Summary
Réseaux corticaux sont contrôlés par un petit, mais diversifié ensemble des interneurones inhibiteurs. Exploration fonctionnelle des interneurones nécessite donc l'enregistrement ciblée et identification rigoureuse. Décrit ici est une approche combinée impliquant des enregistrements de cellules entières de paires simples ou synapses de neurones couplés avec marquage intracellulaire, post-hoc morphologique et l'analyse immunocytochimique.
Abstract
Interneurones inhibiteurs GABAergiques jouent un rôle central dans les circuits neuronaux du cerveau. Interneurones comprennent un petit sous-ensemble de la population neuronale (10-20%), mais montrent une grande hétérogénéité physiologique, morphologique et neurochimique, reflétant leurs diverses fonctions. Par conséquent, l'enquête des interneurones fournit des renseignements importants sur les principes de l'organisation et de la fonction des circuits neuronaux. Ceci, cependant, nécessite une approche physiologique et neuro-anatomique intégré pour la sélection et l'identification des types individuels des interneurones. Cellules entières d'enregistrement de tranches de cerveau aiguës d'animaux transgéniques, exprimant des protéines fluorescentes dans les promoteurs de marqueurs spécifiques d'interneurones patch-clamp, fournit une méthode efficace pour cibler et électrophysiologique caractériser les propriétés intrinsèques et synaptiques des types des interneurones spécifiques. Combiné avec intracellulaire étiquetage de colorant, cette approche peut être étendue avec post-hoc moanalyse rphological et immunocytochimique, permettant une identification systématique des neurones enregistrés. Ces méthodes peuvent être adaptés à un large éventail de questions scientifiques concernant les propriétés fonctionnelles des divers types de neurones corticaux.
Introduction
Circuits neuronaux de l'hippocampe ont longtemps fait l'objet d'un examen minutieux, par rapport à l'anatomie et de la physiologie, en raison de leur rôle essentiel dans l'apprentissage et la mémoire, ainsi que la navigation spatiale chez les humains et les rongeurs. De même, l'organisation laminaire de premier plan, mais simplement de l'hippocampe fait de cette région un sujet de prédilection des études portant sur les propriétés structurales et fonctionnelles des réseaux corticaux.
Circuits de l'hippocampe sont constitués de cellules excitateurs principaux (> 80%) et un plus petit (10-20%), mais la cohorte très diversifié d'interneurones inhibiteurs 1-3. Interneurones libèrent de l'acide γ-aminobutyrique (GABA) de leurs terminaux des axones qui agit à ionotropes rapide récepteurs GABA A (GABA A R) et lents métabotropiques GABAB récepteurs GABA (B R) 4. Ces mécanismes inhibiteurs contrebalancer excitation et de réguler l'excitabilité des cellules principales, et donc lamoment de ir et le modèle de décharge. Cependant, les interneurones GABA libéré agit non seulement sur les cellules principales, mais également sur les interneurones 5,6 eux-mêmes. Récepteurs post-synaptiques et pré médiation régulation par rétroaction et interactions mutuelles inhibitrices entre les différents types de interneurones. Ces mécanismes inhibiteurs dans les réseaux des interneurones sont soupçonnés d'être au cœur de la production et la mise en forme des modèles d'activité de la population, en particulier les oscillations à des fréquences différentes 7.
Cellule entière enregistrement patch-clamp est une méthode bien établie pour l'examen des propriétés intrinsèques et les interactions synaptiques des neurones. Toutefois, en raison de la grande diversité des types de interneurones, enquête sur les interneurones inhibiteurs exige l'identification rigoureuse des cellules enregistrées. Comme types de interneurones hippocampiques sont caractérisés par des éléments particuliers morphologiques et l'expression du marqueur neurochimique, anatomique combinée et immunocytochimique eXAMEN peut fournir un moyen de déterminer précisément 6,8,9 identité des interneurones.
Dans le présent article, nous décrivons une approche expérimentale dans laquelle des cellules entières enregistrements de patch-clamp de neurones simples ou paires synaptique couplés sont combinés avec marquage intracellulaire, suivie par analyse post-hoc morphologique et immunocytochimique, permettant la caractérisation de la lenteur GABA B médiée par le récepteur des effets inhibiteurs dans les interneurones identifiés. A titre d'exemple, nous nous concentrons sur un type majeur de interneurones, un sous-ensemble de ce qu'on appelle les «cellules de panier" (de la Colombie-Britannique), qui innerve les soma et proximale des dendrites de ses objectifs post-synaptiques et se caractérise par un "dopage rapide» (FS) décharger motif, recouvrant un axone forte densité de la couche de corps de la cellule, et l'expression de la protéine parvalbumine de liaison du calcium (PV) 10,11. Ces interneurones présentent d'importants courants postsynaptiques inhibiteurs, ainsi que des pré proéminentmodulation synaptique de leur sortie synaptique, en réponse à l'activation GABA B R 12. La combinaison des techniques décrites ici peut être appliqué aussi bien pour étudier les mécanismes intrinsèques ou synaptiques dans une variété d'autres types de neurones identifiés.
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Protocol
Déclaration éthique: toutes les procédures et animale entretien ont été effectués conformément aux directives institutionnelles, la loi allemande sur la protection des animaux, la directive européenne 86/609 / CEE relative à la protection des animaux, et des directives des autorités locales (Berlin, T-0215/11 )
1 Préparation de tranches aiguë-hippocampiques
- Prenez un rat transgénique (17 à 24 jours), l'expression de la protéine fluorescente Venus / YFP sous le promoteur de VGAT, qui marque la majorité des interneurones inhibiteurs corticaux 13. Décapiter le rat. Rapidement disséquer le cerveau (<40 sec) dans semifrozen, carbogenated (95% O 2, CO 2/5%) à base de saccharose liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF saccharose, figure 1A).
- Évaluer le cerveau de rat disséqué pour Venus / YFP fluorescence avec une lampe 505 nm et 515 filtre d'émission LED, monté sur une paire de lunettes.
- Retirer la troisième frontale du cortex et CerebEllum; puis de séparer les hémisphères, le tout avec un scalpel. Retirer la face dorsale du cortex pour fournir une surface plane pour coller le cerveau vers le bas, comme décrit précédemment 14.
- Couper des tranches transversales (300 um) de la formation hippocampique sur un vibratome, les hémisphères doivent être entourés d'semifrozen, carbogenated saccharose ACSF (figure 1B) 14. Retirer régions supplémentaires du cortex rostral, le mésencéphale et le tronc cérébral. Transfert de chaque tranche dans une chambre de retenue immergé ACSF contenant du saccharose, qui est carbogenated et chauffé à 35 ° C.
- Laissez les tranches de récupérer à 35 ° C pendant 30 min à partir du moment de la dernière tranche entrer dans le ACSF réchauffé. Pour ce faire, dans le but de réactiver les processus métaboliques et de faciliter la refermeture de processus neuronaux coupées. Puis transfert à la température ambiante pour le stockage (figure 1C).
2. fabrication et de remplissage de pipettes d'enregistrement
- PuLes pipettes de patch ll de capillaires en verre, de sorte qu'une résistance à la pipette de 2-4 MQ est réalisé quand il est rempli avec filtré (filtre de seringue, taille des pores: 0,2 um) solution intracellulaire contenant 0,1% de la biocytine (pour le marquage intracellulaire). Conserver la solution intracellulaire refroidi sur de la glace pour empêcher la dégradation de ses constituants.
- Remplissez les pipettes de patch pour l'identification des courants post-synaptiques avec une solution contenant un Cl faible physiologiquement pertinente - concentration (E R (Cl) = -61 mV; voir la liste de la solution).
- Pour les enregistrements appariés pour identifier les réponses médiées par des récepteurs présynaptiques, remplir les pipettes de patch avec une solution intracellulaire de faible capacité Ca2 + tampon pour éviter les interférences avec l'émetteur de presse pré-synaptique, ainsi que 4 fois plus élevée concentration de Cl - (E R (Cl) = -20 mV) pour améliorer le rapport signal-bruit de CISP observées 5 permettant une évaluation précise de resp pharmacologiqueonsiveness. Notez que la modification concentration de Cl - peut modifier la cinétique IPSC 15.
3 cellules entières Patch-clamp enregistrement de FS-IN
- Carbogenate l'ACSF et alimenter par l'intermédiaire du système de perfusion à la chambre d'enregistrement, au moyen d'une pompe péristaltique (ce qui supprime également l'ACSF à partir de la chambre d'enregistrement à travers une conduite d'aspiration, la figure 2A). Mettre tous les appareils de la configuration en cours de préparation pour l'enregistrement.
- Transférer une tranche de la chambre d'enregistrement et maintenir en place avec un anneau de platine enfilées avec des fibres simples de soie. Positionner la tranche de telle sorte que la couche pyramidale (str.) De CA1 s'étend verticalement à travers le champ de vision, ce qui permet l'accès aux deux pipettes à la fois la str. radiatum et str. oriens simultanément (figures 2C et 4A).
- Placer la chambre dans la configuration et commencer la perfusion de carbogenated et chauffée (32-34 ° C) Un enregistrementCSF à un taux de 5 à 10 ml / min.
- Évaluer la qualité de coupe sous l'optique IR-DIC à un grossissement de 40X objectif, et visualiser avec une caméra CCD vu sur un écran. Présumer de la bonne qualité de la tranche si un grand nombre de cellules rondes, modérément contrastées CA1 pyramidales CA1 (PC) peut être vu dans str. pyramidale à des profondeurs de 20-30 um ci-dessous une surface lisse et légèrement cratères (figure 2C). Pauvres tranches de qualité contiennent un grand nombre de très contrastées, les cellules ratatinées ou gonflées, avec une surface de tranche inégale.
- Identifier FS putatifs interneurones sous un éclairage à épifluorescence que ceux exprimant Vénus / YFP (figure 2B), avec une grande soma multipolaire dans ou près de la str. pyramidale. Sélectionnez les cellules raisonnablement profonde au sein de la tranche (50-100 um, figure 2C) afin de mieux préserver leur intégrité morphologique.
- Monter l'électrode d'enregistrement dans le support de pipette sur la headstage; alors l'applicationment une faible pression positive (20 à 30 mbar) à travers la ligne de tube. Abaisser la pipette à la surface de la tranche, légèrement décalé vers le centre du neurone sélectionné.
- Obtenir la configuration d'enregistrement cellule entière comme décrit précédemment 14,16 et voir également les figures 2D et 2E:
- Cibler une cellule: Augmenter la pression à 70-80 mbar et abaisser rapidement la pipette par la tranche juste au-dessus du soma de la cellule sélectionnée (figure 2D, en haut).
- Approche de la cellule: Appuyez sur la pipette contre la membrane cellulaire pour produire une «fossette» sur elle (figure 2D, en haut). Effectuez cette étape rapidement, afin d'éviter l'étiquetage biocytine de cellules voisines.
- Créer un joint gigaohm: Relâchez la pression et appliquer simultanément une commande de 20 mV tension à la pipette. Un joint giga-ohms (1-50 GQ; figure 2D, le fond et la figure 2E milieu) typicallié se développe rapidement. Une fois scellé, appliquer le potentiel membranaire de repos attendu (typiquement entre -70 et -60 mV) en tant que commande de tension.
