Abstract
Mikrobiyal ekolojide önemli sorulardan biri "kim var?" Olan bu soru çeşitli araçları kullanarak cevap, ancak uzun ömürlü altın standartlardan biri etki düzeyinde PCR tarafından oluşturulan 16S ribozomal RNA (rRNA) gen amplıkonları sıralamak için olabilir genomik DNA'dan amplifiye reaksiyonları. Geleneksel olarak, bu klonlama ve Sanger (kapiler elektroforez) PCR amplikonlarının dizilemesi ile gerçekleştirilmiştir. Gelecek nesil dizileme gelişi müthiş basitleştirilmiş ve 16S rRNA gen sıralama için sıralama derinliği artmıştır. Benchtop sıralayıcıların tanıtımı şimdi küçük laboratuvarlar gün bir konuda in-house kendi 16S rRNA sıralamayı gerçekleştirmek için olanak sağlar. Burada, bir tezgah üstü nesil dizi kullanılarak, 16S rRNA gen amplikon dizileme için bir yaklaşım ayrıntılı olarak verilmiştir. Çevresel DNA dizi analizi ilk adaptör ve barkod içeren primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir. Daha sonra emülsiyon, PCR yoluyla küresel parçacıklar kuple edilir. Parçacıklar l vardırBir tek çip üzerinde oaded ve çip dizisi yapıldı ve bundan sonra sıralama makinesi içinde eklenir. Sekanslar, fastq biçiminde alınır, filtre edilmiş ve barkod okur numune üyelik oluşturmak için kullanılır edilir. Daha sonra kamuya mevcut araçları kullanarak analiz edilir okur süzülür ve binned. Okur bir örnek analiz Mothur verilen yazılım paketi içinde bir sınıflandırma-bulma algoritması ile sınıflandırıldı. Burada özetlenen yöntem, basit, ucuz ve basittir ve devam eden genomik devrimden yararlanmak küçük laboratuarları yardımcı olmalıdır.
Introduction
Çevresel bir numunesi içinde ihtiva edilen genetik bilgilerin tamamını hedef olarak metagenomic dizileme çok güçlü bir teknolojidir. Av tüfeği sıralama, büyük-insert kütüphaneler ve amplikon sıralama dahil metagenomic sıralamanın farklı tatlar vardır. Amplikon dizisi oluşturma genel olarak düzenlenebilir, bir tek genomik bölgeden göreceli olarak ucuz, hızlı ve okur üretmek mümkün olma avantajını sunmaktadır. Ayrıca, amplikonu sıralama için veri analizi iş akışı çoğunlukla standardize edilmiştir. Bu PCR dayalı olduğundan Ancak, tüm eksik özgüllük, eksik kapsam ve astar ile ilgili önyargıları en iyi yarı-kantitatif bu yaklaşımı yapar 1,2, eğilimlendireceği vardır. Birçok fonksiyonel bölgeleri genomik genler de dahil olmak üzere, amplikon, sıralama için hedef olabilir, ama en popüler seçenek bir topluluk profili oluşturmak amacıyla, örneğin, 16S rRNA geni gibi marker genleri olarak kullanım için vardır. Geleneksel olarak, 16S rRNA gen amplikon sequencing E'de klonlama dahil emek yoğun teknikler kullanılarak gerçekleştirilmiştir E. coli, koloni toplama ve izole edilen plasmidler üzerindeki Sanger dizileme ile ekstraksiyon ve ardından plazmid, ve dolayısıyla, çalışmaların çoğu numune başına 100'den daha az klon analiz edilmiştir. Yeni nesil dizileme iki önemli ilerlemeler getirdi: en önemlisi sıralama reaksiyonlar ve kitlesel paralelleştirmeyi şablonları klonal ayrılmasını bir dizi gen parçaları eklemek için gerek kalmadan. Bu son derece 16S rRNA dizilemesi 3 amplikonu için bir "Renaissance" ile sonuçlanan, hemen geri birçok çevresel Mikrobiyoloji çalışmaları rutin bir özellik olarak bir 16S rRNA gen amplikonların sıralama, basitleştirmiştir.
