Summary
Reti corticali sono controllati da un piccolo, ma diverso insieme di interneuroni inibitori. Indagine funzionale degli interneuroni richiede quindi la registrazione mirata e l'identificazione rigorosa. Qui descritto è un approccio combinato che coinvolge le registrazioni whole-cell da coppie singole o sinapticamente-accoppiati di neuroni con etichettatura intracellulare, post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica.
Abstract
Interneuroni inibitori GABAergici svolgono un ruolo centrale nei circuiti neuronali del cervello. Interneuroni comprendono un piccolo sottoinsieme della popolazione neuronale (10-20%), ma mostrano un elevato livello di eterogeneità fisiologica, morfologica, e neurochimici, che riflettono le loro diverse funzioni. Pertanto, l'indagine di interneuroni fornisce importanti informazioni ai principi di organizzazione e funzionamento dei circuiti neuronali. Ciò, tuttavia, richiede un approccio fisiologico e neuroanatomica integrato per la selezione e l'identificazione dei tipi di interneuroni individuali. Whole-cell patch-clamp registrazione da acuta fettine di cervello di animali transgenici, che esprimono proteine fluorescenti sotto i promotori di marcatori specifici di interneuroni, fornisce un metodo efficace per individuare e caratterizzare elettrofisiologicamente proprietà intrinseche e sinaptiche di tipi di interneuroni specifici. Combinato con etichettatura colorante intracellulare, questo approccio può essere esteso con il post-hoc moanalisi rphological e immunocitochimica, consentendo l'identificazione sistematica dei neuroni registrati. Questi metodi possono essere personalizzati per soddisfare una vasta gamma di questioni scientifiche riguardanti le proprietà funzionali dei diversi tipi di neuroni corticali.
Introduction
Circuiti neuronali ippocampali sono da tempo oggetto di intenso esame, per quanto riguarda sia l'anatomia e la fisiologia, a causa del loro ruolo essenziale nell'apprendimento e nella memoria, così come la navigazione spaziale in entrambi gli esseri umani e roditori. Analogamente, l'organizzazione laminare prominente, ma semplice dell'ippocampo rende questa regione un soggetto privilegiato di studi che riguardano proprietà strutturali e funzionali di reti corticali.
Circuiti dell'ippocampo sono costituiti da cellule eccitatorie principali (> 80%) e una più piccola (10-20%), ma altamente diversificata coorte di interneuroni inibitori 1-3. Interneuroni liberano acido γ-aminobutirrico (GABA) dai loro terminali assoni che agisce a ionotropici veloce recettori GABA A (GABA A Rs) e lenti metabotropici GABA B recettori GABA B (Rs) 4. Questi meccanismi inibitori controbilanciano di eccitazione e regolano l'eccitabilità delle cellule principali, e quindi latempi ir e modello di scarico. Tuttavia, GABA rilasciato da interneuroni agisce non solo sulle cellule principali, ma anche sugli stessi interneuroni 5,6. Recettori pre e post-sinaptici mediano di regolazione di ritorno e inibitori delle interazioni reciproche tra i vari tipi di interneuroni. Questi meccanismi inibitori nelle reti interneuroni sono ritenuti essere centrale per la generazione e la sagomatura di modelli di attività della popolazione, in particolare le oscillazioni a frequenze diverse 7.
Whole-cell patch-clamp registrazione è un metodo consolidato per l'esame delle proprietà intrinseche e delle interazioni sinaptiche dei neuroni. Tuttavia, a causa della elevata diversità di tipi di interneuroni, ricerca di interneuroni inibitori richiede rigorosa identificazione delle cellule registrate. Come tipi di interneuroni dell'ippocampo sono caratterizzati da elementi particolari morfologici e l'espressione marcatore neurochimico, anatomico combinata e immunocitochimica eSAME può fornire un mezzo per determinare l'identità precisa 6,8,9 interneuroni.
Nel presente lavoro si descrive un approccio sperimentale in cui whole-cell patch-clamp da neuroni singoli o coppie sinapticamente-accoppiati sono combinati con etichettatura intracellulare, seguito dal post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica, permettendo la caratterizzazione di lenta GABA B recettore mediata effetti inibitori di interneuroni identificati. Come esempio, ci concentriamo su uno dei principali tipi di interneuroni, un sottoinsieme dei cosiddetti "cellule canestro" (BC), che innerva il soma e dendriti prossimali dei suoi obiettivi post-sinaptici ed è caratterizzata da un "spike veloce" (FS) scarico modello, un assone densamente che copre lo strato corpo cellulare, e l'espressione della proteina legante il calcio parvalbumina (PV) 10,11. Questi interneuroni mostrano grandi correnti inibitorie post-sinaptiche, così come pre prominentemodulazione sinaptica della loro produzione sinaptica, in risposta al GABA B R di attivazione 12. La combinazione delle tecniche descritte qui può essere applicato altrettanto bene di indagare i meccanismi intrinseci o sinaptici in una varietà di altri tipi di neuroni identificati.
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Protocol
Dichiarazione Etica: tutte le procedure e animale manutenzione sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali, la legge tedesca Animal Welfare, il Consiglio direttiva 86/609 / CEE per quanto riguarda la protezione degli animali europea, e le linee guida delle autorità locali (Berlino, T-0215/11 )
1 Preparazione di fette acuta-ippocampali
- Prendete un topo transgenico (da 17 a 24 giorni di età), che esprime la proteina fluorescente Venere / YFP sotto il promotore vGAT, che etichetta la maggior parte di interneuroni inibitori corticali 13. Decapitare il ratto. Rapidamente sezionare il cervello (<40 sec) in semifrozen, carbogenated (95% O 2/5% di CO 2) fluido a base di saccarosio-artificiale cerebrospinale (saccarosio-ACSF, Figura 1A).
