Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

Published: September 30, 2014 doi: 10.3791/51706

Summary

רשתות קליפת המוח נשלטות על ידי קבוצה קטנה, אך מגוונת של interneurons המעכב. חקירה פונקציונלית של interneurons לכן דורשת הקלטה ממוקדת וזיהוי קפדני. שתואר כאן היא גישה משולבת הכוללת כל תא הקלטות מזוגות בודדים או synaptically מצמידים של נוירונים עם תיוג תאיים, שלאחר הוק מורפולוגיים וניתוח immunocytochemical.

Abstract

interneurons המעכב GABAergic לשחק תפקיד מרכזי במעגלים עצביים במוח. Interneurons מהווה תת קבוצה קטנה של האוכלוסייה העצבית (10-20%), אך מראה רמה גבוהה של הטרוגניות פיזיולוגית, מורפולוגיות, וneurochemical, המשקף פונקציות המגוונות שלהם. לכן, חקירה של interneurons מספקת תובנות חשובות עקרונות הארגון ותפקוד של מעגלים עצביים. זה, עם זאת, דורש גישה פיזיולוגית וneuroanatomical משולב לבחירה וזיהוי של סוגים בודדים interneuron. כל תא תיקון מהדק הקלטה מפרוסות חריפות מוח של בעלי חיים מהונדסים, המבטאים חלבוני ניאון מתחת ליזמים של סמני interneuron ספציפי, מספק שיטה יעילה למקד וelectrophysiologically לאפיין מאפיינים פנימיים והסינפטי של סוגים ספציפיים interneuron. בשילוב עם תיוג צבע תאיים, גישה זו יכולה להתארך עם post hoc מוניתוח rphological וimmunocytochemical, המאפשר זיהוי שיטתי של נוירונים שנרשמו. ניתן להתאים שיטות אלה כדי שיתאימו למגוון רחב של שאלות מדעיות לגבי מאפיינים תפקודיים של סוגים שונים של תאי עצב בקליפת המוח.

Introduction

מעגלים עצביים בהיפוקמפוס כבר זמן רב את הנושא של בדיקה אינטנסיבית, לגבי שני אנטומיה ופיזיולוגיה, בשל תפקידם החיוני בלמידה ובזיכרון, כמו גם ניווט מרחבי בשני בני אדם ומכרסמים. באותה מידה, ארגון מינרית הבולט, אבל פשוט של ההיפוקמפוס עושה אזור זה נושא מועדף של מחקרי טיפול בתכונות מבניות ותפקודיות של רשתות קליפת המוח.

מעגלים בהיפוקמפוס מורכבים מתאים מעוררים עיקריים (> 80%) ו( 10-20%) קטנים יותר, אבל מחזור מגוון מאוד של interneurons המעכב 1-3. Interneurons לשחרר חומצת γ-aminobutyric (GABA) מסופי האקסון הפועל בקולטני GABA ionotropic המהיר (GABA RS) וGABA-B קולטני metabotropic איטי (GABA-B RS) 4. מנגנונים מעכבים אלה לאזן עירור ולהסדיר את הרגישות של תאים עיקריים, ובכךעיתוי ir ודפוס של שחרור. עם זאת, GABA שוחרר מinterneurons פועל לא רק על תאים עיקריים, אלא גם על interneurons עצמם 5,6. קולטנים מראש וpostsynaptic לתווך רגולציה משוב ואינטראקציות הדדיות מעכבות בין הסוגים השונים של interneuron. מנגנונים המעכבים אלה ברשתות interneuron הם האמינו להיות מרכזיים לדור ועיצוב דפוסי פעילות האוכלוסייה, בתנודות מסוימות בתדרים שונים 7.

הקלטת תיקון מהדק כל התא היא שיטה מבוססת היטב לבחינת מאפיינים הפנימיים ואינטראקציות הסינפטי של נוירונים. עם זאת, בשל גיוון הרב של סוגי interneuron, חקירה של interneurons המעכב דורשת זיהוי קפדני של התאים שנרשמו. כסוגי היפוקמפוס interneuron מתאפיינים בתכונות ייחודיות מורפולוגיים וביטוי סמן neurochemical, אנטומי בשילוב ודואר immunocytochemicalxamination יכול לספק אמצעי כדי לקבוע 6,8,9 זהות interneuron מדויקות.

בעבודה הנוכחית אנו מתארים גישה ניסויית שבו הקלטות תיקון מהדק כל תא מתאי עצב בודד או זוגות synaptically מצמידים משולבות עם תיוג תאיים, ואחריו פוסט הוק-ניתוח צורני וimmunocytochemical, המאפשרים האפיון של איטי GABA-B קולט תיווך השפעות מעכבות בinterneurons המזוהה. כדוגמא, אנו מתמקדים בסוג אחד עיקרי של interneuron, קבוצת משנה של מה שנקרא "תאי הסל" (BC), אשר innervates דנדריטים סומה והפרוקסימלי של מטרות postsynaptic ומאופיין ב" מתחזק מהר "(FS) פריקת דפוס, האקסון צפוף המכסה את שכבת גוף תא, וביטוי של parvalbumin מחייב סידן החלבון (PV) 10,11. interneurons אלה להציג זרמים גדולים postsynaptic מעכבים, כמו גם טרום בולטיםאפנון הסינפטי של הפלט הסינפטי שלהם, בתגובה להפעלת GABA-B R 12. השילוב של טכניקות המתוארות כאן יכול להיות מיושם באופן שווה גם לחקור מנגנונים פנימיים או הסינפטי במגוון רחב של סוגי תאי עצב מזוהים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל תחזוקת הנהלים ובעלי החיים בוצעה בהתאם להנחיות מוסדיים, הגרמני צער בעלי החיים החוק, המפורטות בהנחיה 86/609 / EEC הנוגע להגנה על בעלי חיים, והנחיות מהרשויות המקומיות (ברלין, T-0,215 / 11 )

.1 הכנת פרוסות חריפה-היפוקמפוס

  1. קח חולדה מהונדס (17 עד 24 יום ישנה), המבטא את חלבון ונוס / YFP ניאון תחת אמרגן vGAT, אשר תוויות רוב interneurons המעכב בקליפת המוח 13. לערוף את העכברוש. במהירות לנתח את המוח (<40 שניות) לתוך (2/5% 2 O 95% CO) נוזל semifrozen, carbogenated מבוסס סוכרוז מלאכותי השדרתי (סוכרוז-ACSF, איור 1 א).
  2. להעריך את מוח החולדה גזור לקרינת ונוס / YFP עם 505 ננומטר מנורת LED ו515 מסנן פליטה, רכובה על זוג משקפי.
  3. הסר את השליש הקדמי של קליפת המוח וcerebellum; לאחר מכן להפריד את האונות, כל עם אזמל. הסר את פני השטח הגבי של קליפת המוח כדי לספק משטח שטוח כדי להדביק את המוח, כפי שתואר קודם לכן 14.
  4. לחתוך פרוסות רוחביים (300 מיקרומטר) של ההיווצרות בהיפוקמפוס בvibratome, צריכה להיות מוקפות ההמיספרות עם semifrozen, carbogenated סוכרוז-ACSF (איור 1) 14. הסר אזורים נוספים של קליפת מוח מקורי, המוח התיכון ובגזע המוח. העבר את כל פרוסה לתא החזקה שקועה המכיל סוכרוז-ACSF, אשר carbogenated וחימם ל35 ºC.
  5. השאר את הפרוסות להתאושש ב35 ºC ל30 דקות מהזמן של הפרוסה האחרונה שנכנסה לACSF חימם. לעשות את זה כדי להפעיל מחדש את תהליכי חילוף חומרים ולהקל על הודבק המכתבים מחדש תהליכים עצביים לחתוך. לאחר מכן להעביר לטמפרטורת חדר לאחסון (איור 1 ג).

2 ייצור ומילוי של מטפטף הקלטה

  1. פוטפטפות תיקון ll מנימי זכוכית, כך שהתנגדות פיפטה של ​​2-4 MΩ מושגת כאשר התמלאו מסונן (מסנן מזרק, נקבובית גודל: 0.2 מיקרומטר) פתרון תאיים המכיל biocytin% 0.1 (תיוג תאיים). שמור את הפתרון תאיים מקורר בקרח כדי למנוע פירוק של מרכיביו.
  2. מלא טפטפות תיקון לזיהוי זרמי postsynaptic עם תמיסה המכילה Cl נמוך רלוונטי מבחינה פיזיולוגית - ריכוז (E R (Cl-) = -61 mV, ראה רשימת פתרון).
  3. עבור הקלטות לזווג לזהות תגובות קולט תיווך presynaptic, למלא טפטפות תיקון עם פתרון תאיים עם קיבולת נמוכה Ca 2 + חיץ כדי למנוע הפרעה לשחרור משדר presynaptically, כמו גם פי 4 Cl גבוה יותר - ריכוז (E R (Cl-) = -20 MV) כדי לשפר את האות לרעש של iPSCs הנצפה 5 המאפשר הערכה מדויקת של שו"ת תרופתיonsiveness. שים לב ששינוי Cl - ריכוז יכול לשנות קינטיקה IPSC 15.

הקלטת תיקון מהדק .3 תא כולו מFS-Ins

  1. Carbogenate ACSF ולהאכיל באמצעות מערכת זלוף לתא ההקלטה, באמצעות משאבת peristaltic (שגם מסירה ACSF מתא ההקלטה דרך קו יניקה, איור 2 א). הפעל את כל הציוד על ההתקנה כהכנה להקלטה.
  2. העבר את הפרוסה לתא ההקלטה ולהחזיק במקום עם טבעת פלטינה מתוחה עם סיבי משי יחידים. מקם את הפרוסה כך שpyramidale שכבה (str.) של CA1 עובר אנכי דרך שדה הראייה, המאפשר גישה עם 2 טפטפות לשני str. radiatum וstr. אוריין בו זמנית (2C דמויות ו4A).
  3. מניחים את החדר להתקנה ולהתחיל זלוף של carbogenated והמחומם (32-34 ºC) הקלטהCSF בקצב זרימה של 5-10 מ"ל / דקה.
  4. להעריך את איכות פרוסה תחת אופטיקה IR-DIC ב40X הגדלת מטרה, ולדמיין עם מצלמת CCD שנצפו בתצוגה. תניח איכות פרוסה טובה אם מספר גדול של תאים עגולים, בניגוד בינוני פירמידה CA1 (PC CA1) ניתן לראות בstr. pyramidale בעומקים של 20-30 מיקרומטר מתחת לפני שטח חלק וקל מכתשים (איור 2 ג). פרוסות באיכות ירודה מכילות מספר גדול של תאים בניגוד מאוד, מצומקים או נפוחות, עם פני השטח פרוס אחידים.
  5. לזהות interneurons FS המשוער תחת תאורת epifluorescence כמו אלה מבטאים ונוס / YFP (איור 2), עם somata הקוטבי גדול או בסמוך str. pyramidale. בחרו את התאים באופן סביר עמוק בתוך פרוסה (50-100 מיקרומטר, איור 2C) על מנת לשמור על השלמות מורפולוגיים שלהם טובים יותר.
  6. הר האלקטרודה ההקלטה במחזיק פיפטה על headstage; לאחר מכן אפליקציהly בלחץ נמוך, חיובי (20-30 mbar) דרך קו הצינור. מנמיכים את פיפטה אל פני השטח של הפרוסה, קיזז מעט למרכז נוירון שנבחר.
  7. קבל את תצורת הקלטה כל התא כפי שתואר לעיל 14,16 וגם ראה איורים 2 ד ו 2E:
    1. מקד את תא: להגביר את הלחץ ל70-80 mbar ומהירות להוריד את פיפטה באמצעות הפרוסה רק כדי מעל לסומה של התא הנבחר (איור 2 ד, למעלה).
    2. מתקרב לתא: לחץ על פיפטה נגד קרום התא כדי לייצר "גומת חן" על זה (איור 2 ד, למעלה). לבצע שלב זה במהירות, על מנת למנוע תיוג biocytin של תאי שכנים.
    3. ליצור חותם גיגה אוהם: שחרר את הלחץ ובו זמנית חל פקודת 20 מתח mV לפיפטה. חותם גיגה אוהם (1-50 GΩ; איור 2 ד, תחתון ואיור 2E אמצע) typicברית מתפתחת במהירות. ברגע שחתם, להחיל את הקרום הצפוי המנוחה הפוטנציאלית (בדרך כלל בין -70 ו-60 mV) כפקודת מתח.
    4. לפרוץ את התיקון: ברגע שחתם, קרע תיקון הקרום עם דופק קצר של לחץ שלילי; ובכך להשיג את התצורה כל התא (איור 2E, למטה).
  8. לפצות קיבול כל התא והתנגדות סדרה (S R). R של בדרך כלל 5-20 MΩ ויציב עד 120 דקות. לנטוש את התאים אם פוטנציאל הממברנה (V M) על פריצת דרך הוא יותר מאשר depolarized -50 mV; R S הוא תחילה גדול יותר מ30 MΩ; או שינויי S R על ידי יותר מ 20% במהלך ההקלטה.
  9. לזהות FS-ins על ידי התגובה שלהם (במצב נוכחי מהדק) למשפחה של היפר לdepolarizing פולסים נוכחי (-250 ל+250 הרשות הפלסטינית, איור 2F, למעלה). FS-ins שיחסית depolarized V M (בדרך כלל -50 to -60 mV), (<20 אלפיות שנייה) ולהגיב ל500 הרשות הפלסטינית depolarizing הזרקה נוכחית עם רכבת של פוטנציאל פעולה (APS) בתדרים> בזמן קבוע קרום קצר 100 הרץ 11 (איור 2F, תחתון), שהם במידה ניכרת שונה מאלה בCA1 מחשבים (איור 2F, באמצע).

.4 תאי גירוי חשמלי לעורר תגובות בתיווך R GABA-B

  1. להתבונן עוררו תגובות synaptically, מקם אלקטרודה תאית גירוי (פיפטה תיקון מלאה ב2 M NaCl; התנגדות: .1-0.3 MΩ) בפרוסה בגבול של str. radiatum וstr. lacunosum-moleculare. מקם את האלקטרודה 200-300 מיקרומטר לרוחב לסומה כדי למנוע גירוי חשמלי ישיר של התאים ולמזער חפצי גירוי (איור 3 א).
  2. ברגע שהאלקטרודה הגירוי ממוקמת, לקבל הקלטת כל התא שלהתא ובחר להעריך את הפנוטיפ הפיזיולוגי במצב נוכחי מהדק כאמור בסעיף 3.9 (איור 3 ב).
  3. עם נוירון שנרשם במתח מהדק (M V -65 mV), לספק גירוי חשמלי של אקסונים presynaptic ב50 V (~ גירוי 500 מייקרו-אמפר יעיל) בכל 20 שניות, באמצעות ממריץ קבוע מתח מבודד. השתמשו בגירויים בודדים (100 μsec משך, איור 3 ג, למעלה) כדי לצפות iPSCs תיווך B R GABA, וInterleave עם רכבות של גירויים מרובים (ב200 הרץ) כדי לייצר שחרור משדר גדול יותר.
  4. אמבט להחיל ionotropic יריבים קולט גלוטמט (קולטן AMPA: DNQX [10 מיקרומטר]; רצפטור NMDA: d-AP5 [50 מיקרומטר]) כדי לחשוף את monosynaptic IPSC (איור 3 ג, בינוני הגבוהים) המבודדים. נוסף לבודד את IPSC בתיווך R GABA-B עם יישום של חוסם GABA R (gabazine [10 מיקרומטר]; איור 3 ג l אמצעower).
  5. לאשר את התוצאה הנוכחי (איור 3 ג תחתון, מורחבים) האיטי כלפי חוץ כמו להיות בתיווך R GABA-B על ידי היישום הבא של CGP-55845 [5 מיקרומטר] (איור 3 ג תחתון, underlain באפור)

.5 מותאמות הקלטות של synaptically יחד FS-IN ומחשבי CA1

  1. להעריך שליטת presynaptic תיווך R GABA-B של שידור סינפטי המעכב עם הקלטות בו זמנית, שבוצעו בין זוגות ובמחשב synaptically מצמידים כפי שיתואר להלן.
  2. ראשית, להקים הקלטת כל התא של interneuron presynaptic (כאמור בסעיף 3) ולאשר את הפנוטיפ FS (איור 4 א).
  3. לאחר מכן תיקון CA1 מחשב השכן (20-100 מרחק מיקרומטר, איור 4 א) ולהחיל suprathreshold הקצר depolarizing פולסים נוכחי (1 משך msec, משרעת Na 1-5) לIN presynaptic (שנערך במצב נוכחי מהדק) כדי לעורר נקודתי גישה. אם שיתוף הסינפטיnnection הוא הווה, נקודתי גישה בתוצאה בiPSCs בCA1 המחשב, שנערך במתח מהדק (לפצות S R לכ -80%).
  4. במידת צורך, למלא אלקטרודה חדשה הקלטה ולהקליט ממחשבים CA1 נוספים עד שחיבור נמצא.
  5. ברגע שנוצר חיבור, לעורר זוגות של נקודתי גישה בFS-IN presynaptic להעריך הן את התגובה הסינפטית האחידה והתנהגות דינמית. השתמש בפרוטוקול לזווג דופק אופייני של 2 גירויי depolarizing עם מרווח אלפיות 50 (איור 4).
  6. לאסוף עקבות שליטה בתנאים בסיסיים. לאחר מכן, החל baclofen סלקטיבית GABA-B אגוניסט R (10 מיקרומטר) לACSF המרוסס, כך שהפעיל GABA-B Rs, ואחריו אנטגוניסט CGP-55845 (5 מיקרומטר), לחסום באופן מלא את השפעות קולט בתיווך. לאסוף ~ 50 עקבות במצב יציב של כל תנאי בסמים (איור 4 וC).
  7. ברגע שההקלטה היא שלמה, לאטום את הקרום סומטיים על ידי יצירת outsidדואר יוצא תיקון: לאט לאט למשוך את פיפטה מהגוף התא בV-מהדק וככל שעולה S R, להפחית את M V ל-40 mV. עושה זאת כדי להקל על היווצרות של התיקון מחוץ החוצה; לאחר מכן להסיר את פיפטה מהאמבטיה.

.6 ניתוח של מאפייני אלקטרו

  1. הערה: מספר רב של חבילות תוכנה שונות זמין לרכישת נתונים אלקטרו. כאן, WinWCP, משמשת תכנית Windows בחבילת Strathclyde תוכנת אלקטרופיזיולוגיה החופשית, המאפשרת הקלטה של ​​עד 16 ערוצי כניסה אנלוגיים ופלט של 10 אותות דיגיטליים.
  2. מסנן נמוך לעבור את כל הנתונים ב5-10 kHz ומדגם ב20 kHz.
  3. לנתח נתונים פיסיולוגיים עם חבילת ניתוח off-line.
    הערה: Stimfit, חבילת תוכנות קוד פתוח הכוללת מעטפת פייתון, משמשת במקרה זה; עם זאת חלופות אחרות יכולות לשמש בקלות במקום.
    1. לנתח p קרום הפסיביroperties של נוירונים שנרשמו, שנרכש במהדק נוכחי, מפוטנציאל מנוחה קרום.
    2. מדוד את פוטנציאל הממברנה הממוצעת נח מנקודת ההתחלה של תגובות שנרשמו מתחילת ההקלטה.
    3. חישוב התנגדות קלט, באמצעות חוק אוהם, מתגובת המתח לפולסים הקטנים ביותר hyperpolarizing הנוכחיות (≤ -50 הרשות הפלסטינית). כדי לשפר את יחס אות לרעש, עקבות מרובות ממוצעת. הערה: דוגמאות שלנו הן בדרך כלל ממוצעים של 10-50 מטאטא בודד.
  4. להעריך את זמן הקרום לכאורה קבוע על ידי התאמת עקומת monoexponential לדעיכה של התגובות לפולסים הנוכחי hyperpolarizing הקטן ביותר.
  5. ניתוח צורת גל פוטנציאל פעולה כדי לקבוע סף, משרעת (סף לשיא) ומשך (רוחב נמדד בחצי גובה) שהושרו על ידי רמת סף depolarizing פולסים נוכחי.
  6. לנתח GABA-B R iPSCs תיווך מהקלטות מהדק מתח. מסנן עקבות off-line ב500 הרץ (מסנן גאוס) ולהעריך את המשרעת השיא והשהיה של התגובה בתיווך GABA-B R (בממוצעים של לפחות 10 עקבות).
  7. זיהוי ההשפעה של GABA-B Rs על התפוקה המעכבת של אח"י כשינוי במשרעת שיא של iPSCs תיווך R GABA נמדד בין השיא ונקודת התחלה שקדמה. חשב את המשרעת הממוצעת מ≥50 עקבות לתקופה השליטה והמצב היציב של כל העידנים תרופתיים.

.7 ויזואליזציה וImmunocytochemistry של FS-Ins

  1. בעקבות ההקלטות, לתקן את הפרוסות על ידי טבילה בparaformaldehyde 4% עם 0.1 M חיץ פוספט O (PB, pH = 7.35) / N ב 4 ° C..
  2. אם ניתן להעביר פרוסות צורך PB ולאחסן עד ~ 1 שבוע לפני העיבוד.
  3. פרוסות לשטוף בנדיבות בPB הטרי ולאחר מכן ב0.025 M PB עם 0.9% NaCl (PBS, pH = 7.35).
  4. כדי להפחית את הנוגדן הלא ספציפי מחייב, לחסום את פרוסות FOשעה r 1 ב RT בתמיסה המכילה 10% עזים בסרום נורמלי (NGS), 0.3% Triton-X100 (חומר ניקוי לpermeabilize ממברנות) ו0.05% 3 NaN, מורכב בPBS.
  5. תווית עבור ביטוי PV, להשתמש נוגדן חד שבטי עכבר אנטי PV בדילול מלא בתמיסה המכילה 5% NGS, 0.3% Triton-X100, 0.05% NaN 3, בPBS. דגירה נוגדנים ראשוניים ל2-3 ימים על 4 מעלות צלזיוס 12. יש לשטוף את פרוסות ביסודיות בPBS.
  6. החל נוגדנים משני אנטי עכבר ניאון (למשל AlexaFluor-546.) יחד עם streptavidin ביוטין מחייב החלבון, מצומדת לfluorochrome (למשל, AlexaFluor-647); דגירה בתמיסה המכילה 3% NGS, 0.1% Triton-X100, 0.05% NaN 3, בדילול מלא PBS ודגירת O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. בנדיבות לשטוף פרוסות 2-3x עם PBS ואחרי 2-3 השטיפות בPB. הר פרוסות בשקופיות זכוכית. השתמש spacer אגר 300 מיקרומטר כדי למנוע פרוסה מהקריסה. פרוסות כיסוי להחליק עם fluoresבינוני אחוזים הרכבה וחותם עם ציפורניים לכה.

.8 הדמיה ושחזור Visualized FS-Ins

  1. דמיין פרוסות באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקה, עם כתב fluorochome נרגש עם קו הלייזר המתאים (לייזר דיודה 635 ננומטר לAlexaFluor-647; הליום ניאון ננומטר 543 לAlexaFluor-546 תיוג לPV וארגון 488 או 515 ננומטר עבור ונוס / YFP).
  2. קח את התמונות ברזולוצית Z-מתאימה (בדרך כלל 0.5-1 מיקרומטר צעדים, באמצעות מטרת 20X) כדי לייצר Z-ערימה של כל התא. ערימות מרובות נדרשו בדרך כלל לתמונת התא השלם, שבו ניתן תפור דיגיטלי off-line באמצעות פיג'י / תוכנת ImageJ (איור 5 א).
  3. לשחזר את התא מהערימה התמונה תפורה בשיטת עקיבה האוטומטית למחצה (תוסף neurite Tracer פשוט בפיג'י / ImageJ חבילת תוכנת 17, תרשים ג).
  4. לבסוף, להעריך את PV-immunoreactivity של interneuron עם עדשה אובייקטיבית צמצם מספרי גבוה (סיליקון טבילה 60X, NA = 1.3). להפוך את תמונות של סומה, דנדריטים הפרוקסימלית והאקסון הפרוקסימלי, או לחלופין מסופי האקסון אם כישלון גופני של PV הוא חזק מדי. תאים נחשבים immunoreactive עבור PV אם חיסוני תיוג נראה ליישר עם מבני שכותרת biocytin (איור 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תנאי איכות הפרוסה שהיא טובה במידה ניכרת, הקלטה משני מחשבי CA1 וFS-ins ניתן להשיג עם קושי מינימאלי. שורת החולדה המהונדס מבטא ונוס / YFP תחת אמרגן vGAT 13 לא באופן חד משמעי לזהות FS-ins, או אכן BCS. עם זאת הקלטות מתוספות בתוך ומסביב str. pyramidale, שבו הצפיפות של FS-ins היא בדרך כלל גבוהה 1, תוצאות בהסתברות גבוהה של בחירת FS-ins (איור 2). ניתן להבחין FS-ins על ידי המאפיינים הפיסיולוגיים האופייניים שלהם שונים מאלה של שני מחשבי CA1 וRS-ins. יש להם קרום depolarized יחסית מנוחה פוטנציאלית (-58.9 ± 1.5 mV, 15 תאים, לעומת -62.6 ± 1.1 mV בCA1 מחשבים, 26 תאים), התנגדות כניסה נמוכה (92 ± 12 MΩ לעומת 103 ± 14 MΩ במחשבים) וקבוע זמן קרום לכאורה מהיר (15.4 ± 2.6 אלפיות שני לעומת 22.0 ± 2.7 אלפית שניים במחשבים), resulטינג בתגובה מתח מהיר לhyperpolarizing פולסים הנוכחי (איור 2F). FS-ins משוחרר פוטנציאלים מאוד קצרים פעולה (0.38 ± 0.01 אלפיות שנייה) של משרעת נמוכה יחסית (82.8 ± 1.0 mV) ואחריו afterhyperpolarization מהר מאוד בולט (כלומר המשרעת 22.6 ± 2.9 mV). בתגובה לפולסים depolarizing הגדול הנוכחיים (250 הרשות הפלסטינית), FS-ins ירה בתדרים גבוהים (82 ± 10 הרץ; טווח: 34-128 הרץ; איור 2 ד, משמאל).

כדי להעריך זרמי postsynaptic בתיווך R GABA-B בFS-ins, תגובות הסינפטי פרמקולוגית מבודדות היו שהושרו על ידי גירוי תאי של סיבים מעכבים בstr. radiatum / lacunosum-moleculare גבול. איור 3 מראה דוגמא של FS-IN, שבו מצור רציף של מרכיבי התגובה הסינפטי מתחם מבודד IPSC בתיווך R GABA-B monosynaptic האיטי. תגובות הסינפטי היו eliשצוטט על ידי גירויים או רכבות של 3-5 גירויים (50 עוצמת V, 0.1 משך אלפיות שני, שנשאו ב200 הרץ) לstr יחידים. lacunosum-moleculare / גבול radiatum (איור 3 א). התגובה הראשונית המתחם כוללים רכיבים שני מעוררים ומעכבים (איור 3 ג, עליון) הופחתה מידה רבה על ידי יישום אמבטיה של יריבים AMPA וNMDA קולטן (DNQX, 10 מיקרומטר וAP-5, 50 מיקרומטר, בהתאמה: איור 3 ג, באמצע). IPSC monosynaptic השיורי מורכב מוקדם מהר פנימה נוכחי (פנימה Cl משוער - נוכחי מתווכת בפוטנציאל -65 mV מחזיק, עם פוטנציאל היפוך של כ -60 mV, בניסויים אלה) וכלפי חוץ איטי נוכחי (בתיווכו של משוער K + מוליכות עם קרוב פוטנציאל היפוך ל100 mV). יישום של gabazine אנטגוניסט GABA R סלקטיבית (SR-95,531, 10 מיקרומטר) ביטל את IPSC המהיר, עוזבבודד את IPSC בתיווך R GABA האיטי B (איור 3 ג, תחתון, זכר שחור); אשר נצפה בתגובה לגירוי אחד, אבל באופן ברור יותר בתגובה לרכבות קצרות של גירויים. תגובה זו אושרה כמוליכות K +-R מופעל GABA-B, כפי שהוא נחסם על ידי היריב החזק ובררני CGP-55845 (CGP, 5 מיקרומטר, איור 3 ג, תחתון, זכר אפור). BCS FS בדרך כלל להראות iPSCs הגדול GABA משרעת B בתיווך R, כמו שמוצג בפרסום האחרון שלנו 12.

כדי להעריך רגולציה presynaptic של FS-IN פלט מעכב על ידי GABA-B Rs, הקלטות לזווג בוצעו ממחשבים FS-IN וCA1 synaptically מצמידים. קישוריות הסינפטית בין BCS FS ומחשבי CA1 היא יחסית גבוהה, כפי שהוצג קודם 1,3. בהקלטות אלה, כפי שהוצגו קודם, הסתברות צימוד הוא מעל 50% בין זוגות תא ממוקמים באופן הדוק (≤50 מיקרומטר; 5. עם זאת, זה תלוי מאוד בסוג interneuron בדק. קישוריות נבדקה גם עם זריקה ארוכה depolarizing נוכחי (100 אלפיות שנייה, ≥ 500 הרשות הפלסטינית) או רכבת של פולסים depolarizing קצרים (1 משך אלפיות שני, 1-5 NA, עד 10 פעימות נשאו ב20 הרץ) לעורר AP בודד כל אחד. נקודתי גישה בinterneurons presynaptic עוררו GABA מהר R בתיווך iPSCs עם זמן אחזור קצר, עלייה מהירה וריקבון במחשבים synaptically מצמידים. כאשר יחד-קטניות (2 פעימות ב 20 הרץ) יושמו, סינפסה הראתה דיכאון לטווח קצר (יחס מותאם דופק <1) 1. בתא הדוגמא המוצג, יישום אמבטיה של baclofen GABA-B אגוניסט R (2-10 מיקרומטר) הביא לירידה משמעותית במשרעת של IPSC הראשון (4B דמויות ו4C). יישום האמבטיה הבא של אנטגוניסט CGP-55845 תמיד הוביל להתאוששות של IPSC (5 מתוך 5 תאים 12 </ Sup>; 4B דמויות ו4C).

ברגע שהקלטה הושלמה, תיקון מחוץ החוצה נוצר בהצלחה, את הפרוסות היו קבועות בין לילה ולאחר מכן מעובד לחזות ולנתח את המורפולוגיה של התאים הוקלטו ולקבוע את תוכן הסמן neurochemical. איור 5A ממחיש את המורפולוגיה של נציג אחד FS לפני הספירה בהקרנה של ערימות תמונה בשילוב מתקבלות על מיקרוסקופ confocal. הביטוי של התא של PV אושר בתיוג immunocytochemical שנתן חיסוני אות ברורה על פני גוף התא והדנדריטים הפרוקסימלי של מוקלט ותא שכותרתו biocytin (איור 5). שחזור תלת ממדים של התא בוצע מארובות תמונה תפורות באמצעות תוסף neurite Tracer פשוט בתוכנת פיג'י (איור 5 ג) 17. האקסון הראה צפיפות גבוהה של ביטחונות ובסמוך לstr. pyramidale עם &# 8220; סלים "נוצרו סביב somata של CA1 מחשבים (איור 5 א, הבלעה), לפי משוער, זיהוי תא זה כלפני הספירה. יתר על כן, הלוקליזציה של סומה ליד לStr. pyramidale ודנדריטים רדיאלית בכיוון פורש כל שכבות CA1 מתאימות גם לתכונה מורפולוגית הטיפוסית של 10 FS BCS.

לסיכום, בכל תא הקלטות מתקבלות מPV FS המזוהה + BCS, יש לנו הראינו כי תאים אלה מבטאים iPSCs GABA משרעת B הגדול בתיווך R האיטי והפלט הסינפטי שלהם הוא גם בלם במידה ניכרת על ידי ההפעלה של RS GABA-B presynaptic.

איור 1
הכנת איור 1 של פרוסות בהיפוקמפוס חריפות. () מוח חולדה טרי גזור. שים לב לקרח המקיף את המוח, שמירה עלהטמפרטורה של המוח כולו ליד 0 ° C. (ב) חיתוך 300 מיקרומטר פרוסות בהיפוקמפוס על vibratome לייקה VT1200s. ההמיספרות מיושרות כך את פני השטח של קליפת המוח הוא לחתוך ראשון. שים לב לכמות הגדולה של קרח עכור המקיף את ההמיספרות וcarbogenation המתמיד של ACSF הקרח (חץ). (ג) לאחר חיתוך פרוסות המוח עברו לחמם סוכרוז-ACSF. פרוסות נמסרו וגזוזים כדי להסיר את המוח הקדמי ומוח תיכון, ומשאירות רק את ההיפוקמפוס וקליפת המוח שמעליה.

איור 2
הקלטת איור 2 שלמות תא תיקון מהדק מinterneurons. () תצורת ההקלטה סביב החדר. שים לב ליבוא ו יצוא נמצא בצדדים מנוגדים של החדר כדי להשיג קרוב לזרימה למינרית. כמו כן גלוי הם recording אלקטרודות, רכוב על headstages, ואלקטרודות קרקע על שני הצדדים, כמו גם את המטרה (40X, מים טבילה) באמצע. (ב ') תמונת epifluorescent בהספק נמוך של vGAT-ונוס / אות YFP ב CA1 של ההיפוקמפוס בפרוסה. (C) ההדמיה IR-DIC של אותו האזור. החיצים בB ו C מצביעים interneuron החיובי ונוס / YFP בשכבת גוף תא. (ד ') תמונות IR-DIC גבוהים כוחו של סומה של נוירון שצוין בלוח ב', עם פיפטה תיקון מתקרבת ויוצרת גומה ב פני השטח (למעלה) ו, לאחר מכן, התא בתצורת כל התא (בחלק התחתון). (E) איור סכמטי של השלבים העיקריים של הקמת תיקון מהדק כל תא הקלטה (בצד שמאל) עם תגובות קריקטורה למתח בדיקה -pulse ניטור ההתנגדות בקצה פיפטה (בצד ימין). שורה עליונה: פיפטה באמבטיה מהתא; אמצע עליון: היווצרות גומת חן, בליוויירידה במשרעת הדופק, המצביע על עלייה מתונה בהתנגדות. אמצע תחתון: היווצרות חותמת גיגה אוהם. שים לב שמשרעת הדופק הנוכחי מצטמצם באופן דרמטי. רק זרמי קיבולי מהירים נראים בהתחלה ואת הסוף של הדופק לפני קיבול פיפטה הוא פיצוי. תחתון: תצורת הקלטת שלמות תא מושגת על ידי פריצת תיקון הקרום מתחת לקצה פיפטה. שים לב שזרמי קיבולי הגדולים אבל איטיים יחסית בהתחלה ואת הסוף של הדופק לפני פיצוי התנגדות הסדרה מוחל. (F) עקבות נציג של FS-IN (למעלה) וCA1 מחשב (בחלק תחתון), שהושרו על ידי בני משפחתו של היפר - לפולסים הנוכחי depolarizing (פרוטוקול שהוצג לעיל). שים לב לפריקת התדירות גבוהה מאוד של FS-IN בהשוואה לירי הרבה יותר איטי של מחשב CA1. ריבועים בצד ימין: השוואה בין צורת גל AP מCA1 המחשב (למעלה) וFS-IN (בחלק התחתון, בצבע אפור, מעולף על AP המחשב בשחור), הממחישים את דיfference בצורת הגל של AP ואח"פ.

איור 3
איור 3 נתיחה תרופתי של התגובה הסינפטית המתחם, בידוד iPSCs בתיווך R GABA-B האיטי בFS-IN. (א) תמונה IR-DIC של הפרוסה בחדר ההקלטה, עם אלקטרודה ההקלטה (תיקון) ממוקמת בגבול של str. אוריין (אורי.) וpyramidale (PYR.) ואלקטרודה הסימולציה (סטים) בגבול של str. radiatum (. רד) וlacunosum-moleculare (LM) (ב) משמאל:. איור סכמטי של תצורת ההקלטה. מימין: תגובות מתח על גבי בFS-IN שהושרו על ידי משפחה של היפר לdepolarizing זריקות נוכחי עקבות נציג (C) רשמו מFS-IN בתגובה לגירוי תאי.. למעלה: המתחםתגובה הסינפטי מיוצרת בACSF הרגיל שהושרו על ידי גירוי בודד (50 עוצמת V, 0.1 משך אלפיות שני). התיכון עליון: מבודד IPSC monosynaptic לאחר יישום אמבטיה של DNQX (10 מיקרומטר) וd-AP-5 (50 מיקרומטר). בינוני נמוך: iPSCs monosynaptic המהיר חסום בעקבות התוספת של gabazine (10 מיקרומטר) לאמבטיה. תחתון: רכבת של 5 גירויים (ב200 הרץ) מגלה GABA-B R איטי בתיווך IPSC (זכר שחור) אשר נחסם על ידי היישום הבא של CGP (5 מיקרומטר) לאמבטיה (זכר אפור על גבי).

איור 4
איור ניתוח .4 של אפנון presynaptic של שידור סינפטי המעכב בלזווג הקלטה מזוג FS-IN ומחשב CA1 בשילוב. () פנל משמאל: תמונת IR-DIC של שני טפטפות ההקלטה, עזב אחד תוקנו על FS-IN בגבול של < em> str. אוריין (אורי.) וpyramidale (PYR.) והזכות תוקנו על מחשב CA1 קרוב יותר לstr. radiatum (רד.). פנל ימני:. סכמטי של תצורת ההקלטה, עם תגובות מתח נציג מFS-IN (משמאל) וCA1 המחשב (מימין), בן למשפחה של קטניות הנוכחיות (B) עקבות נציג מראים נקודתי הגישה שהושרו בpresynaptic FS-IN (למעלה) וIPSC הקצר חביון יחידתי במחשב CA1 (למטה) בתנאי שליטה (עקבות בצד השמאל), לאחר יישום אמבטיה של baclofen (10 מיקרומטר, באמצע), ויישום העוקב של CGP (5 מיקרומטר, מימין) . שים לב שbaclofen הפחית את המשרעת IPSC על ידי ~ 50%, ואילו CGP הביא התאוששות כמעט מלאה של משרעת IPSC. עקבות בקרה מוצגות underlain. עלילה כמובן (C) זמן של משרעת IPSC מראה את ההשפעה של baclofen וCGP. IPSCs נרשם ב10 מרווחי שניות.

s "> איור 5
ויזואליזציה איור 5, שחזור וזיהוי immunocytochemical של FS-BC-שכותרתו biocytin נרשם. () השלכה של ערימות תפורות של תמונות של FS-IN צילם עם מטרת 20X על מיקרוסקופ confocal. Somata ממוקם בגבול של str. radiatum (רד.) וpyramidale (PYR.) של אזור CA1, דנדריטים לרוץ רדיאלית ולהקיף את כל השכבות, בעוד הרוב המכריע של האקסון נמצא בתוך ומסביב לשכבת גוף תא; כאופייני לBCS. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. הבלעה, ימני עליונה: הקרנת הגדלה גבוהה של 20 שכבות, מראה סלים אופייניים של האקסון ויצרו somata סביב משוער CA1 מחשב (כוכביות כתומות). סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר הגוף מלא biocytin התא של IN (pseudocolour הלבן, הפנל תחתון, חץ) (ב) מראה immunoreactivity לPV (בירוק פנל, עליון). בקנה מידהבר: הקרנת 20 מיקרומטר (C) של השחזור 3 ממדי של התא.. סומה ודנדריטים הם בשחור והאקסון בצבע אדום. שכבות של CA1 מסומנות בכחול. קיצורים: אורי, str. אוריין; LM, str. lacunosum-moleculare. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר.

שם הרכב (מ"מ) שימוש הערות
סוכרוז-ACSF 87 NaCl, KCl 2.5, 25 3 NaHCO, 1.25 לאא 2 PO 4, 25 גלוקוז, סוכרוז 75, 7 MgCl 2, 0.5 CaCl 2, 1 Na-פירובט, 1 Na-ascorbate הכנה ואחסון של פרוסות המוח pH = 7.4; osmolarity = ~ 350 mOsm
ACSF הקלטה 125 NaCl, KCl 2.5, 25 3 NaHCO, 1.25 לאא 2 PO 4, 25 גלוקוז, 1 MgCl 2, 1 Na-פירובט, 1 Na-ascorbate הקלטה מפרוסות המוח pH = 7.4; osmolarity = 310-315 mOsm
פתרון תאיים (1) 125 K-גלוקונאט, 10 KCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 MgCl 2, 2 Na-ATP, 0.3 Na-GTP, biocytin 1 Na-פוספט ו0.1% מילוי אלקטרודות של הקלטות GABAB IPSC pH = 7.4; osmolarity = 295-305 mOsm
פתרון תאיים (2) 105 K-גלוקונאט, 40 KCl, 10 HEPES, 0.1 EGTA, 2 MgCl 2, 2 Na-ATP, 0.3 Na-GTP, biocytin 1 Na-פוספט ו0.1% מילוי אלקטרודות להקלטות לזווג pH = 7.4; osmolarity = 295-305 mOsm
חיץ פוספט (PB) 100 מ"מ לאא 2 PO 4 שטיפת פרוסות קבועות pH = 7.4
שנאגרו מלוח פוספט (PBS) 25 מ"מ לאא 2 PO 4 </ Sub>, 154 mM NaCl (0.9% w / v) שטיפת פרוסות קבועות ודגירת נוגדן pH = 7.4
מקבע paraformaldehyde 4% w / v Paraformaldehyde, 0.1 מ"מ PB קיבוע של פרוסות המוח pH = 7.4

רשימת .1 פתרונות שולחן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מתארים שיטה המשלבת טכניקות אלקטרו וneuroanatomical לאפיין פונקציונלי נוירונים morphologically- וneurochemically המזוהים במבחנה; בפרט הסוגים השונים של תוספות מעכבות בקליפת המוח. היבטים מרכזיים של ההליך הם: (1) מיון מוקדם של אח"י הפוטנציאלי; הקלטה תאית והדמית תא עצב (2); ולבסוף ניתוח צורני וimmunocytochemical של אח"י נרשם (3). למרות שמחקר זה התייחס PV-ins בפרט, הפרוטוקול המתואר יכול לשמש להקלטות דומות מכל interneuron או סוגים אחרים עצביים, עם שינוי מינימאלי.

המספר הנמוך היחסי של interneurons באזורים בקליפת המוח שעושה בחירה אקראית והקלטה מהתאים הללו לא יעילים מאוד. לוקליזציה מסתעפת ותכונות מורפולוגיות שאפשרו לחוקרים להבחין ולתעד באופן שגרתי מסוגים מסוימים interneuron. עם זאת בפרוסות, זיהוי של מתמחהeurons ובסמוך לשכבות גוף תא עדיין קשה, כגון עם FS-ins. כניסתו של קווי עכבר מהונדסים, המבטאת את חלבוני ניאון באוכלוסיות interneuron ספציפיות מציעה פתרון אלגנטי שהופך את המיון מוקדם והקלטה של הנוירונים האלה הרבה יותר יעיל, 2. עכשיו רבים קווים מהונדסים, בעיקר בעכברים, אך יותר ויותר גם חולדות 13 זמינים, המאפשרים החקירה של interneurons. בעת שימוש בקווים מהונדסים, לעומת זאת, הוא חיוני כדי לבסס את הספציפיות של הביטוי העיתונאי במידה ו.

איכות של תיוג סלולארי ומורפולוגיה, כמו גם ההקלטה אלקטרו, ביקורתי תלוי בפרוסות איכות קיימא, גבוהות; שלמוח צריכה להיות גזור במהירות (באופן אידיאלי 20-40 sec), טיפל בזהירות רבה וברציפות מצוננת. אנו מוצאים כי השימוש בסוכרוז-ACSF, לפיה ריכוז הנתרן הכולל ובכך הרגישות של נוירונים מצטמצמים, דרמהtically משפר את איכות הישרדות פרוסות וinterneuron 18. עם זאת, זה צריך להיות מודגש שחוקרים רבים עשו שימוש בACSF הקלטה הסטנדרטי להכנת פרוסה, השפעה רבה 10,11,15. שלמות מורפולוגי תלויה במידה רבה על הזווית שבה פרוסות נחתכות 13; אשר משתנה מאזור לאזור וסוג התא. עם זאת, ניתן להקליט interneurons רב באופן אמין מפרוסות רוחבית, העטרה או sagittal. כדי למזער עוד יותר פיטוריהם של הדנדריטים והאקסון, תאים עמוקים יותר ברקמה צריכים להיות ממוקדים, אם כי להתפשר על איכות IR-DIC ואמינות של היווצרות חותמת גיגה אוהם. בנסיבות אלה הקלטות משני תאים פירמידליים CA1 וFS-ins ניתן באופן מהימן שהושג.

תיוג ויזואליזציה של תאי עצב מושגת הבאה הקלטה טיפוסית שנמשכת 30 דקות או יותר. אם הקלטות נמשכות פחות מ30 דקות, יש צורך לאפשר את זה פעם לפני הקיבוע כדי לאפשר יוcytin לנטרל לתוך דנדריטים דיסטלי ותהליכי axonal, הבטחת מילוי מלא ובכך שלאחר הוק ויזואליזציה של תאים.

בכל תא הקלטות, שמירה על התנגדויות סדרה נמוכות ויציבים היא הכרחית למדידה מדויקת פיזיולוגית של נכסים הסינפטי ופנימיים, כמו גם תיוג יסודי של תאי העצב. עם זאת אלקטרודות נמוכה התנגדות לאפשר דיאליזה מהירה של הציטופלסמה עם הפתרון תאיים הכלול בתוך פיפטה. השלמת הפתרון תאית עם ATP, GTP ופוספט בהחלט עוזר לשמור על אספקת האנרגיה ואיכות הקלטה. עם זאת, דיאליזה של neurochemicals וחלבון יכולה להוביל לתגובות מצומצמות, הפחיתה פלסטיות 19 וגם יכולה להפריע זיהוי neurochemical. למשל PV הוא שטף באופן עקבי מתאי העצב במהלך ניסויים ארוכים יותר. לכן, ייתכן שתידרש בדיקה של תהליכים דנדריטיים או axonal דיסטלי Dete immunoreactivity rmine של נוירון שנרשם. במקרים כאלה שבי דיאליזה כזה היא דאגה, הקלטות באמצעות תצורה מחורר-תיקון יכול להיות מנוצל כדי לשמר את הסביבה תאית 20, עם זאת התיקון חייב להיות שבור בסוף ההקלטות או נוירון לאחר מכן "repatched" בתצורה כל התא כדי לאפשר מילוי biocytin.

חקירה תרופתית של נוירונים שנרשמו היא שיטה יעילה להערכת המשמעות התפקודית של מנגנוני neuromodulatory מסתעפים בעיצוב הפעילות המהותית והסינפטי של אח"י. בשיטות שתוארו לעיל, בידוד תרופתי והקלטות לזווג משמשים כדי להעריך את השפעות תיווך R הודעה וGABA presynaptic B, בהתאמה; עם זאת אפשר בקלות לשנות את השילוב של אגוניסטים לקולטן ואת יריבים על מנת להעריך את תפקידן של משפחות קולט חלופיות, למערכת הקנבינואידים 21 ירושלים.

"> היסטולוגית ועיבוד immunocytochemical של תאים שנרשמו הוא אמין ביותר, ברגע שפרוטוקולים מבוססים. פרוטוקול immunocytochemistry המתואר כאן כבר מכוון ביחס לשילוב של נוגדנים המשמשים, עובי פרוס ודרישה לזהות את תוכן neurochemical. אנו מנצלים עזים בסרום נורמלי כמו כל הנוגדנים משני המשמשים גדלים בעז. כחלופות, אפשר גם להשתמש באלבומין בסרום שור (BSA) או אבקת חלב כחסימת סוכנים. יש לציין כי פרוטוקול זה משתמש בופר פוספט (PBS) לדגירת נוגדנים, עם זאת לחלופין אפשר פשוט להשתמש 0.1 M PB במקום PBS. שימוש ריכוז גבוה יחסי של חומרי ניקוי (0.3% TritonX-100), אינו מפחית antigenicity לכאורה, תוך מתן אפשרות לחדירה של נוגדנים ל100 שכבת מיקרומטר המשטח הראשונה של הפרוסה , שבו תאי עצב נרשמים באופן שיגרתי. אם תאים עמוקים יותר נרשמים, או פרוסות עבות, מומלץ resectiעל פרוסות, באמצעות cryostat או vibratome, ולבצע immunolabeling על הסעיפים הדקים (40-70 מיקרומטר). ל300 מיקרומטר פרוסות, דגירה ארוכה של הנוגדנים (ב 4 ºC כדי לשמור על שלמות מבנית של פרוסות) מייצרת תוצאות immunocytochemical אמינות ביותר.

זיהוי של תאי העצב מסתמך על המידע המשולב שהושג בהקלטה, שלאחר הוק מורפולוגיים וניתוח immunocytochemical. בהיפוקמפוס, בשל ארגון מינרית הקפדנית, הפצת axonal היא אינדיקטור טוב של מטרות postsynaptic של interneurons. ניתק האקסון או הדנדריטים, לעומת זאת, יכול להפוך את זיהוי קשה או בלתי אפשרי. יתר על כן, חלק מהעמימות נשארת, למשל בהבחנת BCS PV + וinterneurons Axo-axonic, בשל דמיון בלוקליזציה axonal הכוללת. זיהוי סופי סופי ידרוש ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים של מטרות postsynaptic 1,3 or נתיחת immunocytochemical נוספת 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לנד Wolter לקבלת הסיוע הטכני המעולה שלה. חולדות מהונדסים VGAT-ונוס נוצרו על ידי בני הזוג. י 'Yanagawa, מ' Hirabayashi וי 'קוואגוצ'י במכון הלאומי למדעים פיסיולוגיים, אוקזקי, יפן, באמצעות pCS2-ונוס הניתן על ידי ד"ר א' מיאווקי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transgenic vGAT-venus rats see Uematsu , et al., 2008
Venus (515 nm) goggles BLS Ltd., Hungary
Dissection tools i.e. FST For brain removal
Vibratome Leica VT1200S Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope Olympus, Japan BX50WI With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera Till Photonics VX55
505 nm LED system Cairn Research OptiLED system Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. 
Multiclamp 700B  Axon Instruments Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers 
WinWCP acquisition software John Dempster, Strathclyde University Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. 
Electrode Puller Sutter P-97 Used with box-filament
Borosilicate pipette glass Hilgenberg, Germany 1405020 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump Gilson Minipuls Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer Custom made
Digital Manometer Supertech, Hungary
Isolated constant voltage stimulator Digitimer Ltd. DS-2A
Biocytin Invitrogen B1592 Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine 
DL-AP5(V) disodium salt Abcam Biochemicals ab120271
DNQX disodium salt Abcam Biochemicals ab120169 Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531) Abcam Biochemicals ab120042 Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen Abcam Biochemicals ab120325
CGP-55,845 hydrochloride Tocris 1248
Streptavidin 647 Invitrogen S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody Swant, Switzerland 235 Working concentration 1:5,000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody  Invitrogen A11030 If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum Vector Labs S-1000
Microscopy slides Any high quality brand
Glass coverslips Usually 22 x 22 mm
Agar spacers Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope Olympus, Japan Fluoview FV1000 Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ) http://fiji.sc/Fiji See Schindelin et al., 2012

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
  2. Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
  3. Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
  4. Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
  5. Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
  6. Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
  7. Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
  8. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
  9. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  10. Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
  11. Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
  12. Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
  13. Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
  14. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
  15. Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
  16. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  18. Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
  19. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
  20. Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
  21. Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
  22. Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).

Tags

Neuroscience גיליון 91 אלקטרופיזיולוגיה פרוסה חריפה הקלטת תיקון מהדק כל התא מורפולוגיה עצבית immunocytochemistry parvalbumin ההיפוקמפוס עיכוב interneurons GABAergic שידור סינפטי IPSC GABA-B קולטן
הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Booker, S. A., Song, J., Vida, I.More

Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J. Vis. Exp. (91), e51706, doi:10.3791/51706 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter