Summary
Kortikaler Netzwerke werden von einem kleinen, aber vielfältige Reihe von hemmenden Inter gesteuert. Funktionelle Untersuchung von Inter erfordert daher gezielte Aufnahme und strenge Identifizierung. Hier beschrieben wird, ist ein kombinierter Ansatz, der Ganzzellableitungen von einzelnen oder synaptisch gekoppelten Paare von Neuronen mit intrazelluläre Markierung, Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse.
Abstract
GABAergen inhibitorischen Inter spielen eine zentrale Rolle in neuronalen Schaltkreisen des Gehirns. Inter umfassen eine kleine Teilmenge der neuronalen Population (10-20%), zeigen aber eine hohe physiologische, morphologische und neurochemische Heterogenität, was ihre vielfältigen Funktionen. Daher Untersuchung von Inter bietet wichtige Einblicke in die Organisationsprinzipien und Funktion neuronaler Schaltkreise. Dies erfordert jedoch einen integrierten physiologischen und neuroanatomische Ansatz für die Auswahl und Identifizierung der einzelnen Interntypen. Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen von akuten Hirnschnitten von transgenen Tieren exprimieren fluoreszierende Proteine unter den Promotoren von Internspezifische Marker, ein effizientes Verfahren zur gezielten elektrophysiologisch zu charakterisieren intrinsischen und synaptischen Eigenschaften bestimmter Interntypen. Verbindung mit intrazellulären Farbstoff Kennzeichnung kann dieser Ansatz mit post-hoc mo verlängertrphological und immunzytochemische Analyse zur systematischen Identifizierung von aufgezeichneten Neuronen. Diese Verfahren können angepaßt werden, um eine breite Palette von wissenschaftlichen Fragen zu funktionellen Eigenschaften der verschiedenen Arten von kortikalen Neuronen entsprechen.
Introduction
Hippocampus neuronale Schaltkreise sind seit langem Gegenstand intensiver Kontrolle, sowohl in Bezug auf die Anatomie und Physiologie, die aufgrund ihrer wesentlichen Rolle bei Lernen und Gedächtnis sowie räumliche Navigation bei Mensch und Nager. Ebenso die prominenten, aber einfache laminare Organisation des Hippocampus macht diese Region zu einem beliebten Thema der Studien zu strukturellen und funktionellen Eigenschaften der kortikalen Netzwerke.
Hippocampus-Schaltungen sind von exzitatorischen Hauptzellen (> 80%) und einer kleineren (10-20%), aber sehr unterschiedliche Gruppe von hemmenden Inter 1-3 besteht. Interfrei γ-Aminobuttersäure (GABA) aus ihrer Axonterminalen, die bei schnellen ionotropen GABA A-Rezeptoren wirkt (GABA A Rs) und langsamen metabo GABA-B-Rezeptoren (GABA B Rs) 4. Diese inhibitorischen Mechanismen entgegenzuwirken Anregung und regulieren deren Erregbarkeit der Hauptzellen und damit dieir Timing und Muster der Entladung. GABA von Inter freigegeben wirkt jedoch nicht nur von den Hauptzellen, sondern auch auf die Inter sich 5,6. Pre-und postsynaptischen Rezeptoren vermitteln Feedback-Regulation und hemmenden Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Arten von Interneuron. Diese hemmenden Mechanismen im Intern Netzwerke sind vermutlich zentral für die Erzeugung und Gestaltung der Bevölkerung Aktivitätsmustern, insbesondere Schwingungen zu sein bei verschiedenen Frequenzen 7.
Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine gut etablierte Methode für die Prüfung der Eigenschaften und der synaptischen Interaktion von Neuronen. Aufgrund der hohen Vielfalt Interntypen, die Untersuchung von hemmenden Inter erfordert jedoch strenge Identifizierung der Zellen aufgenommen. Wie Hippocampus Interntypen werden durch verschiedene morphologische Merkmale und neurochemische Marker Ausdruck, kombiniert anatomischen und immunzytochemische e gekennzeichnetxamination kann ein Mittel, um präzise Intern Identität 6,8,9 zu bestimmen.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir einen experimentellen Ansatz, in der Ganzzell Patch-Clamp-Aufnahmen von einzelnen Neuronen oder synaptisch gekoppelten Paare werden mit intrazelluläre Markierung kombiniert, gefolgt von Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse, so dass für die Charakterisierung von langsam GABA B Rezeptor-vermittelte hemmende Wirkung in Inter identifiziert. Als ein Beispiel, konzentrieren wir uns auf eine wichtige Art der Intern, einer Untergruppe der so genannten "Korbzellen" (BC), die die Soma und proximalen Dendriten der postsynaptischen Zielinnerviert und wird von einem "schnellen Spick" (FS) gekennzeichnet entladen Muster, ein Axon dicht auf den Zellkörperschicht, und die Expression des Calcium-bindende Protein Parvalbumin (PV) 10,11. Diese Inter anzuzeigen große postsynaptischen inhibitorischen Ströme, sowie prominente vorgesynaptischen Modulation der synaptischen Ausgang in Reaktion auf GABA B-Aktivierung R 12. Die Kombination der hier beschriebenen Techniken können ebenso gut eingesetzt werden, um intrinsische oder synaptischen Mechanismen in einer Vielfalt von anderen identifizierten Neuron Typen zu untersuchen.
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Protocol
Ethikerklärung: Alle Verfahren und Tier Wartung wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt, die deutsche Tierschutzgesetz hat der Europäische Rat die Richtlinie 86/609 / EWG über den Schutz von Tieren und Richtlinien von den lokalen Behörden (Berlin, T-0215/11 )
1. Herstellung der Akute-Hippocampus
- Nehmen Sie ein transgenes Ratten (17 bis 24 Tage alt), die Leuchtstoff Venus / YFP Protein unter der VGAT Promotor, der die Mehrheit der kortikalen inhibitorischen Inter 13 Etiketten zum Ausdruck. Enthaupten die Ratte. Rasch zerlegen Gehirn (<40 sec) in semifrozen, carbogenated (95% O 2/5% CO 2) auf Basis Saccharose künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF Saccharose, 1A).