2005 4 Roche 454 dizileme gelişiyle bu yana, diğer birkaç nesil dizileme teknolojileri piyasaya çıktı (örn, Illumina, Katı, PacBio). Tezgah üstü dizisinin Daha yakın zamanda, girişrs küçük laboratuarlara büyük dizileme merkezlerine kez özel sıralama kapasitesini getirdi. Beş Benchtop makineleri mevcuttur: 454 GS Junior Ion Torrent Kişisel Genom Makinesi (PGM) ve Proton ve Illumina MiSeq ve NextSeq 500. tüm bu dizicilerini az sunan en YARIZAMANLI daha vadede ve dolar başına daha az baz başına okur ise ölçek sequencers, onlar hızlı, daha esnek ve düşük satın alma ve çalıştırma maliyetleri küçük akademik laboratuvarlar için onlara uygun hale getirir. Çalışmaların bu tip, genel olarak bir sekanslama derinliğine gerekli değildir, çünkü, özellikle de masa üstü sekanslayıcı çevresel Mikrobiyoloji çalışmalarda amplikon, küçük genomu ve düşük karmaşıklık metagenome sekanslaması için uygundur. Örneğin, genellikle 16S rRNA gen dizileme sayısını inceleyen için multi-milyon veri setlerini 5 okur gibi aynı desen üretebilirsiniz okur 1.000 ~ olarak, numune başına okur şeyden olmadığı kabul edilmektedir. Söyledikten, tezgah üstü sonraki generatio n sequencers hala maksimal verimi ile dizi büyük miktarda veri oluşturmak ~ 35 Mbp (454 GS Yeni) ~ 2 Gbp (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (Ion Torrent Proton), ~ 10 Gbp (Illumina MiSeq) ve en çevre mikrobiyolojisi çalışmaları için daha yeterli ~ 100 Gbp (Illumina Sonraki Dizi 500),.
Benchtop sekanslayıcılar kullanılarak 16S rRNA amplikonlarının nesil dizileme yakın ortamlarda çeşitli uygulanmıştır. Örneğin, İyon Torrent PGM toplum için kullanılır olmuştur petrol kumları madencilik etkilenen sedimanlar, hidrokarbon-kirlenmiş Arctic toprakların 8,9 yetiştiricilik sistemleri 7, devinimiyla, özellikle yüksek pH ve düşük geçirgenliği 6 vardı uranyum maden atıklarının analiz ve insan ve hayvan organlarının 13-16, kirlenmiş topraklarda 12 ekilen söğütler ve anaerobik çürütücü 17 rizosferde bir Athabasca Nehri 10,11 dan biyofilm.
Bu katkı detaylı bir tezgah üstü nesil sequencer (Ion Torrent PGM) kullanarak evde 16S rRNA gen amplıkonları sıralamak bizim yaklaşım olarak jove_content ">. DNA izolasyonundan sonra, 16S rRNA genleri içeren etki alanı düzeyinde bakteriyel primerler kullanılarak yükseltildi edilir dizileme adaptörler ve benzersiz örnek özgü dizileri (barkod). Amplıkonlar eşit mol oranında, arıtılmış, miktarı ve bir araya getirilmiştir. Örnekler daha sonra bir araya getirilmiş klonal bir emülsiyon PCR ile amplifiye edilmiş ve sekans işlemi uygulanır. Elde edilen diziler (halka açık biyoenformatik aletleri kullanılarak analiz edilir örneğin, Mothur).Protocol
Füzyon Yöntemi ile 1. 16S rRNA gen Amplikon Kütüphane Hazırlık
- 5'- SKK CTC:;, ters R533-IonP1 5'- CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 ': primerler (İleri, F343-Iona-MIDXX eritin Bir TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 'AT TAT GGG CAG TCG GTG; kalın: İyon Torrent özel adaptörler; italik:; normal yazı tipi sıralama çalışmasının başında sinyal yoğunluğu kalibre için sıralama anahtarı: template-spesifik primerler; X ... X: 10 bp barkod, bazı barkod dizileri için bakınız Tablo 1), 2x HotStartTaq Artı usta karışımı ve örnekleri. Hafifçe karıştırılmalıdır ana karışımı hariç, kullanmadan önce iyice karıştırınız.
- Ters primer 0.5 uM, 0.4 mg / büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 1x HotStartTaq ve master karışımı ml bir PCR karışımı (20 ul reaksiyonları) hazırlayın. E ana karışımı 18.5 ul ekleyinach PCR tüp.
- Birlikte dizildi edilecek numunelerin her biri için farklı bir barkod olan bir ileri primer (20 mM, 0.5 ul) eklenir. PCR tüpü, numune 1 ul (1-10 ng / ml) eklenir.
- PCR makine tüpleri yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 5 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon; 30 saniye için 95 ° C 25 döngü, 30 saniye boyunca 55 ° C, 45 saniye için 72 ° C; ' 10 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma. PCR ürünleri 4 ° CO tutulur / N veya kullanılıncaya kadar donmuş olabilir.
2. Amplikon Arıtma, Sayımı ve havuzu
- En tarak olarak temin edilebilen bir% 2 agaroz jeli hazırlayın. De boş her numune ayrılması jel üzerinde reaksiyonu ve yük 6x jel yükleme boyası 5 ul ekleyin. 50 dakika boyunca 70 V jel çalıştırın.
- Jel resim çekin ve bantları kesti (250 bp etrafında beklenen boyutu: 190 bp ürünü artı 63 bp adaptörleri ve barkod) temiz bir neşter kullanılarak.
- PicoGreen her bir PCR ürünü sayısal olarak 5 x 10 9 molekül / ul (yaklaşık 1 ng / ul) ile bir stok çözeltisi elde etmek için dilüsyonları yapmak. Bazı örnekler düşük büyütme göstermek isterseniz, sonraki işlemler için uygun en düşük konsantrasyon 1,57 x 10 7 moleküller / ul (26 pM) olduğunu akılda tutarak, daha düşük bir konsantrasyonda dilüsyonlarını ayarlayın.
- Her bir seyreltilmiş PCR ürünü Havuzu 10 ul numune eşmolar bir havuz elde etmek için. Planlanan sıralama seferin her biri için bir ayrı bir havuz hazırlayın. Kullanılana kadar bir araya getirilmiş PCR ürünleri, dondurucuda saklanabilir.
3. Emülsiyon PCR ve Sıralama
- Emülsiyon PCR gerçekleştirin:
- 25 ul bir hacim içinde 26 pM, havuzdan toplanan PCR ürünlerinin seyreltin. Ion PGM şablon kiti çözülme reaktifler.
- PCR kaputu emülsiyon PCR karışımı (kitinde reaktifler) hazırlayın ve bankta toplanmış PCR ürünleri ve (verilen) küre parçacıkları ekleyin. İyice karıştırın ve bir filtre kartuş içinde karışımı yerleştirin ve dikkatli emülsiyon yağ ile top (sağlanan).
- Yavaşça otomatik emülsiyon PCR cihazında (örneğin, İyon One Touch 2 alet) üzerine filtre kartuşunu ve yük ters. Uygun programı seçin ve prosedürü başlatın.
- PCR tamamlandıktan sonra otomatik emülsiyon, toplama tüpleri süpernatantı ve tüplerin alt küre parçacıkları almak. (Kitte sağlanan), yıkama çözeltisinin 100 ul küreler tekrar ve kütüphane miktar tayini için bir 2.0 ul tablet alın.
- Kütüphane miktarının gerçekleştirin.
- SSPE tamponu (150 mM NaCI, 10 mM napo 4, 1 mM Na 2 -EDTA) Adaptör B'-Fam 2 ul (5'-FAM ile -CT 100 ul karıştırınG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 ') prob ve Adaptör A-Cy5'in 2 ul (5'Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3') prob. Adım 3.2 'de alınan 2.0 ul kana Bu karışımın 52 ul ekleyin ve miktar tayini için bir boşluk olarak kalan 52 ul (şablon kit) yıkama çözeltisi, 2 ul ekle.
- 2 dakika için 37 ° C de, 2 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edilir. 1.5 ml tüpler içindeki karışımları aktarın.
- Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 15.500 x g'de TEX tampon maddesi (10 mM Tris, 1 mM EDTA,% 0.01 Triton X-100, pH 8.0) içinde, 1.0 ml, ekleyin ve karıştırın santrifüj. Süpernatantı ve her tüp içinde 20 ul bırakın. Bu yıkama işlemi iki kez tekrarlanır.
- TEX tampon 180 ul pelet tanecikleri yeniden sübyeleştirmek ve 500 ul Qubit tüplere aktarın.
- Bir Qubit aparatı kullanılarak FAM ve Cy5 için floresan ölçmek ve İyon Topluluk web sitesinde bulunan hesap makinesi kullanarak olumlu kürelerin oranını hesaplamak.
- Otomatik zenginleştirme sistemi (örneğin, İyon One Touch Zenginleştirme Sistemi) kullanarak (amplifiye DNA içeren) pozitif küreler için küre parçacıkların kalan zenginleştirin.
- Sağlanan 8-iyi şeridinin uygun kuyularda Pipetleyin reaktifler: Peki 1: adım 3.2 'den küre parçacıklar; 2 Peki: MyOne Streptavidin C1 boncuk (13 ul) önceden yıkanmış; De 3, 4 ve 5: yıkama çözeltisi (şablon kitte sağlanan); 6 Şey: boş; İyi 7: eriyik dışı çözeltisi (125 mM NaOH,% 0.1 Tween 20); Peki 8: boş.
- Pipetleme kolunda bir ipucu ve numune toplanması için 0.2 ml tüp takın. Aleti başlatın. Zenginleştirme sonunda, çözelti (Resim) nötralize 10 ul ekle. Zenginleştirilmiş boncuk kadar 15 gün boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Sıralama cihazı başlatılamıyor:
- Sıralama çalıştırmak ayrıntılarını belirterek, sıralama cihaza bağlayın ve bir sıralama çalışma planı hazırlar.
- InstalL. yıkama çözeltisi # 2 (iyon PGM dizileme kitte sağlanan), yıkama çözeltisi # 1 (350 ul 100 mM NaOH) ve oto-pH tampon çözeltisi (verilmiştir).
- Başlatma prosedürü başlatın ve ne zaman kendi 50 ml'lik tüplere dATP, dGTP ve dTTP'nin dCTP nükleotidler (Resim) ekleyin istenir. Sıralama makine üzerine tüpler vida ve başlatma işlemi devam ediyor. Başlatma tamamlandığında, hemen çalışma prosedürü başlatmak.
- Sıralama için örnekleri hazırlayın ve yonga yüklemek:
- 1.5 dakika boyunca 15,500 x g'de santrifüj ile tüpün altındaki adım 3.4 zengin küreler toplayın. Tam 3 ul bırakarak süpernatantı.
- (Sıralama kitinde) dizileme primeri 3 ul ekleyin, parçacıkların tekrar süspansiyon aşağı yukarı pipetleme ile iyice karıştırın ve. 2 dakika için 37 ° C de, 2 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edilir.
- Polimeraz (sağlanan), iyice karıştırın ve inkubasyon 1 ul ekle5 dakika boyunca oda sıcaklığında yedi. 30 dakika içinde sekanslama çip üzerinde enzim karışımı küre yüklemek için devam edin.
- İnkübasyon sırasında, dizileyiciye sıralama çip yüklemek ve bir çip kalite kontrolü gerçekleştirecek. Santrifüj ile çip sıvıyı çıkarın ve yavaşça enzim küre karışımı (7 ul) aşağı pipetleyerek ve yongada kabarcıklarının giriş kaçınarak çipte örnek yüklemek.
- Bir mikrosantrfuj 1 dakika boyunca üç kez çipini santrifüjleyin. Her santrifüj de çip yönünü değiştirin ve pipetleme ve her vadede arasında aşağı karıştırın.
- Enstrüman çip yükleyin ve çalışma başlatmak.
4. Temel Dizi Veri Analizi
- Sıralama veri sunucusuna bağlanmak ve fastq dosyasını indirin. Astar ve barkod bilgileri (Tablo 1 örneğe bakın) içeren bir sekme ile sınırlandırılmış "oligo'lar" dosyası oluşturun. Mot adlı greengenes referans dosyaları indirmekhur et ( http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ).
- Mothur başlatın ve analizlerini gerçekleştirmek:
- Aşağıdaki komutu kullanarak bir FASTA için fastq dosyası ve kaliteli bir dosya dönüştürme: fastq.info (fastq = test.fastq)
- Her dizinin grup üyeliğini belirlemek ve aşağıdaki komutu kullanarak dizileri Döşeme: trim.seqs (Fasta = test.fasta, oligolar = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minLength = 150, keepforward = T),
- Çeşitli seçenekler, arzu edilen sertlik göre değiştirilebilir
- Aşağıdaki komutu kullanarak greengenes taksonomisinde diziler sınıflandırma: classify.seqs (Fasta = test.trim.fasta, yöntem = wang, grup = test.groups, şablon = gg_99_otus.fasta, taksonomi = gg_99_otus.tax, kesim = 50)
Representative Results
Jeli üzerinde saflaştırmadan sonra, PCR amplifikasyonu 25 döngü, amplifikasyon ürünleri, su 50 ul ng 0,2-10,0 bir konsantrasyonda genellikle. Bu, başlangıç DNA'sı konsantrasyonu, numune tipine ve kullanılan saflaştırma kiti bağlı olarak geniş ölçüde değişebilir. Tüm örnekler döngü aynı sayıda kullanımı ile amplifiye edilebilir olmalıdır göz önünde tutarak, kimera önlenmesi ve amplifikasyon yanlılığı azaltmak için mümkün olan en düşük PCR döngüsü sayısını tutulması tavsiye edilir. Poliklonal sayısını okur ve boş küreler en aza indirmek ve okuma sayısını en üst düzeye çıkarmak için, Qubit oranı, ortalama çıkış yaklaşık olarak 0.1 ile 0.3 ve FAM floresan bir iyon Torrent PGM bir 314 yongası ile 200 üzerinde olmalıdır arasında olmalıdır 36 multiplekslenmiş environ ihtiva eden bir çalışma için prosedürün her aşamasından sonra okur, 0.3-0.5 M iyi kalitede Mothur sonuçların, süzme işleminden sonra okur. Tablo 2 sayısı tipik bir dağılımını göstermektedirruhsal örnekleri primerler 16S V3-4 bölgeyi hedefleyebilir ve Mothur kullanılarak analiz ile amplifiye edilmiştir. Mothur yılında trim.seqs prosedür kalite filtreleri ve gerekçe ile birlikte kaliteli filtreleri geçemedi dizileri içeren bir "* .scrap.fasta" geçti dizileri içeren bir "* .trim.fasta" dosyası oluşturmak dizi başlığı ret. "Oligolar" dosyasında barkod ile birlikte, bu komut da barkod dizisine dayanan her sekansın grup üyeliğini içeren bir "* fitilden" dosyası oluşturur. Classify.seqs prosedür Excel'de açılabilen bir ".tax.summary" oluşturur. Bu dosya (sütunlarda) örneklerin her biri için (satır) taksonomik bağlarının bir özetini içerir. Bu dosya aşağı istatistiksel analizler için kullanılabilir ve çeşitli taksonomik düzeylerde toplum kompozisyon görselleştirmek için. ".taxonomy" Dosyası ayrıntılı taksonomik içerirher dizisi için bağlı. 36 örneklerin genelinde filumudur / sınıf düzeyinde ortalama topluluk kompozisyonu Şekil 1'de gösterilmiştir.
Tüm örneklerin genelinde filumudur / sınıf düzeyinde 1. Ortalama toplum kompozisyonu Şekil.
| ileri | TACGGRAGGCAGCAG | |
| Barkod | CTAAGGTAAC | Sample01 |
| Barkod | TAAGGAGAAC | Sample02 |
| AAGAGGATTC | Sample03 | |
| Barkod | TACCAAGATC | Sample04 |
| Barkod | CAGAAGGAAC | Sample05 |
| Barkod | CTGCAAGTTC | Sample06 |
| Barkod | TTCGTGATTC | Sample07 |
| Barkod | TTCCGATAAC | Sample08 |
| Barkod | TGAGCGGAAC | Sample09 |
| Barkod | CTGACCGAAC | Sample10 |
Mothur kullanılmak üzere Tablo 1. Örnek "oligo'lar" dosyası.
| # Okur | Önceki aşamada% | Ort. Örnek başına | |
| Kuyu sayısı | 1262519 | - | 35,070 |
| Boncuklar ile kuyu | 1114108 | 88.20% | 30.947 |
| Şablonları ile Boncuk | 1112746 | 99.90% | 30,910 |
| Monoklonal boncuk | 826.805 | 74.30% | 22,967 |
| İyi kalite okur (sequencer Çıktı) | 782.204 | 94.60% | 21,728 |
| Geçiş Mothur filtreler (Min. Ort. 50 baz puanlık bir pencere üzerinde 20 kalite puanı, Min. 150bp uzunluğu) | 372.168 | 47.60% | 10.338 |
| Greengenes yılında filumudur seviyede sınıflandırılan (% 50 güven eşiği) | 342.171 | 91.90% | 9,505 |
| Greengenes aile düzeyinde sınıflandırılan (% 50 güven eşiği) | 316.512 | 92.50% | 8.792 |
| Greengenes yılında cins düzeyinde sınıflandırılan (% 50 güven eşiği) | 289.899 | 91.60% | 8.053 |
Bir Ion Torrent 314 çip çoğullanmasıyla 36 çevresel örneklerde tipik bir çalışma üretilen okur Tablo 2. sayısı.
Discussion
Burada sunulan yöntem basit ve ucuz olduğunu ve birçok laboratuarlar metagenomic sıralama gücünü erişmek için izin vermelidir. , Kullanılan sekanslama platforma bağlı olarak değişmekle birlikte, bir kez kütüphaneler sürecinin en otomatize edilir çok az eller süresi gereklidir inşa edilir. Burada kullanılan sekanslama platformun (iyon sel PGM) için tam bir prosedür çalışma iki gün içinde gerçekleştirilebilir. PCR, 36 numune amplifikasyon: 36 örneklerinin 25 $, jel saflaştırma ve PicoGreen DNA kantitatif aşağıdaki gibidir: (Eylül 2013) yazma Şu anda, yukarıda ayrıntılı olarak örnek ile ilgili reaktif maliyetlerdi $ 125, bir emülsiyon PCR ile bir araya getirilmiş amplikonu numune için : $ 550 ya da numune başına 15 $ veya kalitesi filtreli okuma başına 0,0015 $ toplam 250 $, $ 150 ve sıralama reaktifler. Bu fiyat, enstrüman hizmeti sözleşmesi, enstrüman amortisman, teknisyen maaş ve laboratuvar alanı kullanımını içermez.
örneklerin her biri için, okur çadır "> en önemli adımlardan biri, benzer sayıda almak üzere, eşit molar oranda tüm ürünleri havuzu etmektir. PicoGreen miktar burada kullanıldığı, fakat diğer yöntemler de, daha az hassas, uygun olabilir (örneğin, UV ölçümü, jel esaslı ölçüm). bile en doğru olarak gösterir ve havuzu yaparak, numune başına okur sayısında bir değişkenlik vardır ve Tablo 2'de ayrıntıları verilen tipik bir çalışma süreci içinde, bir ikinci 4380 32750 arasında değişir 10.338 arasında bir ortalama okuma ile okur. örneği (40-50 daha fazla) çok sayıda işleme durumunda, tek bir sütun jeli ile arıtma bir katı boyut kesilmesi ile levha veya saflaştırma ile boncuk jel saflaştırma ile ikame edilebilir (örneğin, AMPure boncuk) .Bugüne kadar, 16S rRNA geni için en çok kullanılan yeni nesil dizileme teknolojisi, bu protokolde kullanılan 454. İyon Torrent sıralama teknolojisi kavramsal çok benzer olduğunu454 ve her iki teknoloji dizileme hataların aynı tür yatkındır. Şaşırtıcı değil Ion Torrent dizileme 454 dizileme 10 çok benzer sıralama sonuçlardan dolayı gösterilmiştir. Son zamanlarda, birçok araştırmacı 16S rRNA gen amplikonu dizileme 18,19 için Illumina teknoloji kullanımını araştırdı. Her durumda, bu yöntemde en son tarif edilen şekilde, bu sekans teknolojilerini için gerekli olan adaptörler ve barkod eşleştirmek için, füzyon primer dizileri değiştirerek Illumina MiSeq veya 454 GS Junior gibi diğer tezgah sequencer şu anki protokolünü adapte kolay olurdu Illumina MiSeq 19 için. Alternatif olarak, araştırmacılar adımları burada ayrıntılı protokolün 1 ve 2 takip ve emülsiyon PCR ve sıralama gerçekleştirilir olacağını bir sıralama merkezine toplanmış amplıkonları gönderebilir.
16S rRNA gen kesilmiş ve Mothur kullanarak sınıflandırılır, ama birçok diğer analizler yapılabilir edildi okur16S rRNA gen amplikonları. Örneğin, p çeşitlilik de ana hatları çizilen prosedür kullanılarak her numune çifti arasındaki mesafeleri hesaplamak Unifrac ile değerlendirilebilir http://unifrac.colorado.edu/ 20. Alfa indeksler ve her bir numunenin işletme taksonomik birimlerinin sayısı AmpliconNoise 21 gibi QIIME olan araçlar kullanılarak ya da Mothur içinde Huse ve ark. 22 ve kullanılabilir tarafından ana hatları çizilen prosedür kullanılarak hesaplanabilir.
Burada kullanılan primerler 16S rRNA geninin değişken bölgeler 3 ve 4, büyütülmüş, ancak bir çok diğer bölgeler hedeflenebilir. Bu çalışmada, 16S rRNA genleri bitki malzemesinden büyütülmüş ve primerin seçimi kloroplast 16S rRNA geninin 23,24 genleşmesini önlemek için yapıldı. Ürün uzunluğu, taksonomik güç ve kullanışlılık 25,26 vadede farklılık mevcut diğer primerler geniş bir çeşitlilik vardır. Bununla birlikte, tüm durumlarda 200-400 bp güvenilir tür düzeyinde sınıflandırılmış olamaz 16S rRNA geninin okur ve analizler cinsi ve daha yüksek taksonomik seviyelere sınırlıdır. Türler seviyesi bilgileri cpn60 ve rpoB genler 27,28 gibi, ihtiyaç duyulması halinde diğer genler daha uygun olabilir. Analitik araçların gücü, sıralama ve artar maliyet Gelecek köklü damlaları mümkün av tüfeği metagenomics tarafından 16S rRNA gen sıralamasını değiştirmek için yapmak olabilir, ama o zamana kadar 16S rRNA gen dizileme çevresel mikrobiyoloji altın standart olmaya devam etmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ion 314 Chip Kit v2 | Life Technologies | 4482261 | |
| Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 | Life Technologies | 4482006 | |
| Ion PGM Template OT2 200 Kit | Life Technologies | 4480974 | |
| HotStarTaq Plus Master Mix Kit | Qiagen | 203646 | |
| Primers and probes | IDT | NA | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BSA 20 mg/ml | Roche | 10,711,454,001 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65001 |
References
- Sipos, R., et al. Addressing PCR biases in environmental microbiology studies. Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies. PLoS ONE. 6, e27310 (2011).
- Tringe, S. G., Hugenholtz, P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).
- Margulies, M., et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. 437, 376-380 (2005).
- Kuczynski, J., et al. Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns. Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).
- Bondici, V. F., et al. Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects. J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).
- Auffret, M., et al. Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems. FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).
- Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil. FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).
- Bell, T. H., et al. Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance. ISME J. 7, 1200-1210 (2013).
- Yergeau, E., et al. Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).
- Yergeau, E., et al. Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations. Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).
- Yergeau, E., et al. Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination. ISME J. 8, 344-358 (2013).
- Deagle, B. E., et al. Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count. Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).
- Milani, C., et al. Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol. PLoS ONE. 8, e68739 (2013).
- Jünemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing. PLoS ONE. 7, e41606 (2012).
- Petrof, E., et al. Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut. Microbiome. 1, 3 (2013).
- Whiteley, A. S., et al. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform. J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6, 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., et al. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).
- Hamady, M., et al. Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data. ISME J. 4, 17-27 (2010).
- Quince, C., et al. Removing noise from pyrosequenced amplicons. BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).
- Huse, S. M., et al. Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering. Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).
- Edwards, J. E., et al. Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen. FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).
- Rastogi, G., et al. A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments. J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).
- Baker, G. C., et al. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).
- Links, M. G., et al. The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data. PLoS ONE. 7, e49755 (2012).
- Vos, M., et al. Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity. PLoS ONE. 7, e30600 (2012).
