Summary
Kortikale nettverk styres av en liten, men mangfoldig sett av hemmende interneurons. Funksjonell undersøkelse av interneurons krever derfor målrettet opptak og streng identifikasjon. Beskrevet her er en kombinert tilnærming med hel-celle opptak fra én eller postsynaptisk-koblede par av nevroner med intracellulære merking, post-hoc morfologisk og immuncytokjemisk analyse.
Abstract
Gabaergic hemmende interneurons spille en sentral rolle innen nevrale kretser i hjernen. Interneuroner omfatter en liten undergruppe av neuronal populasjon (10-20%), men viser en høy grad av fysiologisk, morfologiske og neurochemical heterogenitet, som gjenspeiler deres ulike funksjoner. Derfor etterforskning av interneurons gir viktig innsikt i organisasjonen prinsipper og funksjon av nevrale kretser. Dette krever imidlertid en integrert fysiologiske og nevroanatomi metode for utvelgelse og identifikasjon av individuelle Interneuron typer. Hel-cell patch-clamp opptak fra akutte hjerne skiver av transgene dyr, uttrykker fluorescerende proteiner under arrangører av Interneuron spesifikke markører, gir en effektiv metode for å målrette og elektrofysiologisk karakter iboende og synaptiske egenskapene til spesifikke Interneuron typer. Kombinert med intracellulære fargestoff merking, kan denne tilnærmingen bli utvidet med post-hoc morphological og immuncytokjemisk analyse, slik systematisk identifisering av innspilte nevroner. Disse metodene kan skreddersys for å passe et bredt spekter av vitenskapelige spørsmål angående funksjonelle egenskaper ulike typer kortikale nevroner.
Introduction
Hippocampus nevrale kretser har lenge vært gjenstand for intens gransking, både med hensyn til anatomi og fysiologi, på grunn av sin viktige rolle i læring og hukommelse samt romlig navigasjon i både mennesker og gnagere. Likeledes gjør fremtredende, men enkel laminær organisering av hippocampus denne regionen et yndet tema for undersøkelser rettet mot strukturelle og funksjonelle egenskaper kortikale nettverk.
Hippocampal kretser består av eksitatoriske hovedceller (> 80%) og et mindre (10-20%), men svært mangfoldig kohort av inhibitoriske interneuroner fra 1-3. Interneuroner slipper γ-aminosmørsyre (GABA) fra sine axon terminaler som fungerer på rask ionotrofiske GABA A-reseptorer (GABA A Rs) og langsomme metabotrope GABA B-reseptorer (GABA B RS) 4. Disse hemmende mekanismer motvekt eksitasjon og regulere oppstemthet av hovedceller, og dermedir timing og mønster av utslippet. Imidlertid GABA frigjøres fra interneuroner virker ikke bare på hovedceller, men også på interneuroner seg 5,6. Pre og postsynaptiske reseptorer megle feedback regulering og hemmende gjensidig samspill mellom de ulike typer interneuron. Disse hemmende mekanismer i Interneuron nettverk antas å være sentral i den generasjonen og utforming av aktivitets befolkningen mønstre, spesielt svingninger ved ulike frekvenser 7.
Hel-cell patch-clamp opptak er en veletablert metode for undersøkelse av iboende egenskaper og synaptiske interaksjoner av nerveceller. Imidlertid, på grunn av den store variasjonen av Interneuron typer, undersøkelse av inhiberende interneuroner krever streng identifisering av de registrerte celler. Som hippocampus Interneuron typer er preget av forskjellige morfologiske funksjoner og neurochemical markør uttrykk, kombinert anatomiske og immuncytokjemisk examination kan være et middel for å fastslå nøyaktig interneuron identitet 6,8,9.
I den foreliggende beskrivelsen beskriver vi en eksperimentell tilnærming der hel-celle patch-clamp opptak fra én nerveceller eller postsynaptisk-koplede par er kombinert med intracellulær merking, etterfulgt av post-hoc morfologisk og immuncytokjemisk analyse, slik at for karakterisering av langsomt GABA B reseptormediert inhiberende virkninger i identifiserte interneuroner. Som et eksempel, fokuserer vi på den ene store typen interneuron, en undergruppe av de såkalte "kurv celler" (BC), som innervates soma og proksimale dendritter av sine postsynaptiske mål og er preget av en "fast spiking" (FS) slippes mønster, et axon tett dekker cellekroppen lag, og ekspresjon av kalsium-bindende protein parvalbumin (PV) 10,11. Disse interneurons vise store postsynaptiske hemmende strømninger, samt fremtredende presynaptisk modulering av deres synaptisk utgang, som reaksjon på GABA-B R-aktivering 12. Kombinasjonen av teknikkene som er beskrevet her kan anvendes like godt for å undersøke iboende eller synaptiske mekanismer i en rekke andre identifiserte neuron typer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Alle prosedyrer og dyr vedlikehold ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer, den tyske dyrevernloven, Europarådsdirektiv 86/609 / EØF om beskyttelse av dyr, og retningslinjer fra lokale myndigheter (Berlin, T-0215/11 )
1. Utarbeidelse av Akutt-hippocampus Slices
- Ta en transgen rotte (17 til 24 dager gammel), uttrykker den fluorescerende Venus / YFP protein under vGAT arrangøren, hvilke etiketter flertallet av kortikale hemmende interneurons 13. Halshogge rotte. Raskt dissekere hjernen (<40 sek) i semifrozen, carbogenated (95% O 2/5% CO2) sukrose-basert kunstig cerebrospinalvæske (ACSF sukrose-, figur 1A).
