكرومتر الخطوات، وذلك باستخدام الهدف 20X) لإنتاج Z-كومة من الخلية بأكملها. ويطلب عادة أكوام متعددة لصورة خلية كاملة، والتي يمكن مخيط رقميا خارج الخط باستخدام فيجي / برنامج ImageJ (الشكل 5A).
  3. إعادة بناء الخلية من الصورة كومة مخيط باستخدام طريقة تتبع شبه التلقائي (بسيط محوار الراسم المساعد في فيجي / يماغيج حزمة البرامج 17، الشكل C).
  4. أخيرا، تقييم PV-مناعية من طnterneuron مع عدسة موضوعية الفتحة العددية العالية (60X السيليكون الغمر، NA = 1.3). جعل صور سوما، التشعبات والداني محوار القريبة، أو بدلا من المحطات محوار إذا تبييض الجسدية من PV قوية جدا. تعتبر الخلايا الكهروضوئية إذا مناعيا لينظر المناعة وضع العلامات لتتماشى مع الهياكل المسمى biocytin (الشكل 5B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

شريطة أن جودة شريحة جيدة بشكل ملحوظ، وتسجيل من كلا CA1 أجهزة الكمبيوتر وFS الإضافية يمكن أن يتحقق بأقل قدر من الصعوبة. خط الفئران المعدلة وراثيا معربا عن فينوس / YFP تحت المروج vGAT 13 لا تحدد بشكل قاطع FS الإضافية، أو في الواقع BCS. لكن التسجيلات من دائرة الهجرة والتجنيس في وحول شارع. الهرمي، حيث كثافة FS-INS مرتفعة عادة 1، والنتائج في وجود احتمال كبير لاختيار FS-INS (الشكل 2B). FS-INS يمكن تمييز بحكم الخصائص الفيزيولوجية مميزة تختلف عن كل من أجهزة الكمبيوتر وCA1 RS-INS. لديهم الغشاء استقطابها نسبيا يستريح المحتملة (-58.9 ± 1.5 فولت، 15 الخلايا، مقابل -62.6 ± 1.1 بالسيارات في CA1 أجهزة الكمبيوتر، 26 خلايا)، وانخفاض مقاومة المدخلات (92 ± 12 MΩ مقابل 103 ± 14 MΩ في أجهزة الكمبيوتر) وسريع واضح ثابت وقت الغشاء (15.4 ± 2.6 ميللي ثانية مقابل 22.0 ± 2.7 ميللي ثانية في أجهزة الكمبيوتر)، بالنتيجهتينغ ردا الجهد السريعة لhyperpolarizing البقول الحالية (الشكل 2F). تفريغها FS-INS إمكانات العمل قصيرة جدا (0.38 ± 0.01 ميللي ثانية) من السعة منخفضة نسبيا (82.8 ± 1.0 فولت)، يليه سريع فرط الاستقطاب التلوي بارزة جدا (يعني السعة 22.6 ± 2.9 بالسيارات). ردا على البقول الحالية إزالة إستقطاب كبير (250 سنويا)، أطلقت FS الإضافية على ترددات عالية (82 ± 10 هرتز، المدى: 34-128 هرتز، الشكل 2D، يسار).