- Valutare il cervello di ratto sezionato per Venus / YFP fluorescenza con 505 nm lampada e 515 filtro per le emissioni LED, montata su un paio di occhiali.
- Rimuovere il terzo anteriore della corteccia e cerebEllum; quindi separare gli emisferi, il tutto con un bisturi. Rimuovere la superficie dorsale della corteccia per fornire una superficie piana per incollare il cervello giù, come descritto in precedenza 14.
- Tagliare a fette trasversali (300 micron) della formazione dell'ippocampo su un vibratome, gli emisferi devono essere circondati da semifrozen, carbogenated saccarosio-ACSF (Figura 1B) 14. Rimuovere ulteriori regioni di rostrale della corteccia, mesencefalo e tronco encefalico. Trasferire ogni fetta di una camera di contenimento sommerso contenenti saccarosio-ACSF, che è carbogenated e riscaldato a 35 ° C.
- Lasciate le fette di recuperare a 35 ° C per 30 minuti dal momento dell'ultima fetta di entrare nel ACSF riscaldato. Fate questo in modo da riattivare i processi metabolici e facilitare la richiusura dei processi neuronali tagliati. Poi il trasferimento a temperatura ambiente per lo stoccaggio (Figura 1C).
2 Fabbricazione e riempimento di registrazione Pipettes
- Pupipette di patch ll da capillari di vetro, in modo che una resistenza pipetta di 2-4 MW si raggiunge quando riempita di filtrato (filtro a siringa, dimensione dei pori: 0,2 micron) soluzione intracellulare contenente 0,1% biocitina (per l'etichettatura intracellulare). Mantenere la soluzione intracellulare raffreddato in ghiaccio per impedire il degrado dei suoi componenti.
- Riempire pipette di patch per l'identificazione delle correnti post-sinaptiche con una soluzione contenente un basso Cl fisiologicamente rilevanti - concentrazione (E R (Cl) = -61 mV; vedi elenco soluzione).
- Per le registrazioni coppie di identificare le risposte recettore mediata presinaptiche, riempire pipette di patch con la soluzione intracellulare con bassa capacità di Ca 2 + buffer per evitare interferenze con il rilascio del trasmettitore presinapticamente, così come 4 volte superiore Cl - concentrazione (E R (Cl) = -20 mV) per migliorare il rapporto segnale-rumore di IPSCs osservati 5 consentano una valutazione accurata di resp farmacologicaonsiveness. Si noti che la modifica Cl - concentrazione può alterare IPSC cinetica 15.
3. cellule intere patch-clamp Registrazione da FS-INS
- Carbogenate ACSF e alimentare attraverso il sistema di perfusione alla camera di registrazione, per mezzo di una pompa peristaltica (che rimuove anche ACSF dalla camera di registrazione attraverso una linea di aspirazione, la Figura 2A). Accendere tutte le apparecchiature del setup in preparazione per la registrazione.
- Trasferire una fetta di camera di registrazione e tenere in posizione con un anello in platino infilate con singole fibre di seta. Posizionare la fetta in modo che lo strato (str.) Pyramidale di CA1 scorre verticalmente attraverso il campo di vista, consentendo l'accesso con 2 pipette sia alla str. radiatum e str. Oriens contemporaneamente (Figure 2C e 4A).
- Posizionare la camera nel setup e avviare la perfusione di carbogenated e riscaldata (32-34 ° C) la registrazione di unCSF a una portata di 5-10 ml / min.
- Valutare la qualità fetta sotto l'ottica IR-DIC a 40X di ingrandimento obiettivo, e visualizzare con una camera CCD visualizzata su un display. Assumere buona qualità fetta se un gran numero di rotonde, moderatamente contrasto cellule CA1 piramidali CA1 (PC) può essere visto in str. pyramidale a profondità di 20-30 micron di sotto di una superficie liscia e leggermente crateri (Figura 2C). Fette di scarsa qualità contengono un gran numero di cellule altamente contrastati, rimpicciolite o gonfie, con una superficie fetta irregolare.
- Identificare putativi interneuroni FS sotto illuminazione epifluorescenza come quelli che esprimono Venere / YFP (Figura 2B), con ampio somata multipolare dentro o vicino alla str. pyramidale. Selezionare le celle ragionevolmente profondo all'interno della slice (50-100 micron, Figura 2C), al fine di preservare meglio l'integrità morfologica.
- Montare l'elettrodo di registrazione nel supporto pipetta sulla headstage; poi apply bassa, pressione positiva (20-30 mBar) attraverso la linea tubo. Abbassare la pipetta alla superficie della fetta, leggermente spostata verso il centro del neurone selezionato.
- Ottenere configurazione di registrazione whole-cell come descritto in precedenza 14,16 e vedi anche figure 2D e 2E:
- Obiettivo di una cella: Aumentare la pressione di 70-80 mBar e rapidamente abbassare la pipetta con la fetta appena sopra la soma della cella selezionata (Figura 2D, in alto).
- Avvicinarsi alla cella: Premere la pipetta contro la membrana cellulare per produrre una "fossetta" su di esso (Figura 2D, in alto). Eseguire questo passaggio rapido, al fine di evitare l'etichettatura biocitina delle cellule vicine.
- Creare un sigillo giga-ohm: Rilasciare la pressione e contemporaneamente applicare un comando di tensione 20 mV alla pipetta. Una guarnizione giga-ohm (1-50 GΩ; la figura 2D, fondo e figura 2E centro) typicalleato si sviluppa rapidamente. Una volta sigillato, applicare la membrana a riposo previsto potenziale (tipicamente tra -70 e -60 mV) come comando di tensione.
- Sfondare la patch: Una volta sigillato, rottura la patch di membrana con un breve impulso di pressione negativa; ottenendo così la configurazione whole-cell (Figura 2E, in basso).
- Compensare capacità whole-cell e la resistenza serie (S R). R s è normalmente 5-20 MW e stabile per un massimo di 120 min. Abbandonare le cellule se potenziale di membrana (V M) sul break-through è più depolarizzata a -50 mV; R S è inizialmente superiore a 30 MW; R o S cambia di più del 20% nel corso della registrazione.
- Identificare FS-in da loro risposta (in modalità current-clamp) per una famiglia di iper per depolarizzanti impulsi di corrente (-250 a +250 pA, Figura 2F, in alto). FS-in sono relativamente depolarizzata V M (tipicamente -50 to -60 mV), a breve membrana costante di tempo (<20 msec) e rispondere ad un 500 pA depolarizzante iniezione di corrente con un treno di potenziali d'azione (AP) a frequenze> 100 Hz 11 (Figura 2F, in basso), che sono marcatamente diversi da quelli in CA1 PC (Figura 2F, al centro).
4. extracellulare stimolazione elettrica per evocare risposte GABA B R-mediata
- Per osservare le risposte sinapticamente evocate, posizionare un elettrodo di stimolazione extracellulare (una pipetta di patch piena di 2 M NaCl; Resistenza: 0,1-0,3 MW) nella fetta al confine di str. radiatum e str. lacunosum-moleculare. Posizionare l'elettrodo 200-300 micron laterale alla soma per evitare la stimolazione elettrica diretta della cellula e ridurre al minimo gli artefatti di stimolazione (Figura 3a).
- Una volta che l'elettrodo di stimolazione viene posizionato, di ottenere la registrazione whole-cell dila cella scelto e valutare il fenotipo fisiologico in modalità current-clamp, come nella sezione 3.9 (Figura 3B).
- Con il neurone registrato in voltage-clamp (V M -65 mV), consegnare la stimolazione elettrica degli assoni presinaptici a 50 V (~ 500 μA stimolo efficace) ogni 20 secondi, con un isolato a tensione costante stimolatore. Utilizzare solo stimoli (100 msec durata, Figura 3C, in alto) per osservare GABA B R IPSCs mediate, e interleave con treni di stimoli multipli (a 200 Hz) per produrre maggiore rilascio del trasmettitore.
- Bagno applicare ionotropici antagonisti dei recettori del glutammato (AMPA dei recettori: DNQX [10 mM]; recettore NMDA: D-AP5 [50 mM]) per rivelare isolato monosinaptico IPSC (Figura 3C, medio-alta). Inoltre isolare il IPSC GABA B R-mediata con l'applicazione di un bloccante GABA A R (gabazine [10 mM]; Figura 3C mezzo lower).
- Confermare la conseguente lenta verso l'esterno di corrente (Figura 3C inferiore, espanso) ad essere GABA B R-mediata dalla successiva applicazione di CGP-55845 [5 mM] (Figura 3C inferiore, giacente in grigio)
5. accoppiati registrazioni di sinapticamente accoppiate FS-IN e CA1 PC
- Valutare GABA B R-mediata controllo presinaptica della trasmissione sinaptica inibitoria con le registrazioni simultanee, eseguiti tra sinapticamente-accoppiati IN e PC coppie come descritto di seguito.
- In primo luogo, stabilire una registrazione a cellula intera di un interneuroni presinaptico (come al punto 3) e confermare il fenotipo FS (Figura 4A).
- Poi patchare un CA1 PC vicina (distanza 20-100 micron, Figura 4A) e applicare breve suprathreshold impulsi di corrente depolarizzante (durata 1 msec, 1-5 nA ampiezza) al presinaptica IN (tenutasi in modalità current-clamp) per suscitare AP. Se un co sinapticannection è presente, AP nel risultato IN nel IPSCs nel CA1 PC, tenutasi in voltage-clamp (compensare R S a circa il 80%).
- Se necessario, riempire un nuovo elettrodo di registrazione e registrare da altri PC CA1 finché non si trova una connessione.
- Una volta che la connessione è stabilita, suscitare coppie di AP nel presinaptico FS-IN per valutare sia la risposta sinaptica unitario e comportamento dinamico. Utilizzare un tipico protocollo accoppiato impulsi di 2 stimoli depolarizzanti con un intervallo di 50 msec (Figura 4B).
- Raccogliere le tracce di controllo in condizioni basali. Quindi, applicare i GABA B baclofen R agonisti selettivi (10 micron) per la ACSF perfusione, attivando così GABA B Rs, seguita da antagonista CGP-55845 (5 mM), per bloccare completamente gli effetti del recettore mediata. Raccogliere ~ 50 tracce durante lo stato stazionario di ciascuna condizione di farmaco (Figura 4B e C).
- Una volta che la registrazione è completata, sigillare la membrana somatica formando un Outside-out patch: Lentamente ritirare la pipetta dal corpo cellulare in V-clamp e come R S aumenta, ridurre la V M a -40 mV. Fate questo per facilitare la formazione del cerotto esterno-out; quindi rimuovere la pipetta dal bagno.
6 Analisi delle proprietà elettrofisiologiche
- NOTA: Una moltitudine di diversi pacchetti software sono disponibili per l'acquisizione dei dati elettrofisiologici. Qui, WinWCP, viene utilizzato un programma di Windows nel pacchetto Strathclyde Elettrofisiologia software libero, che permette di registrare fino a 16 canali di ingresso analogici e l'uscita di 10 segnali digitali.
- Filtro passa-basso tutti i dati a 5-10 kHz e campione a 20 kHz.
- Analizzare i dati fisiologici con una suite di analisi off-line.
NOTA: Stimfit, un pacchetto software open source che include una shell Python, è usato in questo caso; comunque altre alternative possono essere facilmente utilizzati al posto.- Analizzare membrana passiva proprietà di neuroni registrati, acquisite nel morsetto corrente, dal potenziale di membrana.
- Misurare la media potenziale di membrana dalla linea di base delle risposte registrate dall'inizio della registrazione.
- Calcolare la resistenza di ingresso, utilizzando la legge di Ohm, dalla risposta di tensione ai più piccoli impulsi di corrente iperpolarizzanti (≤ -50 pA). Per migliorare rapporto segnale-rumore, la media più tracce. Nota: i nostri esempi sono tipicamente medie di 10-50 singoli spazza.
- Stimare il tempo membrana apparente costante montando una curva monoesponenziale al decadimento delle risposte ai più piccoli impulsi di corrente iperpolarizzanti.
- Analisi del potenziale d'azione della forma d'onda per determinare la soglia, ampiezza (soglia di picco) e la durata (larghezza misurata a metà altezza) suscitata da soglia impulsi di corrente depolarizzante.
- Analizzare GABA B R IPSCs mediate dalle registrazioni clamp di tensione. Filtro traccia off-line all'indirizzo500 Hz (filtro gaussiano) e valutare l'ampiezza di picco e la latenza del GABA B R risposta mediata (in medie di almeno 10 tracce).
- Rileva l'effetto del GABA B Rs sull'uscita inibitorio di Ins come un cambiamento di ampiezza di picco delle IPSCs GABA A R-mediati misurati tra picco e precedente linea di base. Calcolare l'ampiezza media da ≥50 tracce per il periodo di controllo e lo stato stazionario di tutte le epoche farmacologici.
7 Visualizzazione e immunocitochimica di FS-Ins
- Dopo le registrazioni, fissare le fette per immersione in paraformaldeide al 4% con 0.1 M tampone fosfato (PB, pH = 7,35) O / N a 4 ° C.
- Se fette necessari possono essere trasferiti PB e conservati fino a ~ 1 settimana prima trasformazione.
- Lavare le fette liberamente in PB fresco e successivamente a 0,025 M PB con il 0,9% di NaCl (PBS, pH = 7.35).
- Per ridurre l'anticorpo non specifico vincolante, bloccare le fette for 1 ora a temperatura ambiente in una soluzione contenente 10% di siero di capra normale (NGS), 0,3% Triton-X100 (un detergente per permeabilize membrane) e lo 0,05% NaN 3, costituito in PBS.
- Per etichettare per l'espressione PV, utilizzare un anti-PV topo monoclonale diluito in una soluzione contenente 5% NGS, 0.3% Triton-X100, 0,05% NaN 3, in PBS. Incubare anticorpi primari per 2-3 giorni a 4 ° C 12. Sciacquare accuratamente le fette in PBS.
- Applicare anticorpi secondari anti-topo fluorescenti (ad es AlexaFluor-546.) Insieme alla biotina streptavidina-binding protein, coniugato a un fluorocromo (ad esempio, AlexaFluor-647); e incubare in una soluzione contenente 3% NGS, 0.1% Triton-X100, 0,05% NaN 3, diluito in PBS e incubare O / N a 4 ° C.
- Liberamente sciacquare fette 2-3x con PBS seguiti da 2-3 risciacqui in PB. Montare le fette su vetrini. Utilizzare un agar distanziale 300 micron per evitare che la fetta di collassare. Fette di Cover-scivolo con una fluoresmezzo di montaggio cento e tenuta con unghie vernice.
8 Imaging e ricostruzione di Visualized FS-Ins
- Visualizza le fette con un microscopio confocale a scansione, con il giornalista fluorochome eccitato con la linea laser appropriata (diodo laser 635 nm per AlexaFluor-647; Elio-Neon 543 nm per AlexaFluor-546 etichettatura per il fotovoltaico e Argon 488 o 515 nm per Venus / YFP).
- Prendere le immagini a un Z-risoluzione appropriata (tipicamente 0,5-1 micron passi, usando un obiettivo 20X) per produrre una Z-stack di tutta la cellula. Più pile sono normalmente necessari per l'immagine tutta la cella, che può essere digitalmente cucita off-line utilizzando FIJI / software ImageJ (Figura 5A).
- Ricostruire la cella dalla pila immagine cucita utilizzando un metodo di analisi semi-automatica (semplice plugin neuriti Tracer in FIJI / ImageJ pacchetto software 17, Figura C).
- Infine, valutare il PV-immunoreattività della interneuron con una lente obiettivo ad alta apertura numerica (60X silicio-immersion, NA = 1.3). Rendere le immagini del soma, dendriti prossimali e assoni prossimale, o in alternativa di terminali assoni se washout somatica del fotovoltaico è troppo forte. Le cellule sono considerati immunoreattive per PV se immuno-etichettatura è visto ad allineare con le strutture biocitina marcati (Figura 5B).
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Representative Results
A condizione che la qualità fetta è sensibilmente buona, la registrazione da entrambi CA1 PC e FS-in possono essere raggiunti con difficoltà minima. La linea di topo transgenico che esprime Venere / YFP sotto il promotore vGAT 13 non identifica inequivocabilmente FS-in, o anzi jacket. Tuttavia registrazioni da INs in ed intorno a str. piramidale, dove la densità di FS-in è in genere alta 1, si traduce in una elevata probabilità di selezionare FS-in (Figura 2B). FS-in possono essere distingue per le loro caratteristiche proprietà fisiologiche diverse da quelle di entrambi i PC CA1 e RS-in. Hanno una membrana depolarizzata relativamente a riposo potenziale (-58,9 ± 1,5 mV, 15 celle, contro -62,6 ± 1,1 mV in CA1 PC, 26 celle), a bassa resistenza di ingresso (92 ± 12 vs 103 ± MW 14 MW nei PC) e veloce costante di tempo della membrana apparente (15.4 ± 2.6 vs 22.0 msec ± 2,7 msec nei PC), Resulting a risposta rapida tensione iperpolarizzante impulsi di corrente (Figura 2F). FS-in scaricata potenziali d'azione molto breve (0.38 ± 0.01 msec) della relativamente bassa ampiezza (82,8 ± 1,0 mV) seguito da molto prominente afterhyperpolarization veloce (media ampiezza 22,6 ± 2,9 mV). In risposta a impulsi di corrente di grandi dimensioni depolarizzanti (250 Pa), FS-ins sparato alle alte frequenze (82 ± 10 Hz; Range: 34-128 Hz; la figura 2D, a sinistra).
Per valutare GABA B R-mediata correnti postsinaptiche in FS-in, farmacologicamente isolate risposte sinaptiche sono stati suscitato dalla stimolazione extracellulare delle fibre inibitorie alla str. radiatum / lacunosum-moleculare confine. figura 3 mostra un esempio di un FS-IN, in cui il blocco sequenziale dei componenti della risposta sinaptica composto isola il monosinaptico GABA B R-mediata lento IPSC. Risposte sinaptiche sono stati elicitato da singoli stimoli o treni di stimoli 3-5 (50 V intensità, durata 0,1 msec, consegnato a 200 Hz) per la str. lacunosum-moleculare / border radiatum (Figura 3A). La risposta iniziale composto compresi i componenti sia eccitatorie e inibitorie (Figura 3C, in alto) è stato fortemente ridotto mediante l'applicazione di bagno AMPA e NMDA antagonisti dei recettori (DNQX, 10 mM e AP-5, 50 mM, rispettivamente: Figura 3C, al centro). Il residuo monosinaptico IPSC comprende una prima veloce verso l'interno corrente (un putativo verso l'interno Cl - corrente mediata in possesso di potenziale -65 mV, con una potenziale inversione di circa -60 mV, in questi esperimenti) e una lenta corrente verso l'esterno (mediata da un putativo K + conduttanza con un potenziale vicino inversione a 100 mV). Applicazione della selettiva GABA A R antagonista gabazine (SR-95531, 10 mM) ha abolito il digiuno IPSC, lasciando unisolato il lento GABA B R-mediata IPSC (Figura 3C, sotto, tracce nere); che è stato osservato in risposta alla stimolazione singolo, ma più chiaramente in risposta a brevi treni di stimoli. Questa risposta è stata confermata come GABA B R-attivato K + conduttanza, come è stato bloccato dalla antagonista potente e selettivo CGP-55845 (CGP, 5 mM, Figura 3C, fondo, grigio traccia). FS BCs mostrano tipicamente grandi IPSCs R-mediata ampiezza GABA B, come indicato nel nostro recente pubblicazione 12.
Per valutare regolazione presinaptica di FS-IN Uscita inibitorio GABA B da Rs, registrazioni accoppiati sono stati eseguiti da sinapticamente-accoppiati PC FS-IN e CA1. Connettività sinaptica tra FS BC e PC CA1 è relativamente alto, come mostrato in precedenza 1,3. In queste registrazioni, come illustrato in precedenza, la probabilità di accoppiamento è oltre il 50% tra le coppie di cellule strettamente localizzati (≤50 micron;
Una volta che la registrazione era stata completata, una patch fuori-out formata correttamente, le fette sono stati fissati durante la notte e successivamente trattati per visualizzare e analizzare la morfologia delle cellule registrate e determinare il loro contenuto marcatore neurochimico. Figura 5A illustra la morfologia di un rappresentante FS BC in una proiezione di stack di immagini combinati ottenuti su un microscopio confocale. L'espressione del cellulare del fotovoltaico è stata confermata in etichettatura immunocitochimica che ha dato un chiaro segnale immuno-over del corpo cellulare e dendriti prossimali del registrato e cellule biocitina-marcato (Figura 5B). Ricostruzione tridimensionale della cella è stata effettuata da pile di immagine cucita utilizzando il semplice plugin neuriti Tracer nel software FIJI (Figura 5C) 17. L'assone ha mostrato una elevata densità di collaterali e vicino alla str. pyramidale con &# 8220; panieri "formate intorno alla somata di CA1 PC (Figura 5A, incasso), individuando putatively questa cella come BC. Inoltre, la localizzazione del soma vicino a str. pyramidale e dendriti radialmente orientati abbracciano tutti i livelli della CA1 corrispondono bene alla caratteristica tipica morfologica delle FS BC 10.
In sintesi, nelle registrazioni intero-cellulari ottenute dalla identificato FS PV + jacket, abbiamo dimostrato che queste cellule esprimono grandi R-mediata ampiezza GABA B IPSCs lenti e il loro output sinaptico è anche notevolmente inibita mediante l'attivazione di recettori GABA B presinaptici.
Figura 1 Preparazione di acuta fettine di ippocampo. (A) Un cervello di ratto appena sezionato. Notare il ghiaccio che circonda il cervello, mantenendola temperatura di tutto il cervello vicino a 0 ° C. (B) Taglio di 300 micron fettine di ippocampo in un vibratomo Leica VT1200S. Gli emisferi sono allineate in modo che la superficie corticale viene tagliato prima. Si noti la grande quantità di ghiaccio fangosa che circonda gli emisferi e la carbogenation costante del ghiaccio ACSF (freccia). (C) Dopo aver tagliato le fette di cervello vengono spostati riscaldato saccarosio-ACSF. Le fette sono stati girati e prepararono per rimuovere il proencefalo e mesencefalo, lasciando solo l'ippocampo e la corteccia sovrastante.
Figura 2 Whole-cell registrazione patch-clamp da interneuroni. (A) La configurazione di registrazione intorno alla camera. Nota l'afflusso e deflusso sono ai lati opposti della camera per ottenere una vicino al flusso laminare. Visibili sono anche il recording elettrodi, montati sulle headstages, e gli elettrodi di terra sui due lati, così come l'obiettivo (40X, acqua-immersion) nel mezzo. (B) a bassa potenza immagine epifluorescente del / segnale YFP vGAT-Venere in il CA1 dell'ippocampo in una fetta. (C) di imaging IR-DIC della stessa area. Le frecce in B e C indicano un interneuroni positivo Venere / YFP nello strato corpo cellulare. (D) immagini IR-DIC-alta potenza del soma del neurone indicato nel pannello B, con una patch pipetta avvicina formare la fossetta sul superficie (in alto) e, successivamente, la cella nella configurazione whole-cell (in basso). (E) Illustrazione schematica delle principali fasi di stabilire un whole-cell patch-clamp registrazione (lato sinistro) con le risposte dei cartoni animati di una tensione di prova -pulse monitoraggio della resistenza alla punta della pipetta (lato destro). Top riga: Pipettare nel bagno fuori dalla cella; Metà superiore: formazione Dimple, accompagnato da unriduzione dell'ampiezza dell'impulso, che indica un moderato aumento della resistenza. Metà inferiore: Giga-ohm formazione sigillo. Si noti che l'ampiezza dell'impulso di corrente si riduce drasticamente. Solo le veloci correnti capacitive sono visibili all'inizio e alla fine dell'impulso prima pipetta capacità viene compensata. In basso: configurazione di registrazione Whole-cell si ottiene rompendo la patch membrana sotto la punta della pipetta. Si noti che le grandi ma relativamente lente correnti capacitive all'inizio e alla fine dell'impulso prima compensazione resistenza serie viene applicato. (F) tracce rappresentativi di un FS-IN (in alto) e CA1 PC (basso), indotte da una famiglia di iper - per depolarizzanti impulsi di corrente (protocollo mostrato sopra). Si noti l'elevata frequenza di scarica delle FS-IN rispetto alla cottura molto più lento del PC CA1. Inserti a destra: Confronto della forma d'onda AP dal CA1 PC (in alto) e la FS-IN (in basso, in grigio, sovrapposto sul PC AP in nero), che illustrano il difference nella forma d'onda della AP e l'AHP.
Figura 3 dissezione farmacologica della risposta sinaptica composto, isolando IPSCs R-mediata lenti GABA B in un FS-IN. (A) immagine IR-DIC della fetta in camera di registrazione, con l'elettrodo di registrazione (Patch) posto al confine della str. Oriens (Ori.) e pyramidale (Pyr.) e l'elettrodo di simulazione (Stim) al confine della str. radiatum (. Rad) e lacunosum-moleculare (LM) (B) A sinistra:. Illustrazione schematica della configurazione di registrazione. Destra: sovrapposta risposte tensione nelle FS-IN indotte da una famiglia di iper per depolarizzanti iniezioni di corrente (C) Rappresentante tracce registrate dalla FS-IN in risposta alla stimolazione extracellulare.. Top: Il compostorisposta sinaptica prodotto in ACSF normale indotta da un singolo stimolo (intensità 50 V, 0,1 durata msec). Medio alto: Isolato monosinaptico IPSC dopo l'applicazione bagno di DNQX (10 micron) e d-AP-5 (50 micron). Medio basso: I veloci IPSCs monosinaptici è bloccato dopo l'aggiunta di gabazine (10 mM) al bagno. In basso: Un treno di 5 stimoli (a 200 Hz), rivela una lenta GABA B R mediata IPSC (traccia nera) che viene bloccato da una successiva applicazione di CGP (5 mM) al bagno (sovrapposto traccia grigio).
Figura 4 Analisi della modulazione presinaptica della trasmissione sinaptica inibitoria in un accoppiato registrazione da un FS-IN e CA1 PC coppia accoppiata. (A) A sinistra: immagine IR-DIC dei due pipette di registrazione, la sinistra patchato sulla FS-IN al confine del < em> str. Oriens (Ori.) e pyramidale (Pyr.) e il diritto patch su un PC CA1 più vicino alla str. radiatum (Rad.). Pannello di destra:. Uno schema della configurazione di registrazione, con le risposte di tensione rappresentativi della FS-IN (sinistra) e CA1 PC (a destra) a una famiglia di impulsi di corrente (B) tracce rappresentativi che mostrano i punti di accesso suscitate nei presinaptico FS-IN (in alto) e la breve latenza unitario IPSC nel CA1 PC (in basso) in condizioni di controllo (tracce a sinistra), dopo l'applicazione bagno di baclofen (10 micron, al centro), e la successiva applicazione di CGP (5 mM, a destra) . Si noti che baclofen riduce l'ampiezza IPSC dal ~ 50%, mentre CGP ha comportato un quasi pieno recupero dell'ampiezza IPSC. Tracce di controllo vengono mostrati giacente. (C) Tempo di corso grafico della ampiezza IPSC mostra l'effetto del baclofen e CGP. IPSCs sono stati registrati ad intervalli di 10 sec.