- Bewerten Sie die sezierten Rattenhirn für Venus / YFP Fluoreszenz mit einer 505 nm LED-Lampe und Emissionsfilter 515, auf einer Schutzbrille angebracht.
- Entfernen Sie die Front Drittel des Kortex und Cerebellum; dann trennen die Halbkugeln, die alle mit einem Skalpell. Entfernen Sie die Rückenfläche des Kortex um eine flache Oberfläche, um das Gehirn zu kleben nach unten zu schaffen, wie zuvor beschrieben 14.
- Geschnitten Querschnitt (300 um) des Hippocampus auf einer Vibratom sollten die Halbkugeln mit semifrozen umgeben sein, carbogenated Saccharose-ACSF (1B) 14. Entfernen Sie zusätzliche Regionen rostral Kortex, Mittelhirn und Hirnstamm. Übertragen Sie jede Scheibe zu einem untergetauchten Haltekammer, die Saccharose-ACSF, die carbogenated und erwärmt auf 35 ° C.
- Lassen Sie die Scheiben bei 35 ° C für 30 min von der Zeit der letzten Scheibe in die erwärmte ACSF erholen. Tun Sie dies, um Stoffwechselprozesse zu aktivieren und erleichtern die Wiederverschließen geschnitten neuronale Prozesse. Dann übertragen auf Raumtemperatur für die Lagerung (Abbildung 1c).
2. Herstellung und Abfüllung von Aufnahme-Pipetten
- Pull Patchpipetten von Glaskapillaren, so dass eine Pipette Widerstand von 2-4 MOhm wird erreicht, wenn mit filtriert gefüllt (Spritzenfilter, Porengröße: 0,2 um) die intrazelluläre Lösung, die 0,1% Biocytin (für intrazelluläre Markierung). Halten Sie die intrazelluläre Lösung auf Eis gekühlt, um den Abbau seiner Bestandteile zu verhindern.
- Füllen Patch-Pipetten zur Identifizierung von postsynaptischen Ströme mit einer Lösung, die eine physiologisch relevante niedrigen Cl - Konzentration (E R (Cl) = -61 mV, siehe Lösung Liste).
- Für gepaarte Aufnahmen auf der präsynaptischen Rezeptor-vermittelten Reaktionen zu identifizieren, füllen Patch-Pipetten mit intrazellulären Lösung mit niedrigen Ca2 +-Pufferkapazität, um Interferenzen mit Transmitterfreisetzung präsynaptisch zu verhindern, sowie 4-fach höhere Cl - Konzentration (E R (Cl) = -20 mV) zur Verbesserung der Signal-zu-Rauschen der beobachteten IPSCs 5 was eine genaue Beurteilung der pharmakologischen bzw.onsiveness. Beachten Sie, dass Änderung Cl - Konzentration IPSC-Kinetik 15 ändern.
3. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme von FS-ins
- Carbogenate ACSF und Futtermittel durch das Perfusionssystem zu der Aufzeichnungskammer, mittels einer Schlauchpumpe (der auch entfernt von der Aufzeichnungs ACSF Kammer über eine Saugleitung, Figur 2A). Schalten Sie alle Geräte auf dem Setup in der Vorbereitung für die Aufnahme.
- Übertragen einer Scheibe auf die Aufnahme Kammer und halten Sie ihn mit einem Platin-Ring mit einzelnen Fasern aus Seide bespannt. Positionieren Sie die Scheibe, so dass die Schicht (str.) Pyramidale der CA1 läuft vertikal durch das Sichtfeld, die den Zugang mit 2 Pipetten sowohl auf die str. radiatum und str. Oriens gleichzeitig (2C und 4A).
- Legen Sie die Kammer in das Setup und starten Perfusion carbogenated und erwärmt (32-34 ° C) Aufnahme einesCSF bei einer Flußrate von 5-10 ml / min.
- Beurteilen Scheibenqualität unter IR-DIC-Optik mit 40x Objektivvergrößerung und visualisieren mit einer CCD-Kamera auf einem Display angezeigt. Annehmen gutes Stück Qualität, wenn eine große Anzahl von runden, mäßig gegen CA1-Pyramidenzellen (CA1 PC) in str gesehen werden. pyramidale in einer Tiefe von 20-30 um unter einer glatten und leicht Kraterlandschaft (Abbildung 2C). Schlechte Qualität Scheiben enthalten eine große Zahl von sehr kontrast, geschrumpft oder geschwollene Zellen, mit einer unebenen Oberfläche Scheibe.
- Identifizieren mutmaßlichen FS Inter unter Epifluoreszenz Beleuchtung wie die Venus auszudrücken / YFP (2B), mit großen multipolaren Somata in oder in der Nähe des str. pyramidale. Markieren Sie die Zellen einigermaßen tief in die Scheibe (50-100 um, 2C), um eine bessere Erhaltung ihrer morphologischen Integrität.
- Montieren Sie den Aufnahme-Elektrode in der Pipette Halter auf der heads; dann Apply ein geringer positiver Druck (20-30 mbar) durch die Schlauchleitung. Senken der Pipette auf die Oberfläche der Scheibe, leicht zu dem Zentrum des Neurons ausgewählt versetzt.
- Erhalten whole-cell-Konfiguration wie zuvor beschrieben, und 14,16 siehe auch Bilder in 2D und 2E:
- Zielen auf eine Zelle: Erhöhen Sie den Druck auf 70-80 mbar und schnell senken Sie die Pipette durch die Scheibe, gerade über die Soma der ausgewählten Zelle (Abbildung 2D, oben).
- Nähern Sie sich dem Zell: Drücken Sie die Pipette gegen die Zellmembran erzeugen eine "Delle" auf sie (2D, oben). Führen Sie diesen Schritt schnell, um Biocytin Kennzeichnung von Nachbarzellen zu verhindern.
- Erstellen Sie eine Giga-Ohm-Siegel: Lassen Sie den Druck und gleichzeitig gelten eine 20 mV Spannungsbefehl mit der Pipette. Ein Giga-Ohm-Dichtung (1-50 GOhm; 2D, unten und 2E Mitte) typicVerbündeten entwickelt sich schnell. Einmal versiegelt, gelten die zu erwartende Ruhemembranpotential (typischerweise zwischen -70 und -60 mV) als Spannungsbefehl.