لتقييم GABA B-R بوساطة التيارات بعد المشبكي في FS الإضافية، وأثارت ردود متشابك معزولة دواء عن طريق تحفيز الخلية من الألياف المثبطة في شارع. المشععة / الجوبية-الجزيئية الحدود. ويبين الشكل 3 مثالا لFS-IN، الذي الحصار متتابعة من مكونات الاستجابة مركب متشابك يعزل الأحادي المشبك GABA B-R بوساطة بطيئة IPSC. كانت الاستجابات متشابك ايليالتي ذكرها المحفزات واحدة أو القطارات من 3-5 المحفزات (50 كثافة V، 0.1 ميللي ثانية مدتها، ألقاها في 200 هرتز) إلى شارع. الجوبية-الجزيئية / الحدود المشععة (الشكل 3A). تم تخفيض استجابة مجمع الأولية بما في ذلك مكونات حد سواء مثير والمثبطة (الشكل 3C، أعلى) بقوة بتطبيق حمام من أمبا وNMDA مستقبلات (DNQX، 10 ميكرومتر وAP-5، 50 ميكرومتر، على التوالي: الشكل 3C، وسط). والأحادي المشبك IPSC المتبقية تضمنت وقت مبكر بسرعة إلى الداخل التيار (أ الداخل الكلور المفترض - التيار بوساطة في عقد المحتملة -65 بالسيارات، مع احتمال انعكاس ما يقرب من -60 بالسيارات، في هذه التجارب) وأبطأ التيار الخارج (بوساطة المفترضة K تصرف مع انعكاس محتمل يقرب من 100 فولت +). إلغاء تطبيق انتقائي GABA A R خصم gabazine (SR-95531، 10 ميكرومتر) على IPSC السريعة، تركعزل بطيئة GABA B R بوساطة IPSC (الشكل 3C، أسفل، أثر أسود). الذي لوحظ ردا على التحفيز واحد، ولكن بشكل أكثر وضوحا ردا على القطارات قصيرة من المحفزات. وقد تأكد هذا الرد بمثابة GABA B-K + R تنشيط تصرف، كما منعت من قبل خصم قوي وانتقائية CGP-55845 (CGP، 5 ميكرومتر، الشكل 3C، أسفل، أثر الرمادي). تظهر FS BCS عادة السعة GABA B IPSCs كبيرة بوساطة R، مثل كما هو مبين في المنشور لدينا مؤخرا 12.

لتقييم التنظيم من قبل المشبكي FS-IN الناتج المثبطة بواسطة GABA B روبية، وأجريت التسجيلات تقرن من جانب synaptically-FS-IN وCA1 أجهزة الكمبيوتر. اتصال متشابك بين FS BCS وأجهزة الكمبيوتر CA1 مرتفع نسبيا، كما هو موضح سابقا 1،3. في هذه التسجيلات، كما هو موضح سابقا، واقتران الاحتمال هو أكثر من 50٪ بين أزواج خلية يقع عن كثب (≤50 ميكرون. 5. ومع ذلك، هذا يعتمد بشدة على نوع عصبون فحصها. تم اختبار الربط إما مع حقن إزالة إستقطاب طويلة الحالي (100 ميللي ثانية، ≥ 500 باسكال) أو قطار من البقول إزالة إستقطاب قصيرة (1 مدة ميللي ثانية، 1-5 نا، تصل إلى 10 نبضات ألقاها في 20 هرتز) انتزاع كل واحد AP. أثارت نقاط وصول في interneurons قبل المشبكي سريع GABA A IPSCs مع الكمون القصير، والارتفاع السريع تسوس R بوساطة أجهزة الكمبيوتر في جانب synaptically. عندما طبقت-البقول تقرن (2 البقول في 20 هرتز)، وأظهر المشبك الاكتئاب على المدى القصير (نسبة المقترنة نبض <1) 1. في الخلية المثال المعروض، أدى تطبيق حمام من GABA B باكلوفين R ناهض (2-10 ميكرون) في انخفاض كبير في اتساع الأولى IPSC (أرقام 4B و 4C). تطبيق حمام اللاحق للخصم CGP-55،845 أدى دائما في انتعاش IPSC (5 من 5 خلايا 12 </ سوب>. أرقام 4B و 4C).