- Brisez le patch: Une fois scellé, la rupture de la pièce de membrane avec une brève impulsion de pression négative; réalisant ainsi la configuration cellule entière (Figure 2E, en bas).
- Compenser la capacité de cellule entière et de la résistance série (R S). R s est normalement 5-20 MQ et stable jusqu'à 120 min. Abandon cellules si le potentiel (V M) de la membrane sur la percée est plus dépolarisée à -50 mV; R S est initialement supérieure à 30 MQ; ou R S changements de plus de 20% au cours de l'enregistrement.
- Identifier FS-ins par leur réponse (en mode courant-clamp) à une famille de l'hyper à la dépolarisation des impulsions de courant (-250 à 250 pA, figure 2F, en haut). FS-ins ont relativement dépolarisé V M (typiquement -50 to -60 mV), courte membrane constante de temps (<20 ms) et répondre à une 500 pA dépolarisants injection de courant avec un train de potentiels d'action (PA) à des fréquences> 100 Hz 11 (figure 2F, en bas), qui sont nettement différents de ceux de CA1 PC (Figure 2F, milieu).
4. extracellulaire stimulation électrique à susciter des réponses GABA B R médiation
- Pour observer les réponses synaptiques évoqués, placer une électrode de stimulation extracellulaire (une pipette de patch rempli de 2 M de NaCl; Résistance: 0,1-0,3 MQ) dans la tranche à la frontière de str. radiatum et str. lacunosum-moleculare. Positionner l'électrode 200 à 300 um de la soma latérale pour empêcher une stimulation électrique directe de la cellule et de réduire au minimum les artefacts de stimulation (figure 3A).
- Une fois que l'électrode de stimulation est positionnée, obtenir l'enregistrement de cellules entières dela cellule choisie et évaluer le phénotype physiologique en mode courant pince comme dans la section 3.9 (figure 3B).
- Avec le neurone enregistré dans voltage-clamp (V M -65 mV), délivrer une stimulation électrique des axones présynaptiques à 50 V (~ 500 uA stimulus efficace) toutes les 20 secondes, en utilisant un stimulateur de tension constante isolé. Utilisez unique stimuli (100 ps durée, la figure 3C, en haut) pour observer GABA B R CISP médiation, et s'imbriquent avec des trains de multiples stimuli (à 200 Hz) afin de produire une plus grande version de l'émetteur.
- Bain s'applique antagonistes des récepteurs ionotropiques du glutamate (récepteur d'AMPA: DNQX [10 uM]; récepteur NMDA: D-AP5 [50 uM]) pour révéler la CISP monosynaptique isolé (Figure 3C, supérieur au milieu). Isoler davantage l'IPSC GABA B R-médiation avec l'application d'un bloqueur GABA A R (gabazine [10 uM]; figure 3C de l milieutournesol).
- Confirmez la résultante lente courant sortant (figure 3C inférieur, élargi) comme étant GABA B R-médiée par l'application ultérieure de CGP-55845 [5 uM] (figure 3C inférieur, reposant en gris)
5. jumelés enregistrements de synapses couplés FS-IN et CA1 PC
- Évaluer le contrôle présynaptique GABA B R médiation de la transmission synaptique inhibitrice des enregistrements simultanés, réalisées entre synapses couplés paires IN et PC comme décrit ci-dessous.
- Tout d'abord, établir un enregistrement cellule entière d'une interneurones présynaptique (comme dans la section 3) et confirmer le phénotype de FS (figure 4A).
- Puis de relier un PC CA1 voisin (20-100 um Distance, figure 4A) et exercez une brève dépolarisation supraliminaire impulsions de courant (1 msec, 1-5 nA amplitude) à la présynaptique IN (tenue en mode courant-clamp) pour obtenir des points d'accès. Si un co synaptiquennection est présent, les points d'accès dans le résultat IN dans CISP dans le CA1 PC, qui s'est tenue en tension de serrage (compenser R S à environ 80%).
- Si nécessaire, remplir une nouvelle électrode d'enregistrement et enregistrer à partir d'autres ordinateurs CA1 jusqu'à ce qu'une connexion soit trouvée.
- Une fois la connexion établie, obtenir des paires de points d'accès dans le présynaptique FS-IN pour évaluer à la fois la réponse synaptique unitaire et le comportement dynamique. Utilisation d'un protocole typique double choc de deux stimuli dépolarisants avec un intervalle de 50 ms (figure 4B).
- Recueillir des traces de contrôle dans les conditions de base. Ensuite, appliquer les baclofène R agonistes GABA B sélectifs (10 uM) à l'ACSF perfusion, activant ainsi GABA B Rs, suivis par l'antagoniste CGP-55845 (5 M), pour bloquer complètement les effets des récepteurs médiation. Recueillir ~ 50 traces pendant l'état d'équilibre de chaque condition de drogue (figure 4B et C).
- Une fois l'enregistrement terminé, sceller la membrane somatique en formant un outside-out patch: retirer lentement la pipette à partir du corps de la cellule en V-clamp et les R S augmente, réduire le V M à -40 mV. Pour ce faire, afin de faciliter la formation du patch outside-out; puis retirer la pipette de la salle de bain.
6 Analyse des propriétés électrophysiologiques
- REMARQUE: Une multitude de logiciels différents sont disponibles pour l'acquisition de données électrophysiologiques. Ici, WinWCP, un programme Windows dans le forfait gratuit Strathclyde électrophysiologie logiciel est utilisé, ce qui permet d'enregistrer jusqu'à 16 canaux d'entrées analogiques et une sortie de 10 signaux numériques.