- Vurdere dissekert rottehjerne for Venus / YFP fluorescens med en 505 nm LED lampe og 515 utslipp filter, montert på et par briller.
- Fjern frontal tredjedel av cortex og cerebEllum; deretter skille halvkuler, alle med en skalpell. Fjern den dorsale overflate av hjernebarken for å gi en flat overflate for å lime hjernen ned, som 14 tidligere beskrevet.
- Skjær tverrgående skiver (300 mikrometer) av hippocampus formasjon på en vibratome, bør halvkuler være omgitt med semifrozen, carbogenated sukrose-ACSF (figur 1B) 14. Fjerne flere regioner av rostral cortex, midthjernen og hjernestammen. Overfør hver skive til en neddykket holdekammer som inneholder sukrose-ACSF som er carbogenated og varmet til 35 ° C.
- La skivene å gjenopprette ved 35 º C i 30 min fra tidspunktet for det siste stykket inn i varmet ACSF. Gjør dette for å reaktivere metabolske prosesser og lette resealing av kuttet nevrale prosesser. Deretter overføres til romtemperatur for lagring (figur 1C).
2. Fabrikasjon og fylling av lydopptak Pipettes
- Pull patch pipetter fra glasskapillærer, slik at en pipette motstand på 2-4 mÊ oppnås når de er fylt med filtrert (sprøytefilter, porestørrelse: 0,2 pm) intracellulær løsning inneholdende 0,1% biocytin (for intracellulær merking). Hold den intracellulære løsning kjølt på is for å hindre nedbrytning av sine bestanddeler.
- Fyll patch pipetter for identifikasjon av postsynaptiske strømmer med en oppløsning inneholdende et fysiologisk relevant lav Cl - konsentrasjon (E R (Cl) = -61 mV, se løsning liste).
- For sammenkoblede opptak for å identifisere de presynaptiske reseptor-medierte responser, fyll patch pipetter med intracellulær løsning med lavt Ca 2 + bufferkapasitet til å hindre interferens med transmitterfrigjør presynaptisk, samt 4-fold høyere Cl - konsentrasjon (E R (Cl) = -20 mV) for å forbedre signal-til-støy observerte IPSCs 5 tillater nøyaktig vurdering av farmakologisk responsiveness. Legg merke til at endring Cl - konsentrasjon kan endre IPSC kinetikk 15.
3. Hele Cell Patch-clamp Opptak fra FS-Ins
- Carbogenate ACSF og mates gjennom perfusjon systemet til opptakskammeret, ved hjelp av en peristaltisk pumpe (som også fjerner ACSF fra opptakskammeret gjennom en sugeledning, figur 2A). Slå på alt utstyr på oppsettet i forberedelsene til innspillingen.
- Overfør en skive til opptakskammeret og holdes på plass med en platinaring stressede med enkeltfibre av silke. Plasser skive slik at stratum (str.) Pyramide av CA1 går vertikalt gjennom synsfeltet, slik at tilgang med 2 pipetter til både str. radiatum og str. Oriens samtidig (Tall 2C og 4A).
- Plasser kammeret inn i setup og starte perfusjon av carbogenated og varmet (32-34 º C) innspilling ACSF ved en strømningshastighet på 5-10 ml / min.
- Vurdere skive kvalitet under IR-DIC optikk på 40X objektiv forstørrelse, og visualisere med en CCD-kamera vises på en skjerm. Anta godt stykke kvalitet hvis et stort antall runde, moderat kontrast CA1 pyramidale celler (CA1 PC) kan sees i str. Pyramide på dybder på 20-30 mikrometer under en glatt og lett cratered overflate (figur 2C). Dårlig kvalitet skiver inneholder store antall høyt kontrast, krympet eller hovne celler, med en ujevn skive overflaten.
- Identifisere antatte FS interneurons henhold epifluorescence belysning som de uttrykker Venus / YFP (figur 2B), med store multipolar somata i eller nær str. Pyramide. Velg celler rimelig dypt innenfor skive (50-100 mikrometer, figur 2C) for å bedre bevare sin morfologiske integritet.
- Monter innspillingen elektrode i pipetten holderen på heads; deretter apply et lavt positivt trykk (20 til 30 mBar) gjennom røret linje. Senk pipette til overflaten av skiven, noe forskjøvet til sentrum av den valgte neuron.
- Skaff hel-celle opptak konfigurasjon som beskrevet tidligere 14,16 og se også figur 2D og 2E:
- Målrette en celle: Øk trykket til 70-80 mBar og raskt senke pipetten gjennom stykket til like over soma for den valgte cellen (figur 2D, øverst).
- Approach cellen: Trykk pipetten mot cellemembranen å produsere en "smilehull" på den (figur 2D, øverst). Dette utføres raskt, for å hindre biocytin merking av nabocellene.
- Lag et segl giga-ohm: Slipp trykket og samtidig bruke en 20 mV spenning kommando til pipette. En pakning giga-ohm (1-50 GΩ, figur 2D, bunn og figur 2E midten) typicalliert utvikler seg raskt. Når forseglet, anvende den forventede hvilende membranpotensial (typisk mellom -70 og -60 mV) som en spenningskommando.
- Bryte gjennom patch: Når forseglet, sprekke membranen lapp med en kort puls av negativt trykk; derved å oppnå den hel-celle-konfigurasjon (figur 2E, nederst).