بمجرد الانتهاء من التسجيل، والتصحيح الخارجي من تشكيل بنجاح، كانت ثابتة شرائح يلة وضحاها وبعد ذلك معالجة لتصور وتحليل مورفولوجيا الخلايا تسجيلها وتحديد المحتوى علامة الكيميائية العصبية الخاصة بهم. يوضح الشكل 5A مورفولوجية أحد الممثلين FS BC في الإسقاط من مداخن صورة مجتمعة حصلت على المجهر متحد البؤر. وأكد التعبير الخلية الكهروضوئية في وضع العلامات immunocytochemical التي أعطت إشارة واضحة المناعية على خلايا الجسم والتشعبات القريبة من تسجيلها وخلية المسمى biocytin (الشكل 5B). تم تنفيذ إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد للخلية من مداخن صورة مخيط باستخدام بسيط محوار الراسم المساعد في برنامج فيجي (الشكل 5C) 17. أظهر محوار كثافة عالية من الضمانات في وبالقرب من شارع. الهرمي مع و# 8220؛ سلال "تشكلت حول somata من CA1 أجهزة الكمبيوتر (الشكل 5A، أقحم)، وتحديد مزعومة هذه الخلية على أنها قبل الميلاد. وعلاوة على ذلك، فإن توطين سوما بالقرب من شارع. الهرمية والتشعبات الموجهة الشعاعية تغطي جميع طبقات CA1 تتوافق جيدا مع ميزة شكلية نموذجية من FS BCS 10.

باختصار، في تسجيلات خلية كاملة تم الحصول عليها من التعرف FS PV + BCS، لقد أثبتنا أن هذه الخلايا تعبر عن سعة GABA B-R بوساطة IPSCs بطيئة الكبيرة وأيضا هو تحول دون إنتاجها متشابك بشكل ملحوظ من خلال تفعيل قبل المشبكي GABA B روبية.

الشكل 1
الرقم 1. إعداد شرائح الحصين الحادة. (A) وتشريح الدماغ الفئران الطازجة. ملاحظة الجليد المحيطة الدماغ، والحفاظ علىدرجة حرارة الدماغ كله بالقرب 0 ° C (B) قطع 300 ميكرون شرائح الحصين على vibratome ايكا VT1200s. يتم محاذاة نصفي الكرة الأرضية بحيث يتم قطع السطح القشري أولا. لاحظ كمية كبيرة من الثلج ذائب المحيطة نصفي الكرة الأرضية وcarbogenation ثابت من ACSF الجليدية (السهم). (C) بعد قطع شرائح الدماغ يتم نقلها إلى درجة حرارة السكروز-ACSF. وقد تحولت شرائح مرارا وقلص لإزالة الدماغ الأمامي، والدماغ المتوسط، ولم يتبق سوى الحصين والقشرة الفوقية.

الشكل 2
الشكل 2. خلية كاملة التصحيح، المشبك تسجيل من interneurons. (A) تكوين تسجيل في جميع أنحاء الغرفة. لاحظ تدفق وتدفق هم على طرفي نقيض من الغرفة لتحقيق مقربة من تدفق الصفحي. مرئية أيضا هي recordiنانوغرام الأقطاب، التي شنت على headstages، والأقطاب الأرضية على الجانبين، فضلا عن الهدف (40X والماء الغمر) في الوسط. (B) الطاقة المنخفضة صورة المجهر epifluorescent من vGAT-فينوس / YFP إشارة في وCA1 من الحصين في شريحة (C) التصوير IR-مدينة دبي للإنترنت من نفس المنطقة. الأسهم في B و C تشير إلى عصبون إيجابي فينوس / YFP في طبقة خلايا الجسم. (D) عالية الطاقة-IR مدينة دبي للإنترنت صور سوما من الخلايا العصبية هو مبين في لوحة B، مع ماصة التصحيح تقترب تشكيل الدمل على سطح (أعلى)، وبعد ذلك الخلية في تكوين خلية كاملة (القاع). (E) توضيح تخطيطي لمراحل رئيسية من إنشاء خلية كاملة تسجيل التصحيح، المشبك (الجانب الأيسر) مع ردود الكرتون لاختبار الجهد بالنبض مراقبة المقاومة عند طرف ماصة (الجانب الأيمن). الصف العلوي: ماصة في الحمام بعيدا عن الخلية؛ منتصف العلوي: تشكيل الدمل، يرافقهانخفاض في السعة النبض، مما يشير إلى زيادة معتدلة في المقاومة. انخفاض الأوسط: تشكيل ختم جيجا أوم. لاحظ أن السعة نبض الحالية خفضت بشكل كبير. فقط التيارات بالسعة سريعة مرئية في بداية ونهاية النبض قبل أن يتم تعويض ماصة السعة. ويتحقق خلية كاملة التكوين تسجيل عندما اخترق غشاء التصحيح تحت غيض ماصة: القاع. نلاحظ أن التيارات بالسعة الكبيرة لكنه بطيء نسبيا في بداية ونهاية النبض قبل التعويض المقاومة سلسلة يطبق. (F) آثار ممثلا لFS-IN (أعلى) وCA1 PC (القاع)، التي تسببها عائلة من فرط - لإزالة إستقطاب البقول الحالية (بروتوكول أظهرت أعلاه). ملاحظة تصريف تردد عال جدا من FS-IN مقارنة اطلاق أبطأ بكثير من PC CA1. إدراجات على اليمين: مقارنة الموجي AP من PC CA1 (أعلى) وFS-IN (القاع، في الرمادي، مضافين على AP PC باللون الأسود)، مما يدل على ديfference في الموجي من AP وبرنامج مكافحة الجوع.