- Filtre passe-bas de toutes les données à 5-10 kHz et à 20 kHz échantillon.
- Analyser les données physiologiques avec une analyse bains hors ligne.
REMARQUE: Stimfit, un logiciel open source qui comprend une enveloppe de Python, est utilisé dans ce cas; cependant, d'autres alternatives peuvent facilement être utilisés à la place.- Analyser passive membrane propriétés des neurones enregistrées, acquises en pince ampèremétrique, du potentiel de membrane au repos.
- Mesurer la moyenne du potentiel de membrane au repos de la ligne de base des réponses enregistrées à partir du début de l'enregistrement.
- Calculer la résistance d'entrée, en utilisant la loi d'Ohm, à partir de la réponse de tension à la plus petite des impulsions de courant d'hyperpolarisation (≤ -50 Pa). Pour améliorer le rapport signal sur bruit, des traces multiples moyens. Remarque: les exemples sont généralement des moyennes de 10-50 balayages individuels.
- Estimer le temps de membrane apparente constante en ajustant une courbe monoexponentielle à la désintégration des réponses aux petites impulsions de courant hyperpolarisants.
- Analyser l'action onde potentiel pour déterminer le seuil, amplitude (seuil à crête) et la durée (largeur mesurée à mi-hauteur) provoquée par niveau de seuil de dépolarisation des impulsions de courant.
- Analyser GABA B R CISP médiation à partir d'enregistrements tension de serrage. Filtre retrace off-line à500 Hz (filtre gaussien) et d'évaluer l'amplitude de crête et la latence de la réponse à médiation par GABA B de R (en moyenne d'au moins 10 traces).
- Détecter l'effet de GABA B Rs inhibitrice sur la production de IN comme un changement dans l'amplitude de crête des CPSI GABA A R médiées mesurées entre le pic et le niveau de référence précédent. Calculer l'amplitude moyenne de ≥50 traces de la période de contrôle et l'état d'équilibre de toutes les époques pharmacologiques.
7 Visualisation et Immunocytochemistry de FS-Ins
- Après les enregistrements, fixer les tranches par immersion dans du paraformaldéhyde 4% avec 0,1 M de tampon phosphate (PB, pH = 7,35) O / N à 4 ° C.
- Si les tranches nécessaires peuvent être transférées à PB et stockés jusqu'à environ 1 semaine avant le traitement.
- Tranches Laver abondamment à PB frais et suite à 0,025 M PB NaCl à 0,9% (PBS, pH = 7,35).
- Pour réduire anticorps liaison non spécifique, bloquer les tranches for 1 heure à température ambiante dans une solution contenant 10% de sérum normal de chèvre (NGS), 0,3% de Triton-X100 (un détergent pour perméabiliser les membranes) et 0,05% de NaN3, composé dans du PBS.
- Pour étiqueter l'expression de PV, en utilisant un anticorps monoclonal de souris anti-PV dilué dans une solution contenant 5% de NGS, 0,3% de Triton-X100, 0,05% de NaN3 dans du PBS. Incuber les anticorps primaires pendant 2-3 jours à 4 ° C 12. Rincer soigneusement les tranches dans du PBS.
- Appliquer des anticorps secondaires anti-souris fluorescents (par exemple, AlexaFluor-546.) Avec la streptavidine-protéine de liaison de biotine conjugué à un fluorochrome (par exemple, AlexaFluor-647); et incuber dans une solution contenant 3% de NGS, 0,1% de Triton-X100, 0,05% de NaN3, dilué dans du PBS et incubation O / N à 4 ° C.
- Rincer généreusement les tranches 2-3 fois avec du PBS suivi par 2-3 rinçages dans PB. Montez les tranches sur des lames de verre. Utilisez un 300 um agar entretoise pour empêcher la tranche de s'effondrer. Tranches lamelle avec un fluocent milieu de montage et joint avec vernis à ongles.
8. imagerie et la reconstruction de Visualized FS-Ins
- Visualisez les tranches à l'aide d'un microscope confocal à balayage, avec le journaliste fluorochome excité avec la ligne laser approprié (diode laser 635 nm pour AlexaFluor-647; hélium-néon 543 nm pour AlexaFluor-546 étiquetage des PV et Argon 488 ou 515 nm pour Venus / YFP).
- Prendre des images à une résolution en Z approprié (typiquement de 0,5 à 1 um d'étapes, en utilisant un objectif 20X) afin de produire une pile en Z de la cellule entière. Piles multiples sont normalement requis pour l'image de la cellule entière, qui peut être numériquement cousu hors ligne à l'aide FIDJI / logiciel ImageJ (figure 5A).
- Reconstruire la cellule de la pile d'images cousu au moyen d'une méthode de suivi semi-automatique (simple plug-in Neurites Tracer dans le progiciel FIDJI / ImageJ 17, Figure C).
- Enfin, évaluer le PV-immunoréactivité de l'interneuron avec une lentille d'objectif à grande ouverture numérique (60X silicium-immersion, NA = 1,3). Faire des images de la soma, dendrites proximales et axone proximal, ou encore de terminaisons axonales si lavage somatique de PV est trop fort. Les cellules sont considérées comme immunoréactive pour PV si l'immuno-marquage est visible à aligner avec les structures de biocytine marquée (Figure 5B).