- Kompensere hel-celle kapasitans og seriemotstand (R S). R s er normalt 5-20 mÊ og stabil i inntil 120 min. Abandon celler hvis membranpotensialet (V M) på break-through er mer depolarisert enn -50 mV; R S er innledningsvis større enn 30 mÊ; eller R S endres med mer enn 20% i løpet av innspillingen.
- Identifiser FS-moduler ved deres respons (i dagens-klemme-modus) til en familie av hyper- å depolariserende strømpulser (-250 til 250 pA, Figur 2F, øverst). FS-ins har relativt depolarisert V M (typisk -50 to -60 mV), kort membran tidskonstanten (<20 msek) og svare på en 500 pA depolariserende strøm injeksjon med et tog av aksjonspotensial (AP) ved frekvenser> 100 Hz 11 (figur 2F, nederst), som er markert forskjellige fra de i CA1 PCer (figur 2F, i midten).
4. Ekstracellulær elektrisk stimulering til å fremkalle GABA B R-medierte Responses
- Å observere postsynaptisk fremkalt respons, plasserer et ekstracellulært stimulering elektrode (en patch pipette fylt med 2 M NaCl, Resistance: 0,1-0,3 mÊ) i stykket på grensen av str. radiatum og str. lacunosum-molekyl. Plasser elektroden 200-300 mikrometer lateralt for soma for å hindre direkte elektrisk stimulering av cellen og minimalisere stimulerings gjenstander (Figur 3a).
- Når stimuleringselektrode er plassert ved å skaffe hel-celle-opptak avden valgte cellen og vurdere den fysiologiske fenotype i dagens-klemme-modus som i § 3.9 (Figur 3B).
- Med nervecellen tatt opp i spenningsklemmen (V M -65 mV), leverer elektrisk stimulering av presynaptiske axoner ved 50 V (~ 500 uA effektiv stimulus) enhver 20 sek, ved hjelp av en isolert konstant spenning stimulator. Bruk enkle stimuli (100 usekunder varighet, Figur 3C, øverst) å observere GABA B R mediert IPSCs, og flette med tog av flere stimuli (200 Hz) til å produsere større senderen utgivelse.
- Bath gjelder ionotrofiske glutamat reseptorantagonister (AMPA reseptor: DNQX [10 mm]; NMDA reseptor: d-AP5 [50 mikrometer]) for å avsløre den isolerte monosynaptisk IPSC (Figur 3C, midtre øvre). Ytterligere isolere GABA B R-mediert IPSC med anvendelse av en GABA A R stopperen (gabazine [10 uM]; Figur 3C middel lower).
- Bekreft resulterende sakte utover strøm (Figur 3C lavere, utvidet) som blir GABA B R-mediert av den etterfølgende søknaden av CGP-55845 [5 mikrometer] (Figur 3C lavere, underlain i grått)
5. Grupperte Opptak av postsynaptisk Coupled FS-IN og CA1 PCer
- Vurdere GABA B R-mediert presynaptisk kontroll over hemmende synaptisk transmisjon med samtidige opptak, utført mellom postsynaptisk-koblet i og PC-parene som beskrevet nedenfor.
- Først etablere et hel-celle innspilling av en presynaptisk interneuron (som i avsnitt 3) og bekreft FS fenotype (Figur 4A).
- Deretter lappe en nabo CA1 PC (20-100 mikrometer avstand, figur 4A) og gjelder kort suprathreshold depolariserende strømpulser (1 ms varighet, 1-5 nA amplitude) til den presynaptiske IN (holdt i dagens-klemme-modus) for å lokke fram aksesspunkter. Hvis en synaptisk connection er til stede, APS i IN resultat i IPSCs i CA1-PC, holdt i spenning-klemme (kompensere R S til ca 80%).
- Om nødvendig, fyll en ny innspilling elektrode og ta opp fra ytterligere CA1 PCer inntil en tilkobling er funnet.
- Når en tilkobling er opprettet, framprovosere par av APs i den presynaptiske FS-IN for å vurdere både den enhetlige synaptisk respons og dynamisk oppførsel. Bruk en typisk sammenkoblet pulsprotokoll av 2 depolariseringsstimuli med en 50 ms intervall (figur 4B).
- Samle kontroll spor i baseline forhold. Deretter påføres de selektive GABA-B R agonist baclofen (10 uM) til perfusert ACSF, og dermed aktivering av GABA B Rs, etterfulgt av antagonisten CGP-55845 (5 mM), for å fullstendig blokkere reseptor-medierte virkninger. Samle ~ 50 spor under jevn tilstand av hvert medikament tilstand (figur 4B og C).
- Når opptaket er ferdig, forsegle somatisk membranen ved å danne en outside-out patch: Sakte trekke pipetten fra cellekroppen i V-klemme og som R S øker, redusere V M til -40 mV. Gjøre dette for å lette dannelsen av det ytre ut-lapp; deretter fjerne pipetten fra badekaret.
6. Analyse av elektrofysiologiske egenskaper
- MERK: Et mangfold av ulike programvarepakker er tilgjengelig for kjøp av elektrofysiologiske data. Her WinWCP, et Windows-program i den frie Strathclyde Elektroprogramvarepakke er brukt, noe som tillater opptak av inntil 16 analoge innganger og produksjon på 10 digitale signaler.
- Lavpassfilter alle data på 5-10 kHz og prøven ved 20 kHz.
- Analyser fysiologiske data med en off-line analyse suite.
MERK: Stimfit, en åpen kildekode programvarepakke som inkluderer en Python shell, er brukt i dette tilfellet; men andre alternativer kan lett brukes i stedet.- Analyser passiv membran properties av innspilte nevroner, anskaffet i strømtang, fra hvilemembranpotensialet.
- Måle gjennomsnittlig hvilemembranpotensialet fra grunnlinjen av innspilte svar fra begynnelsen av opptaket.
- Beregn inngangsmotstand, ved hjelp av Ohms lov, fra spenningsrespons til de minste hyperpolariserer strømpulser (≤ -50 PA). For å bedre signal til støyforhold, gjennomsnittlig flere spor. Merk: våre eksempler er typisk gjennomsnitt av 10-50 individuelle sweeps.
- Beregn den tilsynelatende membran tid konstant ved å montere en monoexponential kurve til forfallet av svarene til de minste hyperpolariserer strømpulser.
- Analyser aksjonspotensial bølgeform for å avgjøre terskel, amplitude (terskel til topp) og varighet (bredde målt på halv høyde) utløst av terskelnivå depolariserende strømpulser.
- Analyser GABA B R medierte IPSCs fra spennings klemme innspillinger. Filter spor off-line på500 Hz (Gaussisk filter) og vurdere topp amplitude og forsinkelse av GABA-B R-formidlet respons (i gjennomsnitt av minst 10 spor).
- Detektere effekten av GABA B Rs på den hemmende effekt av in så en endring i topp amplituden for GABA A R-medierte IPSCs målt mellom topp og foregående grunnlinje. Beregn gjennomsnittlig amplitude fra ≥50 spor for kontrollperioden og steady-state av alle farmakologiske epoker.
7. Visualisering og Immunocytochemistry av FS-Ins
- Etter opptak, løse skiver ved nedsenking i 4% paraformaldehyd med 0,1 M fosfatbuffer (PB, pH = 7,35) V / N ved 4 ° C.
- Hvis nødvendig skiver kan overføres til PB og lagret i opp til ~ 1 uke før behandlingen.
- Vask skiver rikelig i frisk PB og senere i 0,025 M PB med 0,9% NaCl (PBS, pH = 7,35).
- For å redusere ikke-spesifikk antistoffbinding, sperre skivene for 1 t ved RT i en løsning inneholdende 10% normalt geiteserum (NGS), 0,3% Triton-X100 (et vaskemiddel for å permeabilize membraner) og 0,05% NaN 3, består i PBS.
- For å markere for PV ekspresjon, bruke et anti-PV monoklonalt mus-antistoff fortynnet i en oppløsning inneholdende 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN 3, i PBS. Inkuber primære antistoffer i 2-3 dager ved 4 ° C 12. Skyll skiver grundig i PBS.
- Påfør fluorescerende anti-mus sekundære antistoffer (f.eks Alexafluor-546.) Sammen med biotin binding-protein streptavidin, konjugert til en fluorokrom (f.eks Alexafluor-647); og inkuberes i en oppløsning inneholdende 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN 3, fortynnet i PBS og inkuberes i O / N ved 4 ° C.
- Rikelig skyll skiver 2-3x med PBS etterfulgt av 2-3 skyller i PB. Monter skivene på glassplater. Bruk en 300 mikrometer agar avstandsstykke for å hindre skiven fra å kollapse. Cover-slip skiver med en elektronisk fmonterings prosent middels og tetning med neglelakk.
8. Imaging og ombygging av visualiseres FS-Ins
- Visual skiver ved hjelp av en scanning confocal mikroskop, med fluorochome reporter spent med den aktuelle laserlinje (diodelaser 635 nm for Alexafluor-647; Helium-Neon 543 nm for Alexafluor-546 merking for PV og Argon 488 eller 515 nm for Venus / YFP).
- Ta bilder med et passende Z-oppløsning (typisk 0,5-1 mikrometer trinn, ved hjelp av et 20X objektiv) for å produsere en Z-stabel av hele cellen. Flere stabler er normalt å image hele cellen, noe som kan bli digitalt sydd off-line ved hjelp FIJI / ImageJ programvare (figur 5A).
- Rekonstruere cellen fra sammensatt bilde stabelen ved hjelp av en semi-automatisk sporing metode (Simple neurite Tracer plugin i FIJI / ImageJ programvarepakke 17, figur C).
- Endelig vurdere PV-immunoreaktivitet i interneuron med høy numerisk apertur objektiv (60X silisium-immersion, NA = 1,3). Gjør bilder av soma, proksimale dendritter og proksimale axon, eller alternativt av axon terminaler hvis somatisk utvasking av PV er for sterk. Celler anses immunoreactive for PV hvis immun-merking er sett til å justere med de biocytin merkede strukturer (Figur 5B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forutsatt at skive kvaliteten er merkbart bra, opptak fra både CA1 PCer og FS-ins kan oppnås med minimal vanskeligheter. Den transgene rotte linje uttrykker Venus / YFP under vGAT promoter 13 ikke utvetydig identifisere FS-ins, eller faktisk BCs. Men opptak fra INs i og rundt str. Pyramide, der tettheten av FS-ins er typisk høy 1, resulterer i en høy sannsynlighet for å velge FS-Ins (figur 2B). FS-ins kan være preget av sine karakteristiske fysiologiske egenskaper som er forskjellige fra de av både CA1 PCer og RS-ins. De har en relativt depolarisert hvilemembranpotensialet (-58,9 ± 1,5 mV, 15 celler, kontra -62,6 ± 1,1 mV i CA1 PCer, 26 celler), lav inngangsmotstand (92 ± 12 mÊ vs 103 ± 14 mÊ i PCer) og rask tilsynelatende membran tid konstant (15,4 ± 2,6 ms vs 22,0 ± 2,7 msek i PCer), resulting i rask spenning respons på hyperpolariserer strømpulser (Figur 2f). FS-INs utladet svært korte aksjonspotensialer (0,38 ± 0,01 msek) med relativt lav amplitude (82,8 ± 1,0 mV) etterfulgt av svært fremtredende rask afterhyperpolarization (gjennomsnittlig amplitude 22,6 ± 2,9 mV). Som svar på store depolariserende strømpulser (250 Pa), FS-INs sparken ved høye frekvenser (82 ± 10 Hz, område: 34-128 Hz, figur 2D, til venstre).
For å vurdere GABA B R-mediert postsynaptiske strømmer i FS-Ins, ble farmakologisk isolerte synaptiske responser utløst av ekstracellulære stimulering av hemmende fibre på str. radiatum / lacunosum-molekyl kant. Figur 3 viser et eksempel på en FS-i, i hvilken sekvensielle blokade av komponentene i det sammensatte synaptisk respons isolerer monosynaptisk GABA B R-mediert langsom IPSC. Synaptiske svarene var elisitert av enkelt stimuli eller tog på 3-5 stimuli (50 V intensitet, 0,1 msek varighet, levert på 200 Hz) til str. lacunosum-molekyl / radiatum grensen (figur 3A). Den første forbindelsen respons inkludert både eksitatoriske og inhiberende komponenter (figur 3C, øverst) ble sterkt redusert ved anvendelse av AMPA-bad og NMDA-reseptorantagonister (DNQX, 10 uM og AP-5, 50 uM, henholdsvis: Figur 3C, midten). Den gjenværende monosynaptisk IPSC omfattet en tidlig fort innover strøm (en antatt innover Cl - Mediated strøm på holdepotensial -65 mV, med en reversering potensial på omtrent -60 mV, i disse eksperimenter), og en langsommere utgående strøm (mediert av en antatt K + conductance med en reversering potensial nær 100 mV). Bruk av selektive GABA A R antagonist gabazine (SR-95531, 10 mm) avskaffet rask IPSC, forlater enisolert treg GABA B R-mediert IPSC (Figur 3C, bunn, svart spor); som ble observert i respons til én stimulering, men mer tydelig i respons til korte tog av stimuli. Denne reaksjon ble bekreftet som en GABA-B R-aktiverte K + conductance, som det ble blokkert av potent og selektiv antagonist CGP-55845 (CGP, 5 pM, figur 3C, bunn, grå trace). FS BCs vanligvis viser store amplitude GABA B R-mediert IPSCs, slik som vist i vår siste utgivelse 12.
For å vurdere presynaptiske regulering av FS-IN hemmende effekt av GABA B Rs, var forbundet opptak utføres fra postsynaptisk-kombinert FS-in og CA1 PCer. Synaptic tilkobling mellom FS BCs og CA1 PCer er relativt høy, som vist tidligere 1,3. I disse opptak, som vist tidligere, er koblings sannsynlighet over 50% mellom nært beliggende celle par (≤50 mikrometer;
Når et opptak var fullført, en utenfor-ut plaster med hell var dannet, ble skivene faste over natten og deretter behandlet for å visualisere og analysere morfologi av de registrerte celler og bestemme deres neurochemical markør innhold. Figur 5A illustrerer morfologien til en representativ FS BC i en projeksjon av kombinerte bildestakker oppnådd på et konfokal mikroskop. Cellens uttrykk for PV ble bekreftet i immuncytokjemisk merking som ga et klart immun-signal over cellen kroppen og proksimale dendritter av registrert og biocytin-merket celle (Figur 5B). Tredimensjonal rekonstruksjon av cellen ble utført fra sydd bildestakker med Enkel neurite Tracer plugin i FIJI programvare (figur 5C) 17. Axon viste en høy tetthet av collaterals i og nær str. Pyramide med &# 8220; kurver "dannet rundt somata av CA1 PCer (Figur 5A, innfelt), putatively identifisere denne cellen som en BC. Videre lokalisering av soma nær str. Pyramide, og de radialt orienterte dendritter som strekker seg over alle lag av CA1 svarer godt til den typiske morfologiske trekk ved FS BCS 10.
I sammendrag, i hel-celle-opptak oppnådd fra identifisert FS PV + BCS, har vi vist at disse celler uttrykker store amplitude GABA B R-mediert langsomme IPSCs og deres synaptiske utgang er også markert inhibert av aktiveringen av presynaptiske GABA B Rs.
Figur 1. Fremstilling av akutte hippokampale skiver. (A) En ferskt dissekert rottehjernen. Legg merke til at isen som omgir hjernen, opprettholdetemperaturen i hele hjernen nær 0 ° C (B). Skjæring av 300 mikrometer hippocampus skiver på en Leica VT1200s vibratome. De halvkuler er justert slik at den kortikale overflate er skåret først. Legg merke til den store mengden av slushy isen rundt halvkuler og konstant carbogenation av det iskalde ACSF (pil). (C) Etter å kutte hjernen skiver er flyttet til varmet sukrose-ACSF. Sektorene ble snudd og trimmet for å fjerne forhjernen og midthjernen, slik at bare hippocampus og liggende cortex.
Figur 2. Hel-celle patch-clamp-opptak fra interneuroner. (A) opptakskonfigurasjon rundt kammeret. Legg merke til innstrømningen og utstrømningen er på motstående sider av kammeret for å oppnå en nær til laminær strømning. Også synlig er den RECORDIng elektroder, montert på headstages, og jordelektroder på de to sider, samt målet (40X, vann-nedsenking) i midten. (B): Strøm epifluorescent bilde av vGAT-Venus / YFP signal i CA1 av hippocampus i en skive. (C) IR-DIC avbildning av det samme område. Pilene i B og C indikerer en Venus / YFP positiv interneuron i cellekroppen sjikt. (D) Høy strøm IR-DIC bilder av soma av neuron indikert i panel B, med en nærmer patch pipette som danner fordypningen i overflate (topp), og senere, i cellen i det hel-celle konfigurasjonen (nederst). (E) Skjematisk illustrasjon av de viktigste trinn ved å etablere en hel-celle patch-clamp-opptak (venstre side) med tegneserie svar på en testspenning -Pulse overvåking motstanden ved pipettespissen (høyre side). Øverste rad: Pipette i badekaret bort fra cellen; Øvre middelklasse: Dimple formasjon, ledsaget av enreduksjon av pulsamplitude, som indikerer en moderat økning i motstanden. Lavere middel: Giga-ohm segl formasjon. Legg merke til at den strømpuls amplitude blir dramatisk redusert. Bare de raske kapasitive strømmer er synlige ved begynnelsen og slutten av pulsen før pipette kapasitans er kompensert. Bunn: Hel-cellers opptaksoppsettet oppnås ved å bryte gjennom membranen patch under pipettespissen. Legg merke til at de store, men relativt langsomme kapasitive strømmer på begynnelsen og slutten av pulsen før seriemotstand kompensasjon blir brukt. (F) Representative spor av en FS-IN (øverst) og CA1 PC (nederst), fremkalt av en familie av hyper - å depolariserende strømpulser (protokoll vist ovenfor). Legg merke til den meget høye frekvens utslipp av FS-IN sammenlignet med en mye lavere avfyring av CA1 PC. Innfellinger til høyre: Sammenligning av AP-kurven fra CA1 PC (øverst) og FS-IN (nederst, i grått, kledde på PC AP i svart), som illustrerer difference i bølgeformen til AP og AHP.
Figur 3. Farmakologisk disseksjon av det sammensatte synaptisk respons, isolere langsomme GABA B R-mediert IPSCs i en FS-IN. (A) IR-DIC bilde av stykket i innspillingen kammer, med innspillingen elektrode (Patch) plassert på grensen av str. Oriens (Ori.) og Pyramide (Pyr.) og simulering elektroden (Stim) på grensen av str. radiatum (. Rad) og lacunosum-molekyl (LM) (B) Venstre:. Skjematisk illustrasjon av opptaksoppsettet. Høyre: Superimposed spennings responsene hos FS-IN fremkalt av en familie av hyper- å depolariserende dagens injeksjoner (C) Representative spor tatt opp fra FS-IN i respons til ekstracellulære stimulering.. Topp: Den sammensattesynaptisk respons produsert i normal ACSF fremkalt ved en eneste stimulus (50 V intensitet, 0,1 msek varighet). Midtre øvre: Isolert monosynaptisk IPSC etter bad anvendelse av DNQX (10 mm) og d-AP-5 (50 mm). Middle nedre: Den raske monosynaptisk IPSCs blokkeres etter tilsetning av gabazine (10 uM) til badet. Bunn: Et tog av 5 stimuli (200 Hz) avslører en langsom GABA B R mediert IPSC (svart spor) som er blokkert av senere søknad av CGP (5 mm) til badet (lagret grå spor).
Figur 4. Analyse av presynaptisk modulasjon av hemmende synaptisk transmisjon i en sammenkoblet opptak fra en kombinert FS-IN og CA1 PC pair. (A) Venstre panel: IR-DIC bilde av de to opptaks pipetter, den venstre lappet på FS-IN på grensen av < em> str. Oriens (Ori.) og Pyramide (Pyr.) og retten lappet på en CA1 PC nærmere str. radiatum (Rad.). Høyre panel:. En skjematisk av opptaket konfigurasjon, med representative spennings svar fra FS-IN (til venstre) og CA1 PC (høyre) til en familie av strømpulser (B) Representative spor som viser APs fremkalte i presynaptiske FS-IN (øverst) og på kort ventetid enhetlig IPSC i CA1 PC (nederst) under kontroll forhold (spor til venstre), etter bad anvendelse av baklofen (10 mm, midten), og senere søknad av CGP (5 mikrometer, høyre) . Merk at baklofen reduserte IPSC amplitude ved ~ 50%, mens CGP resulterte i en nesten full gjenoppretting av IPSC amplitude. Kontroll spor er vist underlain. (C) Tid løpet handlingen i IPSC amplitude viser effekten av baklofen og CGP. IPSCs ble registrert ved 10 sek intervaller.
Figur 5. Visualisering, gjenoppbygging og immuncytokjemisk identifikasjon av en biocytin-merket registrert FS-BC. (A) En projeksjon av strikkede stabler av bilder av en FS-IN avbildes med et 20X objektiv på en konfokal mikroskop. Den somata ligger på grensen av str. radiatum (radian.) og Pyramide (Pyr.) av CA1-området, dendrittene drives radialt og spenner over alle lagene, mens de fleste av axon er funnet i og omkring cellen legeme laget; som typisk for BCs. Målestokk: 100 mikrometer. Inset, øverst til høyre: høy forstørrelse projeksjon av en 20 lag, som viser typiske kurver av axon forming rundt antatte CA1 PC somata (oransje stjerne). Målestokk:. 10 mikrometer (B) Den biocytin fylte cellen kroppen i IN (hvit pseudocolour, nedre panel, pil) viser immunoreaktivitets for PV (i grønt, øvre panel). Scalebar:. 20 mikrometer (C) projeksjon av den 3-dimensjonale rekonstruksjon av cellen. Soma og dendritter er i svart og axon farget rød. Lag av CA1 er avgrenset i blått. Forkortelser: Ori, str. Oriens; LM, str. lacunosum-molekyl. Målestokk: 100 mikrometer.
| Navn | Sammensetning (mM) | Bruk | Notater |
| Sukrose-ACSF | 87 NaCl, 2,5 KCl, 25 NaHCO3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 glukose, sukrose 75, 7 2 MgCl, CaCl 0,5 2, 1 Na-pyruvat, 1 Na-askorbat | Utarbeidelse og oppbevaring av hjernen skiver | pH = 7,4; osmolaritet = ~ 350 mOsm |
| Opptak ACSF | 125 NaCl, 2,5 KCl, 25 NaHCO3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 glukose, en MgCl | Opptak fra hjernen skiver | pH = 7,4; osmolaritet = 310-315 mOsm |
| Intracellulær løsning (1) | 125 K-glukonat, 10 KCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 MgCl2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-fosfokreatin og 0,1% biocytin | Fylle elektroder av GABAB IPSC opptak | pH = 7,4; osmolaritet = 295-305 mOsm |
| Intracellulær løsning (2) | 105 K-glukonat, 40 KCl, 10 HEPES, 0,1 EGTA, 2 MgCl2, 2 Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1 Na-fosfokreatin og 0,1% biocytin | Fylling elektroder for sammenkoblede opptak | pH = 7,4; osmolaritet = 295-305 mOsm |
| Fosfatbuffer (PB) | 100 mM NaH 2 PO 4 | Skylling faste skiver | pH = 7,4 |
| Fosfatbufret saltvann (PBS) | 25 mM NaH 2 PO 4 </ Sub>, 154 mM NaCl (0,9% w / v) | Skylling faste skiver og antistoff inkubasjon | pH = 7,4 |
| Paraformaldehyde fiksativ | 4% vekt / volum Paraformaldehyde, 0,1 mM PB | Fiksering av hjernen skiver | pH = 7,4 |
Tabell 1. Solutions listen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metode som kombinerer elektrofysiologiske og nevroanatomi teknikker for å funksjonelt karakter morphologically- og neurochemically-identifiserte nevroner in vitro; spesielt de ulike typer av kortikale hemmende ins. Viktige aspekter av prosedyren er: (1) pre-utvalg av potensielle INs; (2) intracellulært opptak og neuron visualisering; og til slutt (3) morfologisk og immuncytokjemisk analyse av registrerte ins. Selv om denne studien har adressert PV-Ins spesielt, kan den beskrevne protokoll benyttes for tilsvarende opptak fra en hvilken som helst interneuron eller andre neuronale typer, med minimale endringer.
Det relativt lave antall interneurons i kortikale områder gjør tilfeldig utvalg og opptak fra disse cellene svært ineffektiv. Avvikende lokalisering og morfologiske egenskaper har aktivert forskerne å skille og rutinemessig ta opp fra noen Interneuron typer. Men i skiver, identifisering av lærlingeurons i og nær cellen kroppen lagene er fortsatt vanskelig, for eksempel med FS-ins. Ankomsten av transgene mus linjer, uttrykker de fluoriserende proteiner i spesifikke Interneuron populasjoner tilbyr en elegant løsning som gjør pre-selection og registrering av disse nevronene mye mer effektive to. Nå er mange transgene linjer, for det meste mus, men i økende grad også rotter 13 er tilgjengelige, lette etterforskningen av interneurons. Ved bruk av transgene linjer, er det imidlertid viktig å fastslå omfanget og spesifisiteten av reporter ekspresjon.
Kvalitet av cellulær morfologi og etikettering, samt elektro opptak, kritisk avhenger av levedyktige, høykvalitets skiver; som hjernen trenger å være raskt dissekert (ideelt 20-40 sek), håndteres svært forsiktig og kontinuerlig kjølt. Vi finner at bruk av sukrose-ACSF, hvorved den totale konsentrasjon av natrium og dermed eksitabilitet av neuroner er redusert, dramatisk forbedrer kvaliteten på skiver og interneuron overlevelse 18. Det bør imidlertid understrekes at mange forskere har gjort bruk av standardopptak ACSF for slice forberedelse, til stor effekt 10,11,15. Morfologiske integritet er svært avhengig av hvilken vinkel skiver er kuttet 13; som varierer fra region til region og celletype. Imidlertid kan mange interneurons bli pålitelig registrert fra tverrgående, koronale eller sagittal skiver. For ytterligere å redusere etterlønn av dendritter og axon, celler dypere i vevet bør være målrettet, riktignok ofre IR-DIC kvaliteten og påliteligheten av giga-ohm segl formasjon. Under disse omstendigheter opptak fra begge CA1 pyramidale celler og FS-ins kan bli pålitelig oppnådd.
Merking og visualisering av nevroner er oppnås etter en typisk innspillingen varte 30 minutter eller lenger. Ved opptak vare i mindre enn 30 minutter, er det nødvendig å la denne tid før fikseringen for å muliggjøre biocytin å diffundere inn distal dendrittiske og aksonale prosesser, som garanterer fullstendig fylling og dermed post-hoc visualisering av celler.
I hel-celle opptak, lav og stabil seriemotstander er viktig å nøyaktig fysiologiske målinger av synaptiske og iboende egenskaper, samt grundig merking av nervecellene. Imidlertid lav motstand elektrodene tillate rask dialyse av cytoplasma med den intracellulære oppløsningen inneholdt i pipetten. Supplere den intracellulære løsning med ATP, GTP og fosfokreatin absolutt hjelper å opprettholde energiforsyningen og opptakskvalitet. Imidlertid kan dialyse av nevrokjemiske og protein føre til redusert respons, redusert plastisitet 19 og kan også hemme neurochemical identifikasjon. For eksempel PV er konsekvent vasket ut av nerveceller i løpet av lengre forsøk. Derfor kan undersøkelse av distale dendrittiske eller aksonale prosesser bli pålagt å Dete rmine immunoreaktivitets på den innspilte nervecellen. I slike tilfeller hvor en slik dialyse er viktig, opptak ved hjelp av perforerte patch-konfigurasjon kan benyttes til å opprettholde det intracellulære miljøet 20, imidlertid plasteret må brytes ved slutten av opptak eller neuron senere "repatched" i hel-celle konfigurasjonen å tillate biocytin fylling.
Farmakologisk etterforskning av innspilte nevroner er en nyttig metode for å vurdere den funksjonelle betydningen av divergerende neuromodulatory mekanismer i utformingen av den iboende og synaptisk aktivitet av INs. I fremgangsmåtene beskrevet ovenfor, er farmakologisk isolasjon og sammenkoblede opptak brukes til å vurdere legg og GABA presynaptiske B R-medierte effekter, henholdsvis; Imidlertid kan man lett endre kombinasjonen av reseptor-agonister og antagonister for å vurdere rollen til alternative reseptor-familier, f.eks cannabinoid system 21..
"> Histologiske og immuncytokjemisk behandling av innspilte celler er svært pålitelig, når protokoller er etablert. For immunocytokjemi protokollen som beskrives her er blitt innstilt i forhold til kombinasjonen av antistoffer anvendes, skivetykkelse, og kravet om å identifisere nevrokjemiske innhold. Vi anvender normalt geiteserum som alle sekundære antistoffer som brukes er dannet i geit. Som alternativ er det også mulig å bruke bovint serum-albumin (BSA) eller melkepulver som blokkerende midler. Det bør bemerkes at denne protokollen bruker fosfatbufret saltvann (PBS) for antistoff inkubasjon men alternativt kunne man bare bruke 0,1 M PB istedenfor PBS. hjelp av en relativt høy konsentrasjon av vaskemiddel (0,3% TritonX-100), forringer ikke åpenbar antigenisitet, samtidig som den tillater gjennomtrengning av antistoffer i den første 100 mikrometer overflatelaget på stykket , hvor nerveceller blir rutinemessig registrert. Hvis dypere celler blir registrert, eller skivene er tykkere, er det tilrådelig å resectipå skivene, ved hjelp av en kryostat og en vibratome, og utfører immunolabeling på de tynne (40-70 mikrometer) seksjon. For 300 mikrometer skiver, en lang inkubasjon av antistoffene (ved 4 ° C for å opprettholde strukturell integritet av sektorene) produserer svært pålitelige immuncytokjemisk resultater.Identifikasjon av neuroner er avhengig av den kombinerte informasjon som er innhentet i opptaket, post-hoc morfologisk og immuncytokjemisk analyse. I hippocampus, på grunn av den strenge laminær organisasjon er aksonal distribusjon en god indikator på de postsynaptiske mål for interneuroner. Avkuttede axon eller dendritter, men kan gjøre identifiseringen vanskelig eller umulig. Videre er det fortsatt noen tvetydighet, for eksempel i differensiere PV + BCs og AXO-axonic interneurons, på grunn av likheten i den samlede aksonal lokalisering. En endelig definitive identifikasjon ville kreve elektron mikroskopisk analyse av postsynaptiske mål 1,3 or videre immuncytokjemisk disseksjon 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Ina Wolter for henne utmerket teknisk assistanse. VGAT-Venus transgene rotter ble generert av Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi og Y. Kawaguchi i Statens institutt for Fysiologiske Sciences, Okazaki, Japan, ved hjelp pCS2-Venus levert av Dr. A. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | see Uematsu , et al., 2008 | ||
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| Dissection tools | i.e. FST | For brain removal | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | Custom-made in lab | ||
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. | |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | Custom made | ||
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | ||
| Isolated constant voltage stimulator |  Digitimer Ltd. |
DS-2A | |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5,000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | Any high quality brand | ||
| Glass coverslips | Usually 22 x 22 mm | ||
| Agar spacers | Agar block, cut on vibratome to 300 μm | ||
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | See Schindelin et al., 2012 |
References
- Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
- Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
- Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
- Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
- Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
- Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
- Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
- Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
- Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
- Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
- Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).