الرقم 3
الرقم 3. تشريح الدوائية للاستجابة متشابك المجمع، عزل GABA B IPSCs بوساطة R بطيئة في FS-IN. (A) صورة IR-مدينة دبي للإنترنت من شريحة في غرفة تسجيل، مع القطب تسجيل (البقعة) وضعت على الحدود من شارع. oriens (أوري) والهرمية (فندق Pyr.) والقطب المحاكاة (STIM) في حدود شارع. المشععة (راد) والجوبية-الجزيئية (LM) (B) اليسار: توضيح تخطيطي لتكوين التسجيل. الصحيح: لتركيب الردود الجهد في FS-IN التي تسببها عائلة من فرط لإزالة إستقطاب الحقن الحالية (C) آثار التمثيلية المسجلة من FS-IN ردا على التحفيز خارج الخلية. العلوي: المجمعأنتجت استجابة متشابك في ACSF العادي التي تسببها حافزا واحد (50 كثافة V، 0.1 مدة ميللي ثانية). منتصف العلوي: المعزولة الأحادي المشبك IPSC بعد تطبيق حمام من DNQX (10 ميكرومتر) وD-AP-5 (50 ميكرومتر). الشريحة الدنيا: تم منع IPSCs الأحادي المشبك سريع بعد إضافة gabazine (10 ميكرون) إلى الحمام. القاع: قطار من 5 المحفزات (في 200 هرتز) يكشف بطيئة GABA B R بوساطة IPSC (تتبع الأسود) التي سدت الطلب اللاحق من CGP (5 ميكرومتر) إلى الحمام (فرضه أثر الرمادي).

الرقم 4
الرقم 4. تحليل التشكيل قبل المشبكي المثبط للانتقال متشابك في تقرن التسجيل من جانب FS-IN وPC CA1 زوج. (A) يسار لوحة: صورة مدينة دبي للإنترنت IR-اثنين من ماصات تسجيل، وترك واحدة مصححة على FS-IN في حدود < م> شارع. oriens (أوري) والهرمية (فندق Pyr.) والحق مصححة على جهاز كمبيوتر CA1 أقرب إلى شارع. المشععة (راد). اللوحة اليمنى: التخطيطي لتكوين التسجيل، مع استجابات الجهد تمثيلية من FS-IN (يسار) وCA1 PC (يمين) إلى عائلة البقول الحالية (B) آثار الممثل تبين نقاط وصول أثارت في قبل المشبكي FS-IN (أعلى) وIPSC قصيرة الكمون وحدوية في PC CA1 (القاع) تحت ظروف التحكم (آثار على اليسار)، بعد تطبيق حمام من باكلوفين (10 ميكرومتر والمتوسطة)، والطلب اللاحق من CGP (5 ميكرومتر، يمين) . لاحظ أن باكلوفين خفض السعة IPSC بواسطة ~ 50٪، في حين أدى CGP في الانتعاش الكامل تقريبا من السعة IPSC. وتظهر تحتها آثار السيطرة. (C) التوقيت طبعا مؤامرة من السعة IPSC يظهر تأثير باكلوفين وCGP. سجلت IPSCs في 10 ثانية فترات.

ق "> الرقم 5
الشكل 5. التصور والتعمير وتحديد immunocytochemical من المسمى biocytin سجلت FS-BC. (A) والإسقاط من مداخن مخيط من الصور لFS-IN تصويرها مع الهدف 20X على المجهر متحد البؤر. يقع somata في حدود شارع. المشععة (راد) والهرمية (فندق Pyr.) من مساحة CA1، والتشعبات تشغيل شعاعيا وتغطي جميع الطبقات، في حين تم العثور على معظم محوار في وحول طبقة خلايا الجسم. كما الحال بالنسبة للBCS. شريط مقياس: 100 ميكرون. أقحم، أعلى اليمين: إسقاط التكبير العالية من 20 طبقات، والتي تبين سلال نموذجية من تشكيل محور عصبي حول المفترض CA1 PC somata (النجمة البرتقالية). شريط النطاق: 10 ميكرومتر (B) على جثة مليئة biocytin خلية من IN (pseudocolour الأبيض، واللوحة السفلى، السهم) معارض تفاعلية مناعية لPV (باللون الأخضر، لوحة العلوي). على نطاق وشريط: 20 ميكرون (C) الإسقاط من إعادة الإعمار 3 الأبعاد للخلية. سوما والتشعبات هي بالأسود ومحور عصبي الملونة الحمراء. ويتم رسم طبقات من CA1 في الزرقاء. الاختصارات: أوري، شارع. oriens. LM، شارع. -الجوبية الجزيئية. شريط مقياس: 100 ميكرون.

اسم تكوين (ملم) استخدام ملاحظات
السكروز-ACSF 87 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 25 NaHCO 3، 1.25 ناه 2 ص 4، 25 الجلوكوز، والسكروز 75، 7 MgCl 2، 0.5 CaCl 2، 1 نا البيروفات، 1 نا أسكوربات إعداد وتخزين شرائح الدماغ درجة الحموضة = 7.4؛ الأسمولية = ~ 350 الميلي أسمول
تسجيل ACSF 125 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 25 NaHCO 3، 1.25 ناه 2 ص 4، 25 الجلوكوز، 1 MgCl 2، 1 نا البيروفات، 1 نا أسكوربات تسجيل من شرائح الدماغ درجة الحموضة = 7.4؛ الأسمولية = 310-315 الميلي أسمول
حل داخل الخلايا (1) 125 K-غلوكونات، 10 بوكل، 10 HEPES، 10 EGTA، 2 MgCl 2، 2 نا ATP، 0.3 نا GTP، 1 نا فسفوكرياتين و 0.1٪ biocytin ملء أقطاب التسجيلات GABAB IPSC درجة الحموضة = 7.4؛ الأسمولية = 295-305 الميلي أسمول
حل داخل الخلايا (2) 105 K-غلوكونات، 40 بوكل، 10 HEPES، 0.1 EGTA، 2 MgCl 2، 2 نا ATP، 0.3 نا GTP، 1 نا فسفوكرياتين و 0.1٪ biocytin ملء أقطاب للتسجيلات تقرن درجة الحموضة = 7.4؛ الأسمولية = 295-305 الميلي أسمول
العازلة الفوسفات (PB) 100 ملم ناه 2 ص 4 الشطف شرائح الثابتة درجة الحموضة = 7.4
الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) 25 ملم ناه 2 ص 4 </ دون>، 154 مم كلوريد الصوديوم (0.9٪ ث / ت) الشطف شرائح الثابتة والأجسام المضادة حضانة درجة الحموضة = 7.4
تثبيتي بارافورمالدهيد 4٪ ث / ت لامتصاص العرق، 0.1 ملي PB تثبيت من شرائح الدماغ درجة الحموضة = 7.4