Figura 5 Visualizzazione, la ricostruzione e l'identificazione immunocitochimica di un biocitina marcato registrato FS-BC. (A) Una proiezione di pile cucite di immagini di un FS-IN ripreso con un obiettivo 20X su un microscopio confocale. Il somata si trova al confine della str. radiatum (Rad.) e pyramidale (Pyr.) dell'area CA1, i dendriti corrono radialmente e coprono tutti i livelli, mentre la maggior parte degli assoni si trova dentro e intorno allo strato corpo cellulare; come tipico per jacket. Scala bar: 100 micron. Inset, in alto a destra: alta proiezione di ingrandimento di un 20 strati, mostrando cesti tipici di assoni che formano intorno putativo somata PC CA1 (asterischi arancione). Scala bar:. 10 micron (B) Il corpo biocitina pieno cella del IN (pseudocolour bianco, pannello inferiore, freccia) mostra immunoreattività per il fotovoltaico (in verde, pannello superiore). Scalabar.: 20 micron (C) Proiezione della ricostruzione 3-dimensionale della cella. Il soma e dendriti sono in bianco e l'assone di colore rosso. Strati di CA1 sono delineate in blu. Abbreviazioni: Ori, str. Oriens; LM, str. lacunosum-moleculare. Scala bar: 100 micron.
| Nome | Composizione (mM) | Usa | Note |
| Saccarosio-ACSF | 87 NaCl, 2.5 KCl, 25 NaHCO 3, 1.25 NaH 2 PO 4, 25 glucosio, saccarosio 75, 7 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, 1 Na-piruvato, 1 Na-ascorbato | Preparazione e stoccaggio di fette di cervello | pH = 7.4; osmolarità = ~ 350 mOsm |
| ACSF registrazione | 125 NaCl, 2.5 KCl, 25 NaHCO 3, 1.25 NaH 2 PO 4, 25 di glucosio, 1 MgCl | Registrazione da fette di cervello | pH = 7.4; osmolarità = 310-315 mOsm |
| Soluzione intracellulare (1) | 125 K-gluconato, 10 KCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 MgCl 2, 2 Na-ATP, 0.3 Na-GTP, 1 Na-fosfocreatina e 0,1% biocitina | Riempimento elettrodi di registrazioni GABAB IPSC | pH = 7.4; osmolarità = 295-305 mOsm |
| Soluzione intracellulare (2) | 105 K-gluconato, 40 KCl, 10 HEPES, 0.1 EGTA, 2 MgCl 2, 2 Na-ATP, 0.3 Na-GTP, 1 Na-fosfocreatina e 0,1% biocitina | Riempimento di elettrodi per le registrazioni appaiati | pH = 7.4; osmolarità = 295-305 mOsm |
| Tampone fosfato (PB) | 100 mM NaH 2 PO 4 | Risciacquo fette fissi | pH = 7,4 |
| Tampone fosfato salino (PBS) | 25 mM NaH 2 PO 4 </ Sub>, 154 mM NaCl (0,9% w / v) | Risciacquo fette fissi e anticorpi incubazione | pH = 7,4 |
| Paraformaldeide fissativo | 4% w / v Paraformaldeide, 0.1 PB mM | Fissazione di fette di cervello | pH = 7,4 |
Tabella elenco 1. Solutions.
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Discussion
Descriviamo un metodo che combina tecniche elettrofisiologiche e neuroanatomiche caratterizzare funzionalmente i neuroni morphologically- e neurochimico-identificati in vitro; in particolare i diversi tipi di INs inibitorie corticali. Gli aspetti principali della procedura sono: (1) pre-selezione dei potenziali INs; (2) la registrazione intracellulare e la visualizzazione dei neuroni; e infine (3) analisi morfologica e immunocitochimica di INs registrati. Sebbene questo studio ha affrontato PV-in in particolare, il protocollo descritto può essere utilizzato per registrazioni analoghe da qualsiasi interneuroni o altri tipi neuronali, con alterazione minima.
Il numero relativamente basso di interneuroni nelle aree corticali fa selezione casuale e la registrazione di queste cellule altamente inefficienti. Localizzazione divergente e le caratteristiche morfologiche hanno permesso ai ricercatori di distinguere e di routine registrare da alcuni tipi di interneuroni. Tuttavia, in fette, l'identificazione di interneurons all'interno e nei pressi degli strati del corpo cellulare resta difficile, come ad esempio con FS-in. L'avvento delle linee di topi transgenici, che esprime le proteine fluorescenti in popolazioni di interneuroni specifici offre una soluzione elegante che rende pre-selezione e la registrazione di questi neuroni molto più efficiente 2. Ora molte linee transgeniche, soprattutto topi, ma sempre più anche i ratti 13 sono disponibili, facilitando la ricerca di interneuroni. Quando si utilizzano linee transgeniche, tuttavia, è essenziale per stabilire l'entità e la specificità dell'espressione giornalista.
Qualità di etichettatura cellulare e la morfologia, così come la registrazione elettrofisiologica, criticamente dipenderà vitali, fette di alta qualità; per cui il cervello ha bisogno di essere rapidamente sezionato (idealmente 20-40 sec), gestito con molta attenzione e continuamente raffreddata. Abbiamo trovato che l'uso di saccarosio-ACSF, per cui la concentrazione di sodio e quindi il grado di eccitabilità dei neuroni è diminuito, drammacamente migliora la qualità delle fette e interneuroni sopravvivenza 18. Tuttavia, va sottolineato che molti ricercatori hanno fatto uso di ACSF registrazione standard per la preparazione fetta, di grande effetto 10,11,15. Integrità morfologica dipende in larga misura l'angolo in cui fette sono tagliate 13; che varia per regione e tipo di cellula. Tuttavia, molti interneuroni possono essere registrati in modo affidabile da fette trasversali, coronali e sagittali. Per ridurre ulteriormente rottura delle dendriti e degli assoni, le cellule più in profondità nel tessuto devono essere mirati, anche se sacrificare la qualità e l'affidabilità dei giga-ohm formazione sigillo IR-DIC. In queste circostanze registrazioni di entrambe le cellule piramidali CA1 e FS-in può essere ottenuto in modo attendibile.
Etichettatura e visualizzazione dei neuroni è ottenuta seguendo una tipica sessione di registrazione della durata di 30 minuti o più a lungo. Se le registrazioni durano meno di 30 minuti, è necessario consentire questa volta prima del fissaggio per consentire biocytin di diffondersi in dendritica distale e processi assonali, garantendo il completo riempimento e visualizzazione quindi post-hoc delle celle.
Nel registrazioni a cellule intere, mantenendo basse resistenze e stabili serie è indispensabile per la misurazione fisiologica accurata delle proprietà sinaptiche e intrinseche, nonché etichettatura approfondita dei neuroni. Tuttavia elettrodi a bassa resistenza consentono una rapida dialisi del citoplasma con la soluzione intracellulare contenuta all'interno della pipetta. Completando la soluzione intracellulare di ATP, GTP e fosfocreatina certamente aiuta a mantenere le forniture di energia e qualità di registrazione. Tuttavia, dialisi di sostanze neurochimiche e proteine può portare a risposte diminuita, ridotta plasticità 19 e può anche ostacolare l'identificazione neurochimico. Per esempio PV è costantemente lavato su neuroni nel corso di esperimenti più lunghi. Pertanto, l'esame dei processi dendritiche o assonale distale può essere richiesto di dete immunoreattività rmine del neurone registrato. In questi casi, in cui tale dialisi è una preoccupazione, le registrazioni utilizzando la configurazione forata-patch può essere utilizzata per preservare l'ambiente intracellulare 20, ma la patch deve essere rotto alla fine delle registrazioni o neurone in seguito "rimappati" nella configurazione whole-cell per consentire il riempimento biocitina.
Farmacologico dei neuroni registrati è un metodo utile per valutare il significato funzionale dei meccanismi neuromodulatori divergenti nel plasmare l'attività intrinseca e sinaptica di INs. Nei metodi sopra descritti, l'isolamento farmacologico e registrazioni accoppiati sono utilizzati per valutare gli effetti postali e GABA presinaptica B R-mediata, rispettivamente; tuttavia si può facilmente modificare la combinazione di agonisti ed antagonisti dei recettori per valutare il ruolo delle famiglie recettori alternativi, per esempio il sistema cannabinoide 21.
"> Istologica ed elaborazione immunocitochimica delle cellule registrate è altamente affidabile, una volta che sono stabiliti protocolli. Immunocitochimica Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per quanto riguarda la combinazione di anticorpi utilizzati, spessore di strato e obbligo di identificare il contenuto neurochimico. Utilizziamo siero normale di capra come tutti gli anticorpi secondari utilizzati sono allevati in capra., in alternativa, è anche possibile usare albumina di siero bovino (BSA) o latte in polvere come agenti bloccanti. Va notato che questo protocollo utilizza salina tamponata con fosfato (PBS) per l'anticorpo incubazione, tuttavia in alternativa si potrebbe utilizzare semplicemente 0,1 M PB in luogo di PBS. Utilizzando una concentrazione relativamente alta di detersivo (0,3% TritonX-100), non diminuisce antigenicità apparente, pur consentendo la penetrazione di anticorpi nel primo strato 100 micron superficie della fetta , in cui i neuroni sono regolarmente registrati. Se le cellule più profonde sono registrati, o le fette sono più spesse, è consigliabile resectisulle fette, utilizzando un criostato o un vibratome, ed eseguire il immunomarcatura sulle sottili (40-70 micron) sezioni. Per 300 micron fette, una lunga incubazione degli anticorpi (a 4 ° C per preservare l'integrità strutturale delle fette) produce risultati immunocitochimica altamente affidabili.Individuazione dei neuroni si basa sulle informazioni ottenute combinato nella registrazione, il post-hoc morfologica e l'analisi immunocitochimica. Nel ippocampo, causa l'organizzazione laminare rigoroso, distribuzione assonale è un buon indicatore degli obiettivi postsinaptici di interneuroni. Severed assoni o dendriti, tuttavia, può rendere l'identificazione difficile o impossibile. Inoltre, una certa ambiguità rimane, per esempio nel differenziare PV + jacket e interneuroni axo-axonic, a causa somiglianza nella localizzazione assonale generale. Una identificazione definitiva finale richiederebbe analisi al microscopio elettronico di obiettivi post-sinaptici 1,3 or ulteriore dissezione immunocitochimica 22.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Ina Wolter per la sua eccellente assistenza tecnica. VGAT-Venus ratti transgenici sono stati generati da Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi e Y. Kawaguchi in Istituto Nazionale per le Scienze Fisiologiche, Okazaki, Giappone, utilizzando pCS2-Venere fornito dal Dr. A. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | see Uematsu , et al., 2008 | ||
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| Dissection tools | i.e. FST | For brain removal | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | Custom-made in lab | ||
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. | |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | Custom made | ||
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | ||
| Isolated constant voltage stimulator |  Digitimer Ltd. |
DS-2A | |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5,000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | Any high quality brand | ||
| Glass coverslips | Usually 22 x 22 mm | ||
| Agar spacers | Agar block, cut on vibratome to 300 μm | ||
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | See Schindelin et al., 2012 |
References
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