- Durchbrechen Sie den Patch: Einmal versiegelt, reißen die Membran-Patch mit einem kurzen Impuls von Unterdruck; wodurch die Gesamtzellkonfiguration (2E, unten) erreicht wird.
- Ausgleich Ganzzellkapazität und Serienwiderstand (R S). R s ist normalerweise 5-20 MOhm und stabil für bis zu 120 min. Aufzugeben, wenn Zellen Membranpotential (V M) auf Durchbruch ist mehr als -50 mV depolarisiert; R S anfänglich größer als 30 MOhm; oder R S um mehr als 20% im Verlauf der Aufzeichnung.
- Identifizieren FS-Ins durch ihre Reaktion (im Current-Clamp-Modus) zu einer Familie von Hyperstromimpulse depolarisierende (-250 bis +250 pA, 2F, oben). FS-Ins haben relativ Verzehr V M (typischerweise -50 to -60 mV), kurze Membranzeitkonstante (<20 ms) und auf einem 500 pA depolarisierende Strominjektion mit einem Zug von Aktionspotentialen (APs) bei Frequenzen> 100 Hz 11 (2F, unten), die deutlich sind von denen in CA1 PCs (2F, Mitte).
4. Extrazelluläre Elektrostimulation GABA B R-vermittelte Antworten Evoke
- Um synaptisch hervorgerufenen Reaktionen zu beobachten, positionieren Sie eine extrazelluläre Stimulationselektrode (eine Patch-Pipette mit 2 M NaCl gefüllt; Widerstand: 0,1-0,3 MQ) in der Scheibe an der Grenze von str. radiatum und str. lacunosum-moleculare. Positionieren Sie die Elektrode 200-300 um lateral der Soma der direkten elektrischen Stimulation der Zelle zu verhindern und zu minimieren Stimulation Artefakten (3A).
- Nachdem der Stimulationselektrode angeordnet ist, zu erhalten, Ganzzell-Aufzeichnungdie gewählte Zelle und Beurteilung der physiologischen Phänotyp in Current-Clamp-Modus, wie in Abschnitt 3.9 (3B).
- Mit dem Neuron in Voltage-Clamp (V M -65 mV) aufgezeichnet, liefern elektrische Stimulation der präsynaptischen Axone bei 50 V (~ 500 uA wirksame Reiz) alle 20 sec, das eine isolierte Konstantspannungs Stimulator. Benutzen Reize (100 us Dauer, 3C, oben) zu GABA B R vermittelten IPSCs beobachten und zu verschachteln mit Zügen von mehreren Stimuli (bei 200 Hz) zu mehr Transmitterfreisetzung zu produzieren.
- Bad gelten ionotropen Glutamat-Rezeptor-Antagonisten (AMPA-Rezeptor: DNQX [10 uM]; NMDA-Rezeptor: D-AP5 [50 uM]), um die isolierte monosynaptische IPSC (3C, in der Mitte oben) zu offenbaren. Ferner isolieren die GABA-vermittelte Ik R unter Anwendung eines GABA A R Blocker (gabazine [10 uM], 3C Mitte lower).
- Bestätigen Sie die resultierende langsam Auswärtsstrom (3C niedriger, erweitert) als GABA B durch die anschließende Anwendung von CGP-55845 [5 uM] (3C unteren, grau unterlegt) R-vermittelten
5. Gekoppelte Aufnahmen von Synaptisch Gekoppelt FS-IN und CA1-PCs
- Beurteilen GABA B R-vermittelten präsynaptischen Steuerung inhibitorische synaptische Übertragung bei gleichzeitiger Aufnahme zwischen synaptisch-gekoppelt und PC Paaren durchgeführt, wie unten beschrieben.
- Zuerst stellen Sie eine Ganzzell Aufnahme einer präsynaptischen Intern (wie in Abschnitt 3) und bestätigen Sie den FS-Phänotyp (4A).
- Dann patchen eine benachbarte CA1 PC (20-100 um Abstand, 4A) und gelten kurze überschwelligen depolarisierende Strompulse (1 ms Dauer, 1-5 nA Amplitude) mit der präsynaptischen IN (in Current-Clamp-Modus gehalten werden), um APs zu entlocken. Wenn einem synaptischen Connection vorhanden ist, APs in der IN-Ergebnis in IPSCs in der CA1-PC, der Spannung-Klammer gehalten (Ausgleich R S bis etwa 80%).
- Wenn nötig, füllen Sie eine neue Aufnahme-Elektrode und Datensatz aus weiter CA1-PCs, bis eine Verbindung gefunden.
- Sobald eine Verbindung hergestellt ist, entlocken Paare von APs in der präsynaptischen FS-IN, sowohl die synaptische einheitliche Reaktion und das dynamische Verhalten zu beurteilen. Verwenden Sie einen typischen gepaart Puls-Protokoll von 2 depolarisierende Stimuli mit einer 50 ms-Intervall (4B).
- Steuer sammeln Spuren im Ausgangsbedingungen. Dann gelten die selektiven GABA B-Agonisten Baclofen R (10 uM), um die Perfusion von ACSF aktiviert somit GABA B Rs, gefolgt von der Antagonist CGP-55845 (5 uM), um vollständig blockieren die Rezeptor vermittelten Wirkungen. Sammeln ~ 50 Spuren im stationären Zustand jedes Medikament Zustand (4B und C).
- Sobald die Aufnahme abgeschlossen ist, dichten die somatischen Membran durch die Bildung eines outside-out-Patch: Ziehen Sie langsam die Pipette aus dem Zellkörper in V-Klemme und wie die R S steigt, verringern Sie die V bis -40 mV M. Tun dies, um die Bildung der Outside-out-Patches zu erleichtern; entfernen Sie dann die Pipette aus dem Bad.
6. Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften
- HINWEIS: Eine Vielzahl von verschiedenen Software-Pakete sind für den Erwerb von elektrophysiologischen Daten verfügbar. Hier WinWCP, ein Windows-Programm in der freien Software-Paket Strathclyde Elektrophysiologie verwendet, die Aufzeichnung von bis zu 16 Analogeingangskanäle und Ausgangs von 10 digitalen Signalen ermöglicht.
- Tiefpassfilter alle Daten bei 5-10 kHz und Probe bei 20 kHz.
- Analyse physiologischer Daten mit einer Offline-Analyse-Suite.
HINWEIS: Stimfit, ein Open-Source-Software-Paket, das eine Python-Shell wird in diesem Fall verwendet wird, beinhaltet; aber andere Alternativen können leicht stattdessen verwendet werden.- Analysieren Passivmembran pigenschaften der aufgezeichneten Neuronen, in Stromzange erworben, von Ruhemembranpotential.
- Messung der mittleren Ruhemembranpotential von der Grundlinie der aufgezeichneten Antworten von dem Beginn der Aufzeichnung.
- Berechnen Eingangswiderstand unter Verwendung des Ohmschen Gesetzes, aus der Spannung als Reaktion auf die kleinste Hyperpolarisierungsstromimpulse (≤ -50 pA). Zur Verbesserung der Signal-Rausch-Verhältnis, durchschnittlich mehrere Spuren. Hinweis: Unsere Beispiele sind in der Regel Durchschnittswerte von 10-50 einzelnen Sweeps.
- Schätzen Sie die scheinbare Membran Zeit durch den Einbau einer monoexponentiellen Kurve, um den Zerfall der Antworten auf die kleinste Hyperpolarisation Stromimpulse konstant.
- Analysieren Aktionspotential Wellenform Schwelle, Amplitude (Schwelle zur Spitze) und Dauer (Breite gemessen in halber Höhe) von Schwellenwert depolarisierende Stromimpulse ausgelöst bestimmen.
- Analysieren GABA B R vermittelten IPSCs von Voltage-Clamp-Aufnahmen. Filter zeichnet off-line zu500 Hz (Gauß-Filter) und bewertet die Spitzenamplitude und die Latenz des GABA B R vermittelte Reaktion (im Mittelwerte von mindestens 10 Spuren).
- Erkennen die Wirkung von GABA B Rs auf der inhibitorischen Ausgang INs als eine Änderung der Spitzenamplitude des GABA A R-vermittelten IPSCs zwischen Peak und der vorhergehenden Ausgangswert gemessen. Berechnen Sie die mittlere Amplitude von ≥50 Spuren für die Steuerperiode und der stationären aller pharmakologischen Epochen.
7. Visualisierung und Immunocytochemistry der FS-Ins
- Nach den Aufnahmen, fixieren die Scheiben durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB, pH = 7,35) O / N bei 4 ° C.
- Ggf. Scheiben kann PB für bis zu ca. 1 Woche vor der Verarbeitung übertragen und gespeichert werden.
- Wasch Scheiben reichlich frische PB und anschließend in 0,025 M PB mit 0,9% NaCl (PBS, pH = 7,35).
- Um nicht-spezifische Antikörper Bindung zu reduzieren, blockieren die Scheiben for 1 h bei RT in einer Lösung mit 10% normalem Ziegenserum (NGS), 0,3% Triton-X100 (ein Detergens, Membranen durchdringbar) und 0,05% NaN 3 in PBS hergestellt.
- Für PV Ausdruck kennzeichnen, verwendet eine Anti-PV monoklonalen Maus-Antikörpers in einer Lösung, die 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN 3 in PBS verdünnt. Inkubieren Primärantikörper für 2-3 Tage bei 4 ° C 12. Spülen Sie gründlich in PBS Scheiben.
- Anwenden fluoreszierenden Anti-Maus-Sekundärantikörper (zB AlexaFluor-546.) Zusammen mit dem Biotin-Bindungsprotein Streptavidin, konjugiert an ein Fluorochrom (zB AlexaFluor-647); und Inkubation in einer Lösung, enthaltend 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN 3, verdünnt in PBS und Inkubation O / N bei 4 ° C ist.
- Zügig spülen Scheiben 2-3 x mit PBS, gefolgt von 2-3 Spülungen in PB. Montieren Sie die Scheiben auf Glasobjektträger. Verwenden Sie ein 300 um Agar Abstandshalter an der Scheibe vor dem Kollaps zu verhindern. Deckglas Scheiben mit einer LeuchtstoffCent Montagemedium und Dichtung mit Nagellack.
8. Imaging und Rekonstruktion der Visualisierte FS-Ins
- Visualisieren Sie die Scheiben mit einem konfokalen Mikroskop, mit dem Reporter aufgeregt fluorochome mit der entsprechenden Laserlinie (635 nm Diodenlaser für AlexaFluor-647; Helium-Neon-543 nm-546 für AlexaFluor Kennzeichnung für PV-und Argon 488 oder 515 nm für Venus / YFP).
- Aufnehmen von Bildern an einer geeigneten Z-Auflösung (typischerweise 0,5-1 um Schritte mit einem 20x-Objektiv), um ein Z-Stapel von der ganzen Zelle zu erzeugen. Mehrere Stapel werden üblicherweise Bildes benötigt die gesamte Zelle, die digital off-line unter Verwendung Fiji / ImageJ Software (5A) genäht werden kann.
- Rekonstruieren die Zelle aus dem Bildstapel genäht mit einem halbautomatischen Ablaufverfolgungsmethode (Simple Neuriten Tracer-Plugin in Fiji / ImageJ-Software-Paket 17, Bild C).
- Schließlich bewerten die PV-Immunreaktivität des interneuron mit einer hohen numerischen Apertur Objektivlinse (60X siliciumSion, NA = 1,3). Machen Sie Bilder des Soma, proximalen Dendriten und Axon proximalen oder alternativ von Axonterminalen wenn somatische Auswaschen der PV ist zu stark. Zellen werden als immunreaktiv für PV, wenn Immunmarkierung ist zu sehen, mit den Biocytin-markierten Strukturen (5B) auszurichten.