الجدول قائمة 1. حلول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن تصف الطريقة التي تجمع بين تقنيات الكهربية وتشريحي عصبي لتوصيف الخلايا العصبية وظيفيا morphologically- وحددت neurochemically في المختبر؛ ولا سيما أنواع متنوعة من الوظائف المثبطة القشرية. الجوانب الرئيسية لهذا الإجراء هي: (1) الاختيار من الوظائف المحتملة؛ (2) تسجيل داخل الخلايا والخلايا العصبية التصور. وأخيرا (3) التحليل الصرفي وimmunocytochemical من الوظائف المسجلة. على الرغم من أن هذه الدراسة قد تناولت PV-INS على وجه الخصوص، وبروتوكول وصف يمكن استخدامها لتسجيلات مشابهة من أي عصبون أو غيرها من أنواع الخلايا العصبية، مع الحد الأدنى من التغيير.

العدد المنخفض نسبيا من interneurons في المناطق القشرية يجعل اختيار عشوائي وتسجيل من هذه الخلايا غير فعالة للغاية. وقد مكنت توطين متباينة والميزات المورفولوجية الباحثين للتمييز وتسجيل بشكل روتيني من بعض أنواع عصبون. ولكن في شرائح، وتحديد المتدربeurons في وبالقرب من طبقات خلايا الجسم لا يزال من الصعب، كما هو الحال مع FS-INS. ظهور خطوط الماوس المعدلة وراثيا، معربا عن البروتينات الفلورية في السكان عصبون معين يقدم حلا رائعا مما يجعل الاختيار وتسجيل هذه الخلايا العصبية أكثر كفاءة بكثير 2. الآن العديد من خطوط المعدلة وراثيا، ومعظمهم من الفئران، ولكن أيضا على نحو متزايد الفئران 13 متوفرة، وتسهيل التحقيق في interneurons. عند استخدام خطوط المعدلة وراثيا، ومع ذلك، لا بد من تحديد مدى وخصوصية تعبير المراسل.

جودة العلامات الخلوي والتشكل، فضلا عن تسجيل الكهربية، يعتمد بشكل حاسم على قابلة للحياة، وشرائح عالية الجودة؛ التي المخ يحتاج إلى تشريح بسرعة (مثالي 20-40 ثانية)، التعامل معها بعناية فائقة ومبردة بشكل مستمر. نجد أن استخدام السكروز-ACSF، حيث يتم تقليل تركيز الصوديوم الكلي وبالتالي استثارة الخلايا العصبية، والدراماtically يحسن نوعية شرائح عصبون وبقاء 18. ومع ذلك، ينبغي التشديد على أن العديد من الباحثين جعلت استخدام ACSF تسجيل موحد لإعداد شريحة، إلى تأثير كبير 10،11،15. سلامة المورفولوجية تعتمد بشكل كبير على الزاوية التي تقطع شرائح 13؛ التي تختلف حسب المنطقة ونوع من الخلايا. ومع ذلك، فإن العديد من interneurons يمكن تسجيلها بشكل موثوق من شرائح عرضية، الاكليلية أو السهمي. لمزيد من تقليل قطع التشعبات ومحور عصبي، يجب أن تستهدف خلايا أعمق في الأنسجة، وإن التضحية بالجودة-IR مدينة دبي للإنترنت وموثوقية تشكيل ختم جيجا أوم. في ظل هذه الظروف التسجيلات من كلا الخلايا الهرمية CA1 وFS-INS يمكن الحصول بشكل موثوق.

وضع العلامات والتصور من الخلايا العصبية والذي تحقق في أعقاب جلسة تسجيل نموذجية 30 دقيقة أو أطول أمدا. إذا تسجيلات تستمر أقل من 30 دقيقة، فمن الضروري للسماح هذه المرة قبل تثبيت لتمكين الحيويcytin إلى منتشر في شجيري القاصي وعمليات محور عصبي، وضمان تعبئة كاملة والتصور بالتالي بعد خاصة من الخلايا.

في تسجيلات خلية كاملة، والحفاظ على سلسلة المقاومة منخفضة ومستقرة لا بد من قياس دقيق للخصائص الفسيولوجية متشابك والجوهرية، وكذلك وضع العلامات شامل للخلايا العصبية. لكن أقطاب مقاومة منخفضة تسمح غسيل الكلى السريع من السيتوبلازم مع الحل الخلايا الموجودة داخل ماصة. المكمل لحل داخل الخلايا مع ATP، GTP وفسفوكرياتين يساعد بالتأكيد على الحفاظ على إمدادات الطاقة وجودة التسجيل. ومع ذلك، يمكن غسيل الكلى من نوروشيميكالس والبروتين يؤدي إلى استجابات تقلص، تخفيض 19 اللدونة ويمكن أيضا أن يعوق تحديد كيميائي عصبي. على سبيل المثال يتم غسلها PV باستمرار من الخلايا العصبية على مدار التجارب أطول. ولذلك، فحص عمليات محواري شجيري أو البعيدة قد تكون هناك حاجة لDETE مناعية rmine من الخلايا العصبية المسجلة. في مثل هذه الحالات التي من هذا القبيل غسيل الكلى هو مصدر قلق، والتسجيلات باستخدام التكوين مثقبة التصحيح يمكن استخدامها للحفاظ على البيئة داخل الخلايا 20، لكن يجب كسر التصحيح في نهاية التسجيلات أو الخلايا العصبية في وقت لاحق "repatched" في تكوين خلية كاملة للسماح biocytin التعبئة.

التحقيق الدوائية من الخلايا العصبية سجلت هي طريقة مفيدة لتقييم أهمية وظيفية آليات neuromodulatory متباينة في تشكيل النشاط جوهري ومتشابك من الوظائف. في الأساليب المذكورة أعلاه، وتستخدم العزلة الدوائية والتسجيلات المقترنة تقييم آخر وGABA قبل المشبكي B الآثار بوساطة R، على التوالي؛ لكن يمكن للمرء بسهولة تعديل مزيج من منبهات مستقبلات ومضادات لتقييم دور الأسر مستقبلات بديلة، على سبيل المثال نظام القنب 21.

"> النسيجية ومعالجة immunocytochemical الخلايا المسجلة هو موثوق بها للغاية، مرة واحدة يتم وضع البروتوكولات. تم ضبطها بروتوكول مناعية الموصوفة هنا فيما يتعلق مزيج من الأجسام المضادة المستخدمة، وسمك شريحة وشرط لتحديد محتوى كيميائي عصبي. نحن نستخدم مصل الماعز العادي كما تثار جميع الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في الماعز. والبدائل، فمن الممكن أيضا استخدام ألبومين المصل البقري (BSA) أو مسحوق الحليب كما منع الوكلاء. وتجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول يستخدم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) للأجسام المضادة الحضانة، ولكن بدلا من ذلك يمكن للمرء ببساطة استخدام 0.1 M PB بدلا من برنامج تلفزيوني. باستخدام تركيزات عالية نسبيا من المنظفات (0.3٪ TritonX-100)، لا يقلل استضداد واضح، في حين يسمح اختراق الأجسام المضادة في أول 100 ميكرون طبقة السطحية للشريحة حيث يتم تسجيل الخلايا العصبية بشكل روتيني، وإذا تسجل أعمق خلايا، أو شرائح وأكثر سمكا، فإنه من المستحسن أن resectiعلى شرائح، وذلك باستخدام ناظم البرد أو vibratome، وتنفيذ أعمال immunolabeling على رقيقة (40-70 ميكرون) أقسام. ل300 ميكرون شرائح، وحضانة طويلة من الأجسام المضادة (في 4 درجة مئوية للحفاظ على السلامة الهيكلية للشرائح) تنتج نتائج immunocytochemical موثوق بها للغاية.

