Abstract
Et af de store spørgsmål i mikrobiel økologi er "hvem er der?" Dette spørgsmål kan besvares ved hjælp af forskellige værktøjer, men en af de langvarige guld standarder er at sekventere 16S ribosomale RNA (rRNA) gen amplikoner genereret af domæne-niveau PCR reaktioner forstærkning fra genomisk DNA. Traditionelt dette blev udført ved kloning og Sanger (kapillarelektroforese) sekventering af PCR amplikoner. Fremkomsten af næste generation sekventering er voldsomt forenklet og øget sekventering dybde for 16S rRNA-genet sekventering. Indførelsen af stationære sequencere nu tillader små laboratorier til at udføre deres 16S rRNA sekventering i huset i løbet af få dage. Her er en metode til 16S rRNA-genet amplikon sekventering ved hjælp af en bordplade næste generation sequencer detaljeret. Den miljømæssige DNA først amplificeret ved PCR under anvendelse af primere, der indeholder sekventering adaptere og stregkoder. De er derefter koblet til sfæriske partikler via emulsion PCR. Partiklerne er loaded på en engangs chip og chippen er indsat i sekventeringsmaskine hvorefter sekventering udføres. Sekvenserne er hentet i fastq format, filtreret og stregkoder bruges til at fastlægge prøven medlemskab af læser. Den filtrerede og arkiveret lodret læser derefter yderligere analyseres ved hjælp af offentligt tilgængelige værktøjer. Et eksempel på analyse, hvor læser blev klassificeret med en taksonomi-finding algoritme inden softwarepakken Mothur er givet. Metoden er skitseret her er enkel, billig og ligetil og bør hjælpe mindre laboratorier til at drage fordel af den igangværende genomiske revolution.
Introduction
Metagenomisk sekventering er en meget kraftfuld teknologi, som det er rettet mod hele den genetiske information er indeholdt i en miljømæssig prøve. Der er forskellige varianter af metagenomisk sekventering, herunder haglgevær sekventering, stor-insert biblioteker og amplikon sekventering. Amplikon sekventering har den fordel af at være relativt billigt, hurtigt og i stand til at producere læser fra en enkelt genomisk område, der kan generelt justeret. Desuden er dataanalyse arbejdsgang for amplikon sekventering meste standardiseret. , Da den er baseret på PCR, Men det har alle de fordomme relateret til ufuldstændig specificitet, ufuldstændig dækning og primer forspænder 1,2, hvilket gør denne fremgangsmåde semikvantitativ i bedste fald. Flere genomiske regioner kan målrettes til amplikon sekventering, herunder funktionelle gener, men de mest populære muligheder er at bruge markørgener såsom 16S rRNA-genet til at generere et community-profil. Traditionelt 16S rRNA-genet amplikon sequencing blev udført ved hjælp af arbejdskraftintensive metoder, der omfattede kloning i E. coli koloni plukning og plasmid ekstraktion efterfulgt af Sanger-sekventering af de isolerede plasmider, og derfor analyseres de fleste undersøgelser færre end 100 kloner per prøve. Næste generations sekventering anlagt to store fremskridt: massiv parallelisering af sekventeringsreaktionerne og, vigtigst, klonal adskillelse af skabeloner uden at skulle indsætte genfragmenter i en vært. Dette har forenklet voldsomt sekvensering af 16S rRNA-genet amplikoner, som nu er tilbage som en rutinemæssig element i mange Environmental Microbiology undersøgelser, hvilket resulterer i en "renæssance" for 16S rRNA-genet amplikon sekventering 3.
Siden indførelsen af Roche 454 sekventering i 2005 4, har flere andre næste generation sekventering teknologier dukket op på markedet (f.eks Illumina, Massiv, PacBio). For nylig indførelse af bench-top sekvensrs bragt til små laboratorier sekventering kapacitet gang eksklusivt til store sekventering centre. Fem stationære maskiner er i øjeblikket tilgængelige: 454 GS Junior, Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) og Proton, og Illumina MiSeq og NextSeq 500. Mens alle disse sequencere tilbyder mindre læser pr løb og færre baser per dollar end de fleste full skala sequencere, de er mere fleksible, hurtig og deres lave erhvervelsesomkostninger og køre omkostningerne er overkommelige for små akademiske laboratorier. Stationære sequencere er særligt velegnede til amplikon, lille genom og lav kompleksitet metagenomet sekventering i mikrobiologi miljøundersøgelser, fordi denne type undersøgelser generelt ikke kræver en ekstrem dybde sekventering. For eksempel er det almindeligt anerkendt, at for 16S rRNA-genet sekventering studerer antal læser per prøve er ikke afgørende, da ~ 1.000 læser kan generere de samme mønstre som multi-million læser datasæt 5. Når det er sagt, stationære næste generatio n sequencere stadig generere store mængder af sekvens data med maksimal udbytte af ~ 35 MBP (454 GS Junior), ~ 2 GBP (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 GBP (Ion Torrent Proton), ~ 10 GBP (Illumina MiSeq) og ~ 100 GBP (Illumina Næste Seq 500), hvilket er mere end nok for de fleste mikrobiologiske undersøgelser miljøet.
Næste generations sekventering af 16S rRNA-amplikoner hjælp stationære sequencere er for nylig blevet anvendt på en lang række miljøer. For eksempel har den Ion Torrent PGM været brugt til fællesskabet analyser af uran mineaffald, der havde særlig høj pH og lav permeabilitet 6, i recirkulerende akvakultursystemer 7, af kulbrinte-forurenet arktiske jord 8,9 af tjæresand minedrift ramte sedimenter og biofilm fra floden Athabasca 10,11, af rhizosfæren piletræer plantet i forurenet jord 12, af de menneskelige og dyrelegemer 13-16 og anaerobe rådnetanke 17.
jove_content "> I dette bidrag, vi detalje vores tilgang at sekventere 16S rRNA-genet amplikoner in-house ved hjælp af en bordplade næste generation sequencer (Ion Torrent PGM). Efter DNA-ekstraktion, 16S rRNA-generne forstærkes ved hjælp af domæne-level bakterielle primere, der indeholder sekventering adaptere og unikke, prøve-specifikke sekvenser (stregkoder). er amplikonerne renset, kvantificeres og samles på et ækvimolært forhold. De puljede prøver derefter klonalt forstærkes i en emulsion PCR og sekventeret. resulterer sekvenser analyseres ved hjælp af offentligt tilgængelige bioinformatiske værktøjer ( fx Mothur).Protocol
1. 16S rRNA-genet Amplicon Bibliotek Forberedelse af Fusion Metode
- Optø primerne (Forward, F343-Iona-MIDXX: 5'- CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 '; omvendt, R533-IonP1: 5'- FTT CTC TAT GGG CAG TCG GTG PÅ EN TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 '; fed: Ion Torrent specifikke adaptere, kursiv sekvensering nøgle til kalibrering signal intensitet i starten af forløbet run; regelmæssig skrift: skabelon-specifikke primere, X ... X: 10 bp stregkode, se tabel 1 for nogle stregkode-sekvenser), 2x HotStartTaq Plus mester mix og prøverne. Bland grundigt før brug, bortset fra skibsføreren mix, der skal blandes forsigtigt.
- Forbered en PCR-blanding (20 reaktioner ul) med 0,5 uM af den reverse primer, 0,4 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) og 1x HotStartTaq Plus Master mix. Tilføj 18.5 ul af master mix til eACH PCR-rør.
- Tilføj en fremadrettet primer (0,5 pi 20 mM) med en anden stregkode for hver af de prøver, der vil blive sekventeret sammen. Tilsæt 1 ul prøve (1-10 ng / ul) til PCR-rør.
- Anbring rørene i en PCR-maskine, og kør følgende program: indledende denaturering ved 95 ° C i 5 minutter; 25 cykler af 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek og 72 ° C i 45 sekunder; endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min. PCR-produkter kan opbevares ved 4 ° CO / N eller nedfrosset indtil anvendelse.
2. Amplicon Rensning, Kvantificering og Pooling
- En 2% agarosegel ved hjælp af de største kamme rådighed. Der tilsættes 5 ul 6x gel loading dye til reaktionsblandingen, og belastningen på gelen, der adskiller hver prøve af en tom brønd. Kør gelen ved 70 V i 50 min.
- Tag et billede af gelen og skære båndene (forventet størrelse omkring 250 bp: 190 bp produkt plus 63 bp adaptere og stregkoder) ved hjælp af en ren skalpel.
- Kvantificere hvert PCR-produkt med PicoGreen og foretage fortyndinger til opnåelse af en stamopløsning på 5 x 10 9 molekyler / ul (ca. 1 ng / ul). Hvis nogle af prøverne viser lavere forstærkning, justere fortyndinger til en lavere koncentration, at holde for øje, at den laveste koncentration egnet til efterfølgende procedurer er 1.57 x 10 7 molekyler / ul (26 pm).
- Pool 10 pi af hver fortyndet PCR-produkt for at opnå en ækvimolær pulje af prøver. Forbered en separat pool til hver af de planlagte sekventering løb. De samlede PCR-produkter kan opbevares i fryseren indtil anvendelse.
3. Emulsion PCR og sekventering
- Udfør emulsion PCR:
- Fortynd poolede PCR-produkter til 26 pM i et volumen på 25 ul. Optø reagenser fra et ion PGM skabelon kit.
- Forbered emulsionen PCR-blanding (reagenser leveres i sættet) i en PCR-hætte og tilføje de samlede PCR-produkter og Xerox partikler (medfølger) på bænken. Bland grundigt og indsætte blandingen i en filterpatron og omhyggeligt top med emulsion olie (medfølger).
- Langsomt vende filterpatronen og belastning på automatiserede emulsion PCR-apparat (f.eks Ion One Touch 2 instrument). Vælg det relevante program, og start proceduren.
- Efter den automatiske emulsion PCR er afsluttet, fjern supernatanten fra rørene indsamling og hente kuglen partikler på bunden af rørene. Opblande kugler i 100 ul vaskeopløsning (leveret med kittet), og tage en 2,0 pi portion til bibliotek kvantificering.
- Udfør biblioteket kvantificering.
- Bland 100 pi SSPE-buffer (150 mM NaCI, 10 mM NaPO4, 1 mM Na2 EDTA) med 2 pi adapter B'-Fam (5'-FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 ') sonde og 2 pi adapter A-Cy5 (5'Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3') sonde. Tilføj 52 ul af denne blanding til 2,0 pi portion taget i trin 3.2 og tilsæt 2 ul vaskeopløsning (fra skabelonen kit) til de resterende 52 pi som en blank for kvantificering.
- Inkuber ved 95 ° C i 2 minutter, derefter ved 37 ° C i 2 minutter. Overfør blandingerne i 1,5 ml rør.
- Tilsæt 1,0 ml TEX-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,01% Triton X-100, pH 8,0), blandes og centrifugeres ved 15.500 xg i 3 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og lad 20 ul i hvert rør. Gentag denne vask procedure to gange.
- Tilføj 180 ul TEX buffer, resuspendere pelleterede partikler og overføres til 500 pi qubit rør.
- Måle fluorescens til FAM og Cy5 hjælp af en qubit apparater og beregne forholdet mellem positive sfærer bruger regnemaskinen rådighed på Ion Fællesskabets websted.
- Berige resten af kuglen partikler til positive kugler (indeholdende amplificeret DNA) ved hjælp af et automatiseret berigelse (f.eks Ion One Touch berigelse System).
- Pipet reagenser i de relevante brønde af den medfølgende 8-godt strimmel: Godt 1: sphere partikler fra trin 3.2; Nå 2: forvasket MyOne Streptavidin C1 perler (13 gl); Nå 3, 4 og 5: vaskeopløsning (forudsat i skabelonen sættet); Godt 6: tom; Well 7: smelte-off opløsning (125 mM NaOH, 0,1% Tween 20); Nå 8: tom.
- Installer et tip på pipettering arm og et 0,2 ml rør til prøvetagning. Start instrumentet. Ved afslutningen af den berigelse, tilsættes 10 ul neutraliserende opløsning (medfølger). De berigede perler kan holdes en 4 ° C i op til 15 dage.
- Initialiser sekventering instrument:
- Opret forbindelse til sekventering instrumentet og forberede en sekventering køre med angivelse af de oplysninger om sekventering løb.
- Install vaskeopløsningen # 2 (forudsat i Ion PGM sekventering kit) vaskeopløsningen # 1 (350 ul 100 mM NaOH) og auto-pH-buffer-opløsning (medfølger).
- Start initialiseringsproceduren og når du bliver bedt tilføje dATP, dGTP dCTP og dTTP nukleotider (medfølger) i deres respektive 50 ml rør. Skru rørene på sekventering maskinen og fortsætte initialiseringsproceduren. Når initialiseringen er færdig, skal du starte kørslen procedure umiddelbart.
- Forbered prøver til sekventering og indlæse chip:
- Opsaml berigede kugler fra trin 3.4 ved bunden af røret ved centrifugering ved 15.500 x g i 1,5 min. Fjern supernatanten forlader Præcis 3 pi.
- Tilføj 3 ul sekventeringsprimer (forudsat i sekventering kit) og blandes grundigt ved pipettering op og ned for at resuspendere partiklerne. Inkuber ved 95 ° C i 2 minutter, derefter ved 37 ° C i 2 minutter.
- Tilsæt 1 pi polymerase (medfølger), bland godt og incubspiste ved stuetemperatur i 5 minutter. Fortsæt at indlæse enzym-sfære blandingen på sekvensering chippen inden for 30 min.
- Under inkubation indlæse sekventering chip på sequencer og udføre en chip kvalitetskontrollen. Væsken fjernes fra chippen ved centrifugering og indlæse prøven i chippen ved langsomt pipettering ned enzym-sfære blanding (7 pi) og undgå indførelsen af bobler i chippen.
- Centrifugeres chippen tre gange i 1 min i en mikrocentrifuge. Ændre retningen af chip på hver centrifugering og blandes ved pipettering op og ned mellem hver kørsel.
- Indlæse chip i instrumentet og start kørslen.
4. Grundlæggende Sequence Dataanalyse
- Opret forbindelse til sekventering dataserveren og download fastq fil. Opret en tabulatorsepareret "oligoer" fil, der indeholder primeren og stregkode oplysninger (se tabel 1). Download Greengenes referencefiler fra MotHUR hjemmeside ( http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ).
- Launch Mothur og udfører analyser:
- Konverter fastq fil til en FASTA og en kvalitet fil ved hjælp af følgende kommando: fastq.info (fastq = test.fastq)
- Bestem gruppe medlemskab af hver sekvens, og trimme de sekvenser, ved hjælp af følgende kommando: trim.seqs (FASTA = test.fasta, oligoer = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, MINLENGTH = 150, keepforward = T)
- De forskellige muligheder kan ændres i henhold til den ønskede stringens
- Klassificere sekvenserne i greengenes taksonomi ved hjælp af følgende kommando: classify.seqs (FASTA = test.trim.fasta, metode = Wang, gruppe = test.groups, skabelon = gg_99_otus.fasta, taksonomi = gg_99_otus.tax, cutoff = 50)
Representative Results
Efter oprensning på gel med 25 cyklusser af PCR-amplifikation amplifikationsprodukterne er normalt i en koncentration på 0,2 til 10,0 ng i 50 pi vand. Dette kan variere meget afhængigt af udgangs-DNA-koncentration, typen af prøve og oprensningskit anvendes. Det anbefales at holde antallet af PCR-cykler til det lavest mulige for at undgå kimære dannelse og mindske amplifikationsfremgangsmåder afvigelser, holde sig for øje, at alle prøver skal forstærkes ved hjælp af den samme antal cyklusser. For at minimere antallet af polyklonale læser og tomme områder og maksimere antallet af læser, bør qubit'en forholdet være mellem 0,1 og 0,3 og FAM fluorescens bør være over 200. Ved hjælp af en 314 chip på en Ion Torrent PGM, den gennemsnitlige produktion er omkring 0,3-0,5 M god kvalitet læser efter filtrering af resultaterne i Mothur. Tabel 2 viser en typisk fordeling af antallet af læser efter hvert trin i proceduren til en løbetur, der indeholder 36 multiplex miljømentale prøver forstærket med primere rettet mod V3-4 region 16S og analyseret under anvendelse Mothur. I Mothur, den trim.seqs procedure generere en "* .trim.fasta" fil, der indeholder sekvenser, der passerede de kvalitetskrav filtre og en "* .scrap.fasta", der indeholder de sekvenser, der ikke bestod de kvalitetskrav filtre sammen med grunden til forkastelse i sekvensen header. Når de leveres med stregkoder i "oligoer" fil, vil denne kommando også generere en "* .Grupper" fil, der indeholder gruppen medlemskab af hver sekvens baseret på stregkode-sekvens. Den classify.seqs procedure genererer en ".tax.summary", der kan åbnes i Excel. Denne fil indeholder en opsummering af den taksonomiske tilhørsforhold (i linjer) for hver af prøverne (i kolonner). Denne fil kan bruges til efterfølgende statistiske analyser og til at visualisere samfund sammensætning på forskellige taksonomiske niveauer. Den ".taxonomy" fil indeholder detaljerede taksonomiskemelde for hver sekvens. Den gennemsnitlige samfund sammensætning på phylum / klasse-niveau på tværs af alle 36 prøver, er vist i figur 1.
Figur 1. Gennemsnitlig samfund sammensætning på phylum / klasse niveau på tværs af alle prøver.
| fremad | TACGGRAGGCAGCAG | |
| stregkode | CTAAGGTAAC | Sample01 |
| stregkode | TAAGGAGAAC | Sample02 |
| AAGAGGATTC | Sample03 | |
| stregkode | TACCAAGATC | Sample04 |
| stregkode | CAGAAGGAAC | Sample05 |
| stregkode | CTGCAAGTTC | Sample06 |
| stregkode | TTCGTGATTC | Sample07 |
| stregkode | TTCCGATAAC | Sample08 |
| stregkode | TGAGCGGAAC | Sample09 |
| stregkode | CTGACCGAAC | Sample10 |
Tabel 1. Eksempel "oligos" fil til brug i Mothur.
| # Af læser | % Af tidligere trin | Gns. per prøve | |
| Antallet af brønde | 1262519 | - | 35,070 |
| Brønde med perler | 1114108 | 88.20% | 30.947 |
| Perler med skabeloner | 1112746 | 99,90% | 30.910 |
| Monoklonale perler | 826805 | 74.30% | 22,967 |
| God kvalitet læser (Output fra sequencer) | 782204 | 94,60% | 21.728 |
| Pass Mothur filtre (min. Gns. Kvalitet score på 20 over en 50bp vindue, min. Længde på 150bp) | 372168 | 47.60% | 10.338 |
| Klassificeret på phylum niveau i GreenGenes (50% tillid tærskel) | 342171 | 91.90% | 9.505 |
| Klassificeret i familien i GreenGenes (50% tillid tærskel) | 316512 | 92.50% | 8.792 |
| Klassificeret på slægten niveau i GreenGenes (50% tillid tærskel) | 289899 | 91,60% | 8.053 |
Tabel 2. Antal læser produceret fra en typisk køre for 36 miljøprøver multiplekseres på én Ion Torrent 314 chip.
Discussion
Metoden præsenteres her er ligetil og billig, og det bør tillade mange laboratorier at få adgang til magt metagenomisk sekventering. Selvom det varierer afhængigt af sekventering anvendte platform, når bibliotekerne er konstrueret meget lidt hands-on tid er nødvendig, idet de fleste af processen bliver automatiseret. For sekventering platform bruges her (Ion Torrent PGM), kan den fuldstændige procedure udføres inden for to dages arbejde. I skrivende stund (September 2013), reagensbeholderne omkostninger i forbindelse med eksempel beskrevet ovenfor var som følger: PCR-amplifikation af 36 prøver $ 25, geloprensning og PicoGreen DNA kvantificering af 36 prøver: $ 125, emulsion PCR for en pooled amplikon prøve : $ 150 og sekventeringsreagenser: $ 250, til et samlet beløb på $ 550 eller $ 15 per prøve eller ,0015 $ pr kvalitet filtreret læse. Denne pris inkluderer ikke instrumentet servicekontrakt, instrument afskrivninger, tekniker løn og brug laboratorium plads.
telt "> Et af de vigtigste skridt er at samle alle de produkter i et ækvimolært forhold, med henblik på at hente tilsvarende antal læser for hver af prøverne. PicoGreen kvantificering blev brugt her, men andre metoder kan være egnet, men mindre nøjagtige (fx UV-kvantificering, gel-kvantificering). Selv ved at gøre mest nøjagtig kvantificering og samling, der er en vis variation i antallet af læser per prøve, og i typisk kørsel vist i tabel 2, er det i området fra 4.380 til 32.750 læser, med et gennemsnit på 10.338 læser. hvis behandlingen stort antal prøver (mere end 40-50), kan enkelt kolonne geloprensning blive erstattet af geloprensning i plade eller rensning ved hjælp af kugler med en stringent størrelse cutoff (f.eks AMPure perler) .Til dato den mest anvendte næste generation sekventering teknologi til 16S rRNA-genet er 454. Ion Torrent sekventering teknologi, der anvendes i denne protokol er konceptuelt meget enstil 454 og begge teknologier er udsat for samme type sekventeringsfejl. Ikke overraskende blev det vist, at Ion Torrent sekventering resulterede i Sekventeringsresultaterne meget ligner 454 sekventering 10. For nylig har mange forskere har undersøgt anvendelsen af Illumina teknologi til 16S rRNA-genet amplikon sekventering 18,19. Under alle omstændigheder ville det være let at tilpasse den nuværende protokol til andre stationære sequencere ligesom Illumina MiSeq eller 454 GS Junior ved at ændre fusion primersekvenserne til at matche de adaptere og stregkoder, der er nødvendige for disse sekventering teknologier, ligesom i metoden beskrev for nyligt til Illumina MiSeq 19. Alternativt kunne forskerne følge trin 1 og 2 i protokollen beskrevet her og sende de poolede amplikoner til en sekventering center, hvor emulsionen PCR og sekventering ville blive udført.
16S rRNA-genet læser blev trimmet og klassificeres ved anvendelse Mothur, men mange andre analyser kan udføres på16S rRNA-gen-ampliconer. For eksempel kan beta mangfoldighed vurderes ved at beregne Unifrac afstande mellem hver prøve par ved anvendelse af fremgangsmåden skitseret på http://unifrac.colorado.edu/ 20. Alpha mangfoldighed indeks og antallet af operative taksonomiske enheder af hver prøve kan beregnes ved hjælp af værktøjer inden QIIME ligesom AmpliconNoise 21 eller under anvendelse af proceduren skitseret af Huse et al. 22 og til rådighed inden Mothur.
Primerne anvendes her amplificerede de variable regioner 3 og 4 fra 16S-rRNA-genet, men mange andre områder kan målrettes. I nærværende undersøgelse blev 16S rRNA-generne mangfoldiggjort fra plantemateriale og valget af primer blev foretaget for at undgå opformering af kloroplast 16S rRNA-genet 23,24. Der er en bred vifte af andre primere er tilgængelige, der varierer i sigt af produktets længde, taksonomiske effekt og anvendelighed 25,26. Men i alle tilfælde 200-400 bp læser af 16S rRNA-genet ikke pålideligt kan klassificeres på artsniveau, og analyser er begrænset til slægten og højere taksonomiske niveauer. Andre gener kunne være mere hensigtsmæssigt, hvis der er behov for information artsniveau, ligesom cpn60 og rpoB gener 27,28. Fremtidige drastiske fald i prisen på sekventering og stiger i kraft af analytiske værktøjer kan gøre det muligt at erstatte 16S rRNA-genet sekventering ved shotgun metagenomics, men indtil da 16S rRNA-genet sekventering fortsat guldstandarden af miljø mikrobiologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ion 314 Chip Kit v2 | Life Technologies | 4482261 | |
| Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 | Life Technologies | 4482006 | |
| Ion PGM Template OT2 200 Kit | Life Technologies | 4480974 | |
| HotStarTaq Plus Master Mix Kit | Qiagen | 203646 | |
| Primers and probes | IDT | NA | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BSA 20 mg/ml | Roche | 10,711,454,001 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65001 |
References
- Sipos, R., et al. Addressing PCR biases in environmental microbiology studies. Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies. PLoS ONE. 6, e27310 (2011).
- Tringe, S. G., Hugenholtz, P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).
- Margulies, M., et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. 437, 376-380 (2005).
- Kuczynski, J., et al. Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns. Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).
- Bondici, V. F., et al. Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects. J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).
- Auffret, M., et al. Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems. FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).
- Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil. FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).
- Bell, T. H., et al. Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance. ISME J. 7, 1200-1210 (2013).
- Yergeau, E., et al. Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).
- Yergeau, E., et al. Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations. Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).
- Yergeau, E., et al. Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination. ISME J. 8, 344-358 (2013).
- Deagle, B. E., et al. Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count. Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).
- Milani, C., et al. Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol. PLoS ONE. 8, e68739 (2013).
- Jünemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing. PLoS ONE. 7, e41606 (2012).
- Petrof, E., et al. Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut. Microbiome. 1, 3 (2013).
- Whiteley, A. S., et al. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform. J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6, 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., et al. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).
- Hamady, M., et al. Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data. ISME J. 4, 17-27 (2010).
- Quince, C., et al. Removing noise from pyrosequenced amplicons. BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).
- Huse, S. M., et al. Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering. Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).
- Edwards, J. E., et al. Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen. FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).
- Rastogi, G., et al. A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments. J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).
- Baker, G. C., et al. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).
- Links, M. G., et al. The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data. PLoS ONE. 7, e49755 (2012).
- Vos, M., et al. Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity. PLoS ONE. 7, e30600 (2012).