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Representative Results
Vorausgesetzt, dass Scheibenqualität ist spürbar gut, die Aufnahme von beiden CA1-PCs und FS-Ins können mit minimalen Schwierigkeiten erreicht werden. Die transgenen Rattenlinie, Venus / YFP unter der VGAT Promotor 13 nicht eindeutig identifizieren FS-Ins oder auch BC. Allerdings Aufnahmen von INS in und um str. pyramidale, wo die Dichte der FS-ins ist typischerweise hoch 1, ergibt sich eine hohe Wahrscheinlichkeit der Auswahl FS-Ins (2B). FS-Ins durch ihre charakteristische physiologische Eigenschaften sich von denen der beiden CA1 PCs und RS-Ins unterscheiden. Sie haben eine relativ Verzehrruhemembranpotential (-58,9 ± 1,5 mV, 15 Zellen, gegen -62,6 ± 1,1 mV in CA1-PCs, 26 Zellen), niedrige Eingangswiderstand (92 ± 12 vs 103 MOhm ± 14 MOhm in PCs) und schnelle scheinbare Membranzeitkonstante (15,4 ± 2,6 ms vs 22,0 ± 2,7 msec in PCs), Resulting in schnellen Spannungs Reaktion auf Stromimpulse (2F) Hyperpolarisierung. FS-Ins entladen sehr kurzen Aktionspotentiale (0,38 ± 0,01 ms) mit relativ geringer Amplitude (82,8 ± 1,0 mV), gefolgt von sehr prominenten schnell afterhyperpolarization (mittlere Amplitude 22,6 ± 2,9 mV). In Reaktion auf großen depolarisierende Strompulse (250 pA), feuerte FS-Ins bei hohen Frequenzen (82 ± 10 Hz; Bereich: 34 bis 128 Hz; 2D, links).
GABA B R-vermittelten postsynaptischen Ströme in FS-Ins zu beurteilen, wurden pharmakologisch isolierte synaptischen Antworten durch extrazelluläre Stimulation von hemmenden Fasern an der str ausgelöst. radiatum / lacunosum-Molekulare Grenze. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für ein FS-IN, in dem sequentiellen Blockade der Komponenten der Verbindung synaptischen Reaktion isoliert die monosynaptische GABA B R-vermittelten langsamen Ik. Synaptischen Antworten waren elivon einzelnen Stimuli oder Zügen von 3-5 Reize (50 V Intensität, Dauer 0,1 ms, bei 200 Hz geliefert) an die str zitiert. lacunosum-moleculare / radiatum Grenze (3A). Die Ausgangsverbindung Reaktion sowohl erregenden und hemmenden Komponenten (3C, oben) wurde stark von Bad Anwendung von AMPA und NMDA-Rezeptor-Antagonisten (: 3C, Mitte DNQX, 10 um und AP-5, 50 uM) reduziert. Die Rest monosynaptische IPSC besteht eine frühe schnell nach innen gerichteten Strom (eine mutmaßliche innen Cl - vermittelte Strom an der Haltepotential -65 mV, mit einem Umkehrpotential von etwa -60 mV, die in diesen Experimenten) und eine langsamere Auswärtsstrom (von einem vermeintlichen vermittelt K + Leitfähigkeit mit einem Umkehrpotential von nahezu 100 mV). Anwendung der selektiven GABA A R-Antagonisten gabazine (SR-95531, 10 uM) schaffte die schnelle IPSC, so dass eineisoliert die langsame GABA B R-vermittelte IPSC (3C, unten, schwarze Kurve); die als Reaktion auf einzelne Stimulation in Reaktion auf kurze Züge von Reizen beobachtet, aber deutlicher. Diese Antwort wurde als ein GABA B R-aktivierten K + Leitfähigkeit bestätigt wird, wie es durch die potente und selektive Antagonisten CGP-55845 (CGP, 5 um, 3C, unten, graue Linie) blockiert. FS BC zeigen typischerweise große Amplitude GABA B R-vermittelte IPSCs, wie in unserer letzten Veröffentlichung 12 gezeigt.
Um zu beurteilen, präsynaptischen Regulation der FS-IN hemmende Ausgabe von GABA B Rs, gepaart Aufnahmen wurden von synaptisch gekoppelten FS-IN und CA1-PCs durchgeführt. Synaptischen Verbindungen zwischen FS BC und CA1-PCs ist relativ hoch, wie zuvor 1,3 gezeigt. In diesen Aufnahmen, wie zuvor gezeigt, ist Kupplung Wahrscheinlichkeit über 50% zwischen eng befindet Zellpaare (≤50 um;
Sobald eine Aufnahme beendet war, eine Außen-out-Patch erfolgreich gebildet, die Scheiben wurden über Nacht fixiert und anschließend verarbeitet zu visualisieren und zu analysieren, die Morphologie der Zellen aufgenommen und bestimmen ihre neurochemische Marker Inhalt. 5A zeigt die Morphologie aus einem Vertreter FS BC in einer Projektion kombiniert auf einem konfokalen Mikroskop erhaltenen Bildstapeln. Expression von PV der Zelle wurde in immunzytochemische Markierung, die eine klare Immunsignal über die Zellkörper und proximalen Dendriten hat bestätigt, die aufgezeichnet und Biocytin-markierten Zellen (5B). Dreidimensionale Rekonstruktion der Zelle wurde von genäht Bildstapeln unter Verwendung des Simple Neuriten Tracer-Plugin in Fidschi-Software (5C) 17 durchgeführt. Das Axon zeigten eine hohe Dichte von Sicherheiten in und in der Nähe des str. pyramidale mit &# 8220; Körbe "rund um die Zellkörper der CA1-PCs (5A, Einschub) gebildet, die mutmaßlich die Identifizierung dieser Zelle als BC. Ferner die Lokalisation der Soma nahe Str. pyramidale und die radial orientierten Dendriten quer durch alle Schichten der CA1 stimmen gut mit den typischen morphologischen Merkmal der FS BC 10.
Zusammenfassend, in ganzen Zellen Aufnahmen identifiziert FS PV + BC erhalten, haben wir gezeigt, dass diese Zellen exprimieren große Amplitude GABA B R-vermittelten langsam IPSCs und deren synaptische Ausgang wird auch deutlich durch die Aktivierung präsynaptischer GABA B Rs gehemmt.
Abbildung 1. Herstellung von akuten Hippocampus. (A) Eine frisch sezierten Rattenhirn. Hinweis das Eis um das Gehirn, die Aufrechterhaltungdie Temperatur des gesamten Gehirns in der Nähe von 0 ° C liegt. (b) Schneiden von 300 um Hippocampus-Scheiben auf einem Leica VT1200 Vibratom. Die Halbkugeln sind so ausgerichtet, dass der kortikalen Oberfläche wird zuerst geschnitten. Beachten Sie die große Menge an matschigen Eis rund um die Halbkugeln und die ständige carbogenation des eisigen ACSF (Pfeil). (C) Nach dem Schneiden der Hirnschnitten werden erwärmt Saccharose-ACSF bewegt. Die Scheiben wurden umgedreht und getrimmt werden, um die Vorderhirn und Mittelhirn zu entfernen, so dass nur der Hippocampus und der darüberliegende Cortex.
Abbildung 2. Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von Inter. (A) Die Aufnahmekonfiguration um die Kammer. Hinweis Zulauf und Ablauf sind auf gegenüberliegenden Seiten der Kammer, um eine laminare Strömung nahe zu erzielen. Ebenfalls zu sehen sind die recording Elektroden auf den headstages montiert und die Masseelektroden auf beiden Seiten, als auch das Ziel (40X, Wasser-Immersion) in der Mitte. (B) Low-Power-epifluoreszenten Bild des Venus-VGAT / YFP-Signal in CA1 des Hippocampus in einer Scheibe. (C) IR-DIC Abbildung der Umgebung. Die Pfeile in B und C zeigen eine Venus / YFP positive Intern im Zellkörper Schicht. (D) High-Power-IR-DIC Bilder des Soma der in Feld B angegeben Neuron, mit einem herannahenden Patch-Pipette Bildung der Vertiefung an der Fläche (oben) und anschließend die Zelle in der whole-cell-Konfiguration (unten). (E) Schematische Darstellung der wichtigsten Stufen der Schaffung eines Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung (linke Seite) mit Cartoon-Antworten auf eine Prüfspannung -pulse Überwachung der Widerstand an der Pipettenspitze (rechte Seite). Obere Reihe: Pipette in das Bad von der Zelle; Oberen Mittel: Dimple Bildung, begleitet von einemReduktion der Pulsamplitude, was einen moderaten Anstieg des Widerstands. Untere Mittel: Giga-Ohm-Dichtung Bildung. Beachten Sie, dass die Strompulsamplitude drastisch verringert. Nur die schnelle kapazitive Ströme am Anfang und am Ende des Impulses sichtbar vor Pipette Kapazität kompensiert wird. Unten: Ganzzellkonfiguration wird durch Aufnahme durch die Membran-Patch unter der Pipettenspitze brechen erreicht. Beachten Sie, dass die großen aber relativ langsam kapazitiven Ströme am Anfang und am Ende des Impulses vor der Serienwiderstandskompensation angewendet wird. (F) Repräsentative Spuren einer FS-IN (oben) und CA1 PC (unten) von einer Familie von Hyper ausgelöst - auf depolarisierende Strompulse (oben abgebildet Protokoll). Beachten Sie die sehr hohen Frequenzentladung des FS-IN im Vergleich zu den viel langsamere Schuss der CA1-PC. Einsätze auf der rechten: Vergleich der AP-Wellenform aus der CA1-PC (oben) und der FS-IN (unten, in grau, auf dem PC AP in schwarz überlagert), Darstellung der difference in der Wellenform der AP und der AHP.
Abbildung 3. Pharmakologische Dissektion der Verbindung synaptischen Antwort, Trenn langsam GABA B R-vermittelte IPSCs in einer FS-IN. (A) IR-DIC Bild der Schicht in der Aufzeichnungskammer, mit der Aufzeichnungselektrode (Patch) an der Grenze des Str angeordnet. oriens (Ori). und pyramidale (Pyr.) und die Simulation Elektrode (Stim) an der Grenze des str. radiatum (. Rad) und lacunosum-moleculare (LM) (B) Links:. Schematische Darstellung der Aufnahmekonfiguration. Rechts: Überlagerte Spannungsantworten in der FS-IN durch eine Familie von Hyper ausgelöst, um Strominjektionen depolarisierende (C) aus dem FS-IN in Reaktion auf extrazelluläre Stimulation aufgezeichnet Repräsentative Spuren.. Top: Die Verbindungsynaptischen Verhalten im normalen ACSF durch einen einzigen Reiz (50 V Intensität, 0,1 ms Dauer) ausgelöst produziert. Mittlerer Ober: Getrennte monosynaptische IPSC nach Bad Anwendung DNQX (10 uM) und d-AP-5 (50 um). Mitte niedriger: Die schnellen monosynaptische IPSCs wird nach Zugabe von gabazine (10 uM) in das Bad blockiert. Unten: Ein Zug von 5 Reize (bei 200 Hz) zeigt eine langsame GABA B R vermittelte IPSC (schwarze Kurve), die durch nachfolgende Anwendung von CGP (5 uM) in das Bad (graue Kurve überlagert) blockiert ist.
Abbildung 4. Analyse der präsynaptischen Modulation der inhibitorischen synaptischen Übertragung in ein gepaartes Aufnahme von einem gekoppelten FS-IN und CA1 PC-Paar. (A) Links: Die IR-DIC Bild der beiden Aufzeichnungs Pipetten, die linke auf die FS-IN an der Grenze des <gepatcht em> str. Oriens (Ori.) und pyramidale (Pyr.) und das Recht auf eine CA1 PC näher an die str gepatcht. radiatum (Rad).. Rechts:. Eine schematische Darstellung der Aufnahmekonfiguration, mit repräsentativen Spannungsantworten aus der FS-IN (links) und CA1 PC (rechts) zu einer Familie von Stromimpulsen (B) Repräsentative Spuren, welche die APs in den präsynaptischen ausgelöst FS-IN (oben) und die kurze Latenz einheitlichen IPSC in der CA1-PC (unten) unter Kontrollbedingungen (Spuren auf der linken Seite), nach Bad Anwendung von Baclofen (10 uM, Mitte) und die anschließende Anwendung von CGP (5 um, rechts) . Beachten Sie, dass Baclofen reduziert die IPSC Amplitude von ~ 50%, während CGP führte zu einer fast vollständigen Wiederherstellung des IPSC-Amplitude. Steuer Spuren dargestellt sind unterlagert. (C) Zeitverlauf Handlung des IPSC Amplitude zeigt die Wirkung von Baclofen und CGP. IPSCs wurden bei 10 Sekunden-Intervallen aufgezeichnet.
Abbildung 5. Visualisierung, Rekonstruktion und immunzytochemische Identifizierung eines Biocytin-markierten aufgezeichnet FS-BC. (A) Eine Projektion genäht Stapel von Bildern einer FS-IN mit einem 20x-Objektiv auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Der Zellkörper ist an der Grenze der str. radiatum (Rad). Und pyramidale (Pyr.) der CA1-Region, die Dendriten radial verlaufen und erstrecken sich über alle Schichten, während die Mehrheit der Axon in und um den Zellkörper Schicht gefunden; als typisch für BC. Maßstab: 100 um. Einsatz, rechts oben: hoher Vergrößerung Projektion eines 20 Schichten, die typische Körbe Axon bildet um vermeintliche CA1 PC Somata (orange Sternchen). Maßstab:. 10 um (B) Die Biocytin gefüllte Zelle Körper der IN (weiß Pseudofarb, untere Tafel, Pfeil) zeigt Immunreaktivität für PV (in grün, oben). Maßstabbar. 20 um (C) Projektion der 3-dimensionale Rekonstruktion der Zelle. Die Soma und Dendriten sind in schwarz und das Axon rot gefärbt. Schichten der CA1 sind blau abgegrenzt. Abkürzungen: Ori, str. Oriens; LM, str. lacunosum-moleculare. Maßstab: 100 um.
| Name | Zusammensetzung (mM) | Verwendung | Aufzeichnungen |
| Saccharose-ACSF | 87 NaCl, 2.5 KCl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 Glucose, 75 Saccharose 7 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, 1 Na-Pyruvat, 1 Na-Ascorbat | Herstellung und Lagerung von Hirnschnitten | pH = 7,4; Osmolarität = ~ 350 mOsm |
| Aufnahme ACSF | 125 NaCl, 2,5 KCl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 Glucose, 1 MgCl | Aufnahme von Hirnschnitten | pH = 7,4; Osmolarität = 310-315 mOsm |
| Intrazelluläre Lösung (1) | 125 K-Gluconat, 10 KCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 MgCl 2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-Phosphokreatin und 0,1% Biocytin | Füllen Elektroden GABAB IPSC-Aufnahmen | pH = 7,4; Osmolarität = 295-305 mOsm |
| Intrazelluläre Lösung (2) | 105 K-Gluconat, 40 KCl, 10 HEPES, 0,1 EGTA, 2 MgCl 2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-Phosphokreatin und 0,1% Biocytin | Füllen Elektroden für gepaarte Aufnahmen | pH = 7,4; Osmolarität = 295-305 mOsm |
| Phosphatpuffer (PB) | 100 mM NaH 2 PO 4 | Spülen festen Scheiben | pH = 7,4 |
| Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) | 25 mM NaH 2 PO 4 </ Sub>, 154 mM NaCl (0,9% w / v) | Spülen festen Scheiben und Antikörper-Inkubation | pH = 7,4 |
| Para Fixiermittel | 4% w / v Paraformaldehyd, 0,1 mM PB | Fixierung von Hirnschnitten | pH = 7,4 |
Tabelle 1. Lösungen Liste.
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Discussion
Wir beschreiben eine Methode, die elektrophysiologische und neuroanatomische Techniken kombiniert, um funktionell zu charakterisieren morphologically- und neurochemisch identifizierten Neuronen in vitro; insbesondere die verschiedenen Arten von kortikalen inhibitorischen Ins. Schlüsselaspekte des Verfahrens sind: (1) Vorauswahl der potenziellen IEE; (2) die intrazelluläre Aufnahme und Neuron Visualisierung; und schließlich (3) morphologische und immunzytochemische Analyse von aufgezeichneten Ins. Obwohl diese Studie hat PV-Ins insbesondere angesprochen, kann die beschriebene Protokoll für ähnliche Aufzeichnungen von jedem Intern oder andere neuronale Typen, mit minimalen Änderung verwendet werden.
Die relativ geringe Anzahl von Inter in kortikalen Bereichen macht zufällige Auswahl und Aufnahme von diesen Zellen sehr ineffizient. Divergierende Lokalisation und morphologische Merkmale haben Forscher aktiviert zu unterscheiden und routinemäßig von einigen Intern Arten aufzeichnen. Doch in Scheiben, die Identifizierung von interneurons in und in der Nähe der Zellkörperschichten bleibt schwierig, wie mit FS-Ins. Das Aufkommen von transgenen Mauslinien, die Expression der fluoreszierenden Proteine in bestimmten Populationen Intern bietet eine elegante Lösung, die Vorauswahl und die Aufnahme dieser Neuronen viel effizienter macht 2. Nun ist für viele transgenen Linien, meist Mäuse, zunehmend aber auch Ratten 13 zur Verfügung stehen, die Untersuchung von Inter erleichtern. Bei der Verwendung von transgenen Linien, jedoch ist es wichtig, das Ausmaß und die Spezifität der Expression des Reporter herzustellen.
Qualität der Zell Kennzeichnung und Morphologie sowie der elektrophysiologischen Aufzeichnung, kritisch zu lebensfähige, hochwertige Scheiben ab; für die das Gehirn braucht, um schnell zerlegt werden (idealerweise 20-40 sec), sehr sorgfältig und kontinuierlich gekühlt behandelt. Wir finden, daß die Verwendung von Saccharose-ACSF, wodurch die Gesamtnatriumkonzentration und damit die Erregbarkeit der Neuronen vermindert wird, Dramatisch verbessert die Qualität der Scheiben und Intern Überleben 18. Es sollte jedoch betont werden, dass viele Forscher haben von Standard-Aufnahme ACSF für Schnittpräparat, hergestellt, um große Wirkung 10,11,15. Morphologische Integrität hängt stark vom Winkel, in dem Scheiben geschnitten 13; die je nach Region und Zelltyp. Allerdings können viele Inter zuverlässig von Quer, koronale oder sagittale Scheiben aufgenommen werden. Zur weiteren Minimierung Abbruch der Dendriten und Axone, Zellen tiefer in das Gewebe ausgerichtet sein sollte, wenn auch zu opfern IR-DIC Qualität und Zuverlässigkeit der Giga-Ohm-Dichtung Bildung. Unter diesen Umständen Aufnahmen von beiden CA1-Pyramidenzellen und FS-Ins können zuverlässig erhalten werden.
Kennzeichnung und Visualisierung der Neuronen erreicht nach einer typischen Aufnahme-Session à 30 min oder länger. Wenn Aufzeichnungen dauern weniger als 30 Minuten, ist es notwendig, diese Zeit vor der Fixierung zu ermöglichen, erlauben biocytin in distalen dendritischen und axonalen Prozessen diffundieren, vollständige Füllung und damit Post-hoc-Visualisierung von Zellen zu gewährleisten.
In Ganzzellableitungen, die Aufrechterhaltung niedrige und stabile Serienwiderstände ist zwingend notwendig, um eine genaue physiologische Messung der synaptischen und intrinsischen Eigenschaften, sowie gründliche Kennzeichnung der Neuronen. Allerdings mit geringem Widerstand Elektroden ermöglichen die schnelle Dialyse des Zytoplasma mit der Pipette in der intrazellulären Lösung enthalten. Ergänzung des intrazellulären Lösung mit ATP, GTP und Phosphokreatin sicherlich hilft, die Energieversorgung und die Aufnahmequalität zu erhalten. Allerdings kann die Dialyse von Neurochemikalien und Protein zu einer verminderten Reaktionen führen, reduziert Plastizität 19 und kann auch neurochemische Identifizierung erschweren. Zum Beispiel PV konsequent von Neuronen im Laufe längerer Versuche gewaschen. Daher kann die Untersuchung der distalen dendritischen oder axonalen Prozesse erforderlich, um DeTe werden rmine Immunreaktivität des aufgenommenen Neurons. In solchen Fällen, wo solche Dialyse ist ein Anliegen, Aufnahmen mit Loch-Patch-Konfiguration kann verwendet werden, um die intrazelluläre Umgebung 20 zu erhalten, jedoch muss der Patch am Ende der Aufnahmen oder das Neuron anschließend "repatched" in der Ganzzellkonfiguration gebrochen werden zu Biocytin Füllung ermöglichen.
Pharmakologische Untersuchung der aufgezeichneten Neuronen ist eine nützliche Methode, um die funktionelle Bedeutung der divergierenden neuromodulatorischen Mechanismen bei der Gestaltung der intrinsischen und synaptischen Aktivität von Ins bewerten. In den oben beschriebenen Verfahren, pharmakologische Isolierung und gepaart Aufnahmen werden verwendet, um Pfosten und präsynaptischen GABA B R-vermittelten Wirkungen zu bewerten sind; jedoch kann man leicht die Kombination von Agonisten und Antagonisten zu modifizieren, um die Rolle von alternativen Rezeptorfamilien zu beurteilen, beispielsweise die Cannabinoid-System 21.
"> Histologische und immunzytochemische Verarbeitung der aufgenommenen Zellen ist sehr zuverlässig, sobald Protokolle eingerichtet werden. Hat die hier beschriebene Immunzytochemie Protokoll in Bezug auf die Kombination von Antikörpern verwendet wird, Schichtdicke und Anforderung eingestellt wurde, um die neurochemischen Inhalt identifizieren. Wir verwenden normales Ziegenserum da alle Sekundärantikörper verwendet werden, in Ziegen angehoben. Als Alternative ist es auch möglich, Rinderserumalbumin (BSA) oder Milchpulver als Blockierungsmittel verwendet. Es sollte beachtet werden, dass dieses Protokoll verwendet phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für die Antikörper-Inkubation wird, jedoch alternativ ein einfach verwenden 0,1 M PB anstelle von PBS. Verwendung einer relativ hohen Konzentration an Detergens (0,3% Triton X-100), nicht offensichtlich Antigenität zu verringern, während gleichzeitig das Eindringen von Antikörpern in den ersten 100 um Oberflächenschicht der Scheibe , wo Nervenzellen werden routinemäßig aufgezeichnet. Wenn tieferen Zellen aufgenommen werden, oder die Scheiben sind dicker, empfiehlt sich resecti ist esauf den Scheiben, mit einem Kryostaten oder ein Vibratom, und führen Sie die Immunmarkierung auf den dünnen (40-70 um) Abschnitte. Für 300 um Scheiben, eine lange Inkubation der Antikörper (bei 4 º C strukturelle Integrität der Scheiben zu erhalten) erzeugt äußerst zuverlässige immunzytochemischen Ergebnisse.Identifizierung der Neuronen beruht auf der kombinierten Information in der Aufzeichnung, die post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse erhalten. Im Hippocampus, aufgrund der strengen laminare Organisation, axonalen Verteilung ist ein guter Indikator für den postsynaptischen Ziele von Inter. Trennt Axon oder Dendriten kann jedoch machen die Identifikation schwierig oder unmöglich. Außerdem bleibt eine gewisse Unklarheit, beispielsweise bei der Unterscheidung PV + BC und axo-Axonic Inter aufgrund der Ähnlichkeit in der Gesamt axonalen Lokalisierung. Eine endgültige Identifizierung endgültigen würde elektronenmikroskopische Analyse der postsynaptischen Ziel 1,3 o erfordernr weitere immunzytochemische Dissektion 22.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich Ina Wolter für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung danken. VGAT-Venus transgenen Ratten wurden von Drs erzeugt. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi und Y. in Kawaguchi Nationale Institut für Physiologische Wissenschaften, Okazaki, Japan, mit pCS2-Venus von Dr. A. Miyawaki vorgesehen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | see Uematsu , et al., 2008 | ||
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| Dissection tools | i.e. FST | For brain removal | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | Custom-made in lab | ||
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. | |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | Custom made | ||
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | ||
| Isolated constant voltage stimulator |  Digitimer Ltd. |
DS-2A | |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5,000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | Any high quality brand | ||
| Glass coverslips | Usually 22 x 22 mm | ||
| Agar spacers | Agar block, cut on vibratome to 300 μm | ||
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | See Schindelin et al., 2012 |
References
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