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Representative Results
À condition que la qualité de coupe est sensiblement bon, l'enregistrement à la fois CA1 PC et FS-IN peut être réalisé avec un minimum de difficultés. La ligne de rat transgénique exprimant Vénus / YFP sous le promoteur de VGAT 13 ne permet pas d'identifier sans équivoque FS-IN, voire BC. Cependant enregistrements de IN dans et autour de str. pyramidale, où la densité de FS-IN est généralement élevé 1, entraîne une forte probabilité de sélection FS-IN (figure 2B). FS-ins peuvent être distingués par leurs propriétés physiologiques caractéristiques différentes de celles des deux PC CA1 et RS-ins. Ils ont une membrane relativement dépolarisé potentiel de repos (-58,9 ± 1,5 mV, 15 cellules, contre -62,6 ± 1,1 mV dans CA1 PC, 26 cellules), faible résistance d'entrée (92 ± 12 vs 103 ± MQ 14 MQ dans les PC) et apparente constante de temps membranaire rapide (15,4 ± 2,6 ms vs 22,0 ± 2,7 ms à PC), résultion en réponse rapide de la tension à l'hyperpolarisation des impulsions de courant (Figure 2F). FS-IN expulsé très brèves potentiels d'action (0,38 ± 0,01 ms) de relativement faible amplitude (82,8 ± 1,0 mV), suivie par afterhyperpolarization rapide très importante (amplitude moyenne de 22,6 ± 2,9 mV). En réponse à des impulsions de courant à grande dépolarisants (250 Pa), FS-IN tiré à hautes fréquences (82 ± 10 Hz; Portée: 34 à 128 Hz; figure 2D, à gauche).
Pour évaluer GABA B courants postsynaptiques R médiation dans FS-ins, les réponses synaptiques pharmacologiquement isolés ont été provoquées par la stimulation extracellulaire de fibres inhibitrices de la str. radiatum / lacunosum-moleculare frontière. figure 3 montre un exemple d'un FS-A, dans lesquelles le blocage séquentiel des composantes de la réponse synaptique composé isole le monosynaptique R médiée par le GABA B CISP lente. Les réponses synaptiques étaient elicité par des stimuli ou des trains de stimuli 3-5 (intensité de 50 V, 0,1 msec, livré à 200 Hz) à la str simples. lacunosum-moleculare / radiatum frontière (figure 3A). La réponse du composé initial, y compris des composants à la fois excitateurs et inhibiteurs (figure 3C, en haut) a été fortement réduite par l'application de bain de antagonistes AMPA et NMDA récepteurs (DNQX, 10 uM et AP-5, 50 uM, respectivement: la figure 3C, milieu). Le résidu monosynaptique IPSC comprend un début rapide courant entrant (un intérieur Cl putatif - courant médiatisés au potentiel de maintien -65 mV, avec un potentiel d'inversion de l'ordre de -60 mV, dans ces expériences) et un courant sortant lent (médiée par un putatif conductance K + avec une inversion potentiel proche de 100 mV). Application de la sélective GABA A R antagoniste gabazine (SR-95531, 10 M) a aboli la IPSC rapide, laissant uneisolé la lente GABA B R médiation IPSC (figure 3C, en bas, trace noire); qui a été observée en réponse à une stimulation unique, mais plus clairement en réponse à des stimuli de trains courts. Cette réponse a été confirmé en tant que R-activé GABA B conductance K +, comme il a été bloqué par l'antagoniste puissant et sélectif CGP-55845 (CGP, 5 pm, la figure 3C, en bas, trace grise). FS BC montrent généralement de grandes CISP R médiation amplitude GABA B, tel que montré dans notre récente publication 12.
Pour évaluer la réglementation présynaptique de la FS-IN Sortie d'inhibition par le GABA B Rs, enregistrements appariés ont été réalisées à partir des synapses couplés FS-IN et CA1 PC. Connectivité synaptique entre les FS BC et PC CA1 est relativement élevé, comme montré précédemment 1,3. Dans ces enregistrements, comme indiqué précédemment, le couplage probabilité est supérieure à 50% entre les paires de cellules situées près (≤50 pm;
Une fois l'enregistrement achevé, un patch outside-out formé avec succès, les tranches ont été fixées pendant la nuit et ensuite traitées pour visualiser et analyser la morphologie des cellules enregistrées et déterminer leur teneur en marqueur neurochimique. Figure 5A illustre la morphologie d'un représentant FS BC dans une projection de piles d'images combinées obtenues sur un microscope confocal. L'expression de la cellule de PV a été confirmée par marquage immunocytochimique qui a donné un signal clair immuno-dessus du corps de la cellule et les dendrites proximales de l'enregistrement et de la biocytine cellule marquée (Figure 5B). Reconstruction tridimensionnelle de la cellule a été effectuée à partir de piles d'images cousues à l'aide du plug-in simple Neurites Tracer dans le logiciel FIDJI (figure 5C) 17. L'axone a montré une forte densité de collatéraux dans et près de la str. pyramidale avec &# 8220; paniers »formés autour du soma de CA1 PC (figure 5A, encart), l'identification putative cette cellule comme la Colombie-Britannique. En outre, la localisation de la soma près de str. pyramidale et les dendrites orientés radialement couvrant toutes les couches de la CA1 correspondent bien à la caractéristique typique morphologique de FS BC 10.
En résumé, dans les enregistrements de cellules entières obtenues à partir identifié FS PV + BC, nous avons démontré que ces cellules expriment de grandes amplitude GABA B CISP lents R médiation et leur production synaptique est également fortement inhibée par l'activation de pré-synaptiques GABA B Rs.
Figure 1: Préparation de coupes d'hippocampe de courte durée. (A) de cerveau de rat fraîchement découpé. Notez la glace qui entoure le cerveau, le maintienla température de l'ensemble du cerveau près de 0 ° C. (B) coupe de 300 um coupes d'hippocampe sur un vibratome Leica VT1200S. Les hémisphères sont alignés de telle sorte que la surface corticale est coupé en premier. Notez la grande quantité de glace fondante entourant les hémisphères et le carbogenation constante de l'ACSF glacé (flèche). (C) Après avoir coupé les tranches de cerveau sont déplacés vers réchauffé saccharose ACSF. Les tranches ont été remis et parés pour éliminer le cerveau antérieur et le mésencéphale, ne laissant que l'hippocampe et le cortex sus-jacente.
Figure 2: cellules entières enregistrement patch-clamp de interneurones. (A) La configuration d'enregistrement autour de la chambre. Notez l'entrée et la sortie se trouvent sur des côtés opposés de la chambre à proximité de réaliser un écoulement laminaire. Également visibles sont la recording électrodes, monté sur les headstages, et les électrodes de masse sur les deux côtés, ainsi que l'objectif d'image épifluorescent faible puissance du signal / YFP VGAT-Vénus (40X, l'eau-de l'immersion) au milieu. (B) la CA1 de l'hippocampe dans une tranche (C). d'imagerie IR-DIC de la même zone. Les flèches B et C montrent un interneurone positif Vénus / YFP dans la couche de corps cellulaire. (D) des images IR-DIC haute puissance du soma du neurone indiqué dans la partie B, avec un timbre proche pipette formant la fossette sur le surface (en haut) et, par la suite, la cellule de la configuration de cellule entière (en bas). (E) Représentation schématique des principales étapes de l'établissement d'un ensemble de cellules d'enregistrement patch-clamp (côté gauche) avec les réponses de bande dessinée à une tension d'essai -Pulse contrôle de la résistance à la pointe de la pipette (côté droit). Rangée du haut: la pipette dans le bain loin de la cellule; Moyenne supérieure: formation Fossette, accompagné d'unréduction de l'amplitude de l'impulsion, ce qui indique une augmentation modérée de la résistance. Moyenne inférieure: la formation de joint Giga ohms. A noter que l'amplitude de l'impulsion de courant est considérablement réduite. Seuls les courants capacitifs rapides sont visibles au début et à la fin de l'impulsion avant de pipette capacité est compensée. En bas: la configuration d'enregistrement cellules entières est obtenue en brisant la pièce de membrane sous la pointe de la pipette. Notez que les grandes, mais relativement lents courants capacitifs au début et à la fin de l'impulsion avant compensation de la résistance série est appliquée. (F) des traces représentatives d'un FS-IN (en haut) et CA1 PC (en bas), provoquées par une famille de l'hyper - à dépolarisants impulsions de courant (protocole indiqué ci-dessus). Notez la décharge à très haute fréquence de la FS-A par rapport à la mise à feu beaucoup plus lente du CA1 PC. Encarts à droite: Comparaison de la forme d'onde de l'AP CA1 PC (en haut) et la FS-IN (en bas, en gris, recouvert sur le PC AP en noir), illustrant la différence dans la forme d'onde de l'AP et le PLA.
Figure 3 de dissection pharmacologique de la réponse synaptique composé, à isoler CPSI lentes GABA B-R dans une médiation FS-IN. (A) IR-DIC l'image de la tranche dans la chambre d'enregistrement, avec l'électrode d'enregistrement (Patch) placée à la frontière de la str. oriens (Ori.) et pyramidale (Pyr.) et l'électrode de simulation (Stim) à la frontière de la str. radiatum (. Rad) et lacunosum-moleculare (LM) (B) A gauche:. illustration schématique de la configuration d'enregistrement. A droite: superposition des réponses de tension dans les FS-IN provoquées par une famille de l'hyper à la dépolarisation injections de courant (C) des traces représentatives enregistrées à partir de la FS-IN en réponse à la stimulation extracellulaire.. Top: Le composéréponse synaptique produite dans ACSF normale provoquée par un stimulus unique (50 d'intensité V, 0,1 msec). Moyen supérieur: Isolé monosynaptique IPSC après l'application de bain de DNQX (10 M) et d-AP-5 (50 M). Moyenne inférieure: Les CISP monosynaptiques rapide est bloquée suite à l'ajout de gabazine (10 M) dans le bain. En bas: Un train de stimuli 5 (à 200 Hz) révèle une lente GABA B R médiée CISP (de trace noire) qui est bloqué par l'application ultérieure de CGP (5 uM) pour le bain (de trace de gris superposées).
Figure 4 Analyse de la modulation présynaptique de la transmission synaptique inhibitrice dans un jumelé enregistrement d'un couplé FS-IN et CA1 PC paire. (A) Le panneau de gauche: l'image IR-DIC des deux pipettes d'enregistrement, celui de gauche patché sur le FS-IN à la frontière de la < em> str. oriens (Ori.) et pyramidale (Pyr.) et le droit patché sur un PC CA1 plus proche de la str. radiatum (Rad.). Panneau de droite:. Un schéma de la configuration de l'enregistrement, avec les réponses de tension représentatifs de la FS-IN (à gauche) et CA1 PC (à droite) à une famille d'impulsions de courant (B) des traces représentatives montrant les points d'accès provoquées dans les présynaptiques FS-IN (en haut) et l'IPSC courte latence unitaire dans le CA1 PC (en bas) dans des conditions de contrôle (traces sur la gauche), après application de bain de baclofène (10 uM, milieu), et l'application ultérieure de CGP (5 uM, à droite) . Notez que le baclofène réduit l'amplitude IPSC par ~ 50%, tandis que le CGP a donné lieu à une récupération quasi complète de l'amplitude IPSC. traces de contrôle sont sous-tendues. (C) Temps cours parcelle de l'amplitude IPSC montre l'effet du baclofène et CGP. CISP ont été enregistrés à 10 secondes d'intervalle.
Figure 5 visualisation, la reconstruction et l'identification immunocytochimique d'un FS-BC biocytine marquée enregistrée. (A) Une projection de piles cousus d'images d'un FS-IN imagé avec un objectif 20X sur un microscope confocal. Le corps cellulaire est situé à la frontière de la str. radiatum (Rad.) et pyramidale (Pyr.) de la zone CA1, les dendrites courent radialement et couvrent toutes les couches, tandis que la majorité de l'axone se trouve dans et autour de la couche de corps de la cellule; comme typique des TV. Barre d'échelle: 100 um. En médaillon, en haut à droite: projection de grossissement d'un 20 couches, montrant des paniers typiques de l'axone formant autour putatif PC soma CA1 (astérisques oranges). Barre d'échelle:. 10 pm (B) Le corps de biocytine rempli cellule de l'EN (pseudo couleurs blanc, panneau inférieur, flèche) montre immunoréactivité pour PV (en vert, panneau supérieur). Échellebar. pm 20 (C) la projection de la reconstruction en 3 dimensions de la cellule. Le soma et des dendrites sont en noir et l'axone de couleur rouge. Couches de CA1 sont délimitées en bleu. Abréviations: Ori, str. oriens; LM, str. lacunosum-moleculare. Barre d'échelle: 100 um.
| Nom | Composition (mM) | Utilisation | Remarques |
| Saccharose-ACSF | 87 NaCl, KCl 2,5, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 glucose, saccharose 75, 7 MgCl2, 0,5 CaCl2, 1 Na-pyruvate, 1 Na-ascorbate | Préparation et stockage des tranches de cerveau | pH = 7,4; osmolarité = 350 mOsm ~ |
| ACSF enregistrement | 125 NaCl, KCl 2,5, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 glucose, 1 MgCl | Enregistrement à partir de tranches de cerveau | pH = 7,4; osmolarité = 310-315 mOsm |
| Solution intracellulaire (1) | 125 K-gluconate, 10 KCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 MgCl 2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-phosphocréatine et 0,1% biocytine | Remplissage électrodes d'enregistrements GABAB IPSC | pH = 7,4; osmolarité = 295-305 mOsm |
| Solution intracellulaire (2) | 105 K-gluconate, 40 KCl, 10 HEPES, 0,1 EGTA, 2 MgCl 2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-phosphocréatine et 0,1% biocytine | Remplissage des électrodes pour les enregistrements appariés | pH = 7,4; osmolarité = 295-305 mOsm |
| Tampon phosphate (PB) | 100 mM NaH 2 PO 4 | Rinçage tranches fixes | pH = 7,4 |
| Une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | 25 mM NaH 2 PO 4 </ Sub>, 154 mM de NaCl (0,9% p / v) | Rinçage des tranches fixes et anticorps incubation | pH = 7,4 |
| Paraformaldéhyde fixateur | 4% p / v de paraformaldehyde, 0,1 mM PB | Fixation de tranches de cerveau | pH = 7,4 |
Tableau 1. liste des solutions.
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Discussion
Nous décrivons une méthode qui combine des techniques de neuro-anatomiques et électrophysiologiques à la caractérisation fonctionnelle des neurones morphologically- et neurochimique identifiés in vitro; notamment les divers types de IN inhibiteurs corticaux. Les principaux aspects de la procédure sont les suivantes: (1) pré-sélection des potentiels IN; (2) l'enregistrement intracellulaire et le neurone visualisation; et enfin (3) l'analyse morphologique et immunocytochimique de IN enregistrées. Bien que cette étude a abordé PV-IN en particulier, le protocole décrit peut être utilisé pour les enregistrements similaires de toute interneurones ou d'autres types de neurones, avec un minimum de modifications.
Le nombre relativement faible des interneurones dans les zones corticales rend la sélection aléatoire et l'enregistrement de ces cellules hautement inefficaces. Localisation divergent et les caractéristiques morphologiques ont permis aux chercheurs de distinguer et d'enregistrer régulièrement de certains types de interneurones. Cependant, en tranches, l'identification de stagiaireeurons dans et à proximité des couches de corps de la cellule reste difficile, comme avec FS-ins. L'avènement des lignées de souris transgéniques, exprimant les protéines fluorescentes dans des interneurones populations spécifiques offre une solution élégante qui permet de pré-sélection et l'enregistrement de ces neurones beaucoup plus efficaces 2. Maintenant, beaucoup de lignées transgéniques, principalement des souris, mais aussi de plus de 13 rats sont disponibles, faciliter la recherche des interneurones. Lors de l'utilisation de lignées transgéniques, cependant, il est essentiel d'établir l'étendue et la spécificité de l'expression de rapporteur.
La qualité du marquage et de la morphologie cellulaire, ainsi que l'enregistrement électrophysiologique, dépendra essentiellement de la viabilité, des tranches de qualité; dont le cerveau a besoin d'être disséqué rapidement (idéalement 20-40 sec), manipulés très soigneusement et continuellement refroidie. Nous avons constaté que l'utilisation du saccharose-ACSF, de sorte que la concentration en sodium, et donc l'ensemble de l'excitabilité des neurones est réduit, dramequement améliore la qualité de la tranches et interneurones survie 18. Toutefois, il convient de souligner que de nombreux chercheurs ont fait usage de l'ACSF d'enregistrement standard pour la préparation de tranche, à grand effet 10,11,15. Intégrité morphologique dépend fortement de l'angle sous lequel les tranches sont coupées 13; qui varie selon la région et le type de cellule. Cependant, de nombreux interneurones peuvent être enregistrés de manière fiable à partir de tranches transversales, coronales ou sagittales. Pour réduire davantage la rupture des dendrites et des axones, des cellules plus profondément dans le tissu doivent être ciblés, mais sacrifier la qualité et la fiabilité de la formation de joint giga-ohms IR-DIC. Dans ces circonstances, les enregistrements des deux cellules et pyramidales CA1 FS-ins peuvent être obtenu de façon fiable.
L'étiquetage et la visualisation des neurones est atteint après une session d'enregistrement typique durable 30 min ou plus. Si enregistrements durent moins de 30 min, il est nécessaire de permettre à ce moment avant la fixation pour permettre biocytin de diffuser dans dendritique distale et processus axonales, garantissant un remplissage complet et de visualisation ainsi post-hoc de cellules.
Dans les enregistrements de cellule entière, le maintien de résistances faibles et stables de la série est impératif de mesure physiologique précis des propriétés intrinsèques et synaptiques, ainsi que l'étiquetage approfondie des neurones. Cependant électrodes à faible résistance permettent une dialyse rapide du cytoplasme avec la solution intracellulaire contenu dans la pipette. Complétant la solution intracellulaire avec l'ATP, GTP et phosphocréatine contribue certainement à maintenir l'approvisionnement énergétique et la qualité de l'enregistrement. Toutefois, la dialyse de neurotransmetteurs et de protéines peut conduire à des réponses réduites, réduit la plasticité 19 et peut également entraver l'identification neurochimique. Par exemple, PV est systématiquement éliminé par lavage des neurones au cours de longues expérimentations. Par conséquent, l'examen des processus dendritiques ou axonales distales peut être nécessaire pour DeTe immunoréactivité rmine du neurone enregistré. Dans les cas où cette dialyse est un sujet de préoccupation, des enregistrements à l'aide de la configuration perforée-patch peut être utilisé pour préserver l'environnement intracellulaire 20, mais le patch doit être brisé à la fin des enregistrements ou le neurone suite "repatched" dans la configuration cellule entière pour permettre le remplissage de biocytine.
Enquête pharmacologique des neurones enregistrés est une méthode utile pour évaluer la signification fonctionnelle des mécanismes de neuromodulation divergentes dans l'élaboration de l'activité intrinsèque et synaptique du IN. Dans les procédés décrits ci-dessus, l'isolement pharmacologique et enregistrements appariés sont utilisés pour évaluer les effets de la poste et GABA présynaptique B R-médiation, respectivement; Cependant, on peut facilement modifier la combinaison d'agonistes et d'antagonistes des récepteurs à évaluer le rôle de la famille des récepteurs de substitution, par exemple, le système de 21 cannabinoïdes.
"> Histologique et le traitement immunocytochimique des cellules enregistrées est très fiable, une fois les protocoles sont établis. Le protocole de immunocytochimie décrit ici a été réglé par rapport à la combinaison d'anticorps utilisé, l'épaisseur de la tranche et l'exigence d'identifier le contenu neurochimique. Nous utilisons sérum normal de chèvre que tous les anticorps secondaires utilisés sont élevés chez la chèvre. Comme alternative, il est également possible d'utiliser de l'albumine de sérum bovin (BSA) ou le lait en poudre comme agent de blocage. Il convient de noter que ce protocole utilise un tampon phosphate salin (PBS) de l'anticorps incubation, Cependant en variante, on peut simplement utiliser 0,1 M de PB à la place de PBS. utilisant une concentration relativement élevée de détergent (0,3% de Triton X-100), ne diminue pas l'antigénicité apparente, tout en permettant la pénétration des anticorps dans la 100 première couche um de la surface de la tranche , où les neurones sont systématiquement enregistrés. Si les cellules les plus profondes sont enregistrées, ou les tranches sont plus épaisses, il est conseillé de resectisur les tranches, en utilisant un cryostat ou un vibratome, et effectuer l'immuno-marquage sur les minces (40-70 um) sections. Pour 300 um tranches, un temps d'incubation de l'anticorps (à 4 ° C pour préserver l'intégrité structurale des tranches) produit des résultats très fiables immunocytochimiques.Identification des neurones repose sur la combinaison d'informations obtenues lors de l'enregistrement, la post-hoc morphologique et l'analyse immunocytochimique. Dans l'hippocampe, en raison de l'organisation laminaire strict, la distribution axonale est un bon indicateur des cibles post-synaptiques d'interneurones. Axone ou des dendrites rompu, cependant, peut faire difficile l'identification ou impossible. En outre, une certaine ambiguïté demeure, par exemple à différencier PV + BC et des interneurones axo-axoniques, en raison de la similarité dans la localisation axonale globale. Une identification définitive finale exigerait une analyse microscopique électronique de cibles post-synaptiques 1,3 or dissection plus immunocytochimique 22.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Ina Wolter pour son excellente assistance technique. VGAT-Vénus rats transgéniques ont été générées par les Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi et Y. Kawaguchi à l'Institut national de sciences physiologiques, Okazaki, Japon, utilisant pCS2-Vénus fourni par le Dr A. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | see Uematsu , et al., 2008 | ||
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| Dissection tools | i.e. FST | For brain removal | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | Custom-made in lab | ||
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. | |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | Custom made | ||
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | ||
| Isolated constant voltage stimulator |  Digitimer Ltd. |
DS-2A | |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5,000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | Any high quality brand | ||
| Glass coverslips | Usually 22 x 22 mm | ||
| Agar spacers | Agar block, cut on vibratome to 300 μm | ||
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | See Schindelin et al., 2012 |
References
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