تحديد الخلايا العصبية يعتمد على المعلومات التي تم الحصول عليها مجتمعة في التسجيل، خاصة بعد الصرفية وتحليل immunocytochemical. في قرن آمون، بسبب تنظيم صارمة الصفحي، توزيع محور عصبي يعد مؤشرا جيدا من الأهداف بعد المشبكي من interneurons. قطعت محور عصبي أو التشعبات، ومع ذلك، يمكن أن تجعل من الصعب أو المستحيل تحديد. وعلاوة على ذلك، لا يزال بعض الغموض، على سبيل المثال في التفريق BCS PV + وinterneurons-axonic الذخائر المتروكة، وذلك بسبب التشابه في توطين محور عصبي بشكل عام. ومن شأن تحديد نهائي النهائي تتطلب التحليل المجهري الإلكترون من الأهداف بعد المشبكي 1،3 سمزيد من تشريح immunocytochemical ص 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

الكتاب أود أن أشكر إينا فولتر لها المساعدة التقنية الممتازة. تم إنشاؤها VGAT-فينوس الفئران المعدلة وراثيا من قبل الدكاترة. Y. ياناغاوا، M. Hirabayashi وY. كاواجوتشي في المعهد الوطني للعلوم الفسيولوجية، أوكازاكي، اليابان، وذلك باستخدام PCS2-فينوس التي يقدمها الدكتور A. Miyawaki.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transgenic vGAT-venus rats see Uematsu , et al., 2008
Venus (515 nm) goggles BLS Ltd., Hungary
Dissection tools i.e. FST For brain removal
Vibratome Leica VT1200S Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope Olympus, Japan BX50WI With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera Till Photonics VX55
505 nm LED system Cairn Research OptiLED system Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. 
Multiclamp 700B  Axon Instruments Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers 
WinWCP acquisition software John Dempster, Strathclyde University Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. 
Electrode Puller Sutter P-97 Used with box-filament
Borosilicate pipette glass Hilgenberg, Germany 1405020 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump Gilson Minipuls Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer Custom made
Digital Manometer Supertech, Hungary
Isolated constant voltage stimulator Digitimer Ltd. DS-2A
Biocytin Invitrogen B1592 Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine 
DL-AP5(V) disodium salt Abcam Biochemicals ab120271
DNQX disodium salt Abcam Biochemicals ab120169 Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531) Abcam Biochemicals ab120042 Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen Abcam Biochemicals ab120325
CGP-55,845 hydrochloride Tocris 1248
Streptavidin 647 Invitrogen S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody Swant, Switzerland 235 Working concentration 1:5,000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody  Invitrogen A11030 If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum Vector Labs S-1000
Microscopy slides Any high quality brand
Glass coverslips Usually 22 x 22 mm
Agar spacers Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope Olympus, Japan Fluoview FV1000 Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ) http://fiji.sc/Fiji See Schindelin et al., 2012

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
  2. Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
  3. Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
  4. Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
  5. Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
  6. Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
  7. Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
  8. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
  9. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  10. Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
  11. Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
  12. Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
  13. Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
  14. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
  15. Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
  16. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  18. Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
  19. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
  20. Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
  21. Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
  22. Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).

Tags

علم الأعصاب، العدد 91، الكهربية، شريحة الحادة، وتسجيل خلية كاملة التصحيح، المشبك، مورفولوجيا الخلايا العصبية، مناعية، parvalbumin، الحصين، وتثبيط، interneurons GABAergic، انتقال متشابك، IPSC، GABA-B مستقبلات
خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Booker, S. A., Song, J., Vida, I.… More

Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J. Vis. Exp. (91), e51706, doi:10.3791/51706 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter