Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Nästa generations sekvensering av 16S ribosom RNA Gene amplicons

Published: August 29, 2014 doi: 10.3791/51709

Abstract

En av de stora frågorna i mikrobiell ekologi är "vem är det?" Denna fråga kan besvaras med hjälp av olika verktyg, men en av de långvariga guldstandarder är att sekvensera 16S ribosom RNA (rRNA) gen amplikoner genereras av domännivå PCR reaktioner amplifierar från genomiskt DNA. Traditionellt Detta utfördes genom kloning och Sanger (kapillärelektrofores) sekvensering av PCR-amplikoner. Tillkomsten av nästa generations sekvensering har oerhört förenklat och ökat sekvensedjup för 16S rRNA genen sekvensering. Införandet av stationär sequencers tillåter nu små laboratorier för att utföra sina 16S rRNA sekvense internt inom några dagar. Här är ett tillvägagångssätt för 16S rRNA genen amplikon sekvense med hjälp av en bänk nästa generations sekvense detalj. Miljö DNA först med PCR med användning av primers som innehåller sekvense adaptrar och streckkoder. De är sedan kopplade till sfäriska partiklar via emulsion PCR. Partiklarna är loaded på en engångs chip och chip är införd i sekvenseringsmaskinen efter vilket sekvensbestämning utförs. Sekvenserna hämtas i fastq format, filtrerades och de streckkoder används för att fastställa provets medlemskap i läsningar. Den filtrerade och arkiveras läser analyseras sedan vidare med hjälp av offentligt tillgängliga verktyg. Ett exempel analys där läser klassificerades med en taxonomi undersökningsalgoritm inom programpaket Mothur ges. Metoden beskrivs här är enkel, billig och enkel och bör hjälpa mindre labb för att dra nytta av den pågående iska revolutionen.

Introduction

Metagenomic sekvense är en mycket kraftfull teknik eftersom den riktar helheten av den genetiska information som finns i ett miljöprov. Det finns olika varianter av metagenomic sekvense, inklusive hagelgevär sekvensering, stor-insticksbibliotek och amplicon sekvensering. Amplicon sekvense erbjuder fördelen av att vara relativt billig, snabb och kunna producera läser från en enda genomisk region som kan generellt inriktade. Dessutom är dataanalys arbetsflöde för amplikon sekvense oftast standardiserade. Men eftersom det är baserat på PCR, har det alla fördomar som rör ofullständiga specificitet, ofullständig täckning och primer förspänner 1,2, vilket gör denna metod semikvantitativ i bästa fall. Flera genomiska regioner kan riktas till amplikon sekvense inklusive funktionella gener, men de mest populära alternativen är att använda markörgener såsom 16S rRNA-genen för att skapa en gemenskap profil. Traditionellt 16S rRNA-genen amplikon sequencing utfördes med hjälp av arbetsintensiva tekniker som ingår kloning i E. coli, koloniplockning och plasmid extraktion följt av Sanger-sekvensering på de isolerade plasmider, och därmed de flesta studier analyserade färre än 100 kloner per prov. Nästa generations sekvense tog två viktiga framsteg: massiv parallel av sekvenseringsreaktioner och, viktigast av allt, klon separation av mallar utan att behöva sätta in genfragment i en värd. Detta har förenklat oerhört sekvensering av 16S rRNA genen amplikoner, som nu är tillbaka som en rutinmässig funktion i många miljö mikrobiologi studier, vilket resulterar i en "renässans" för 16S rRNA-genen amplikon sekvense 3.

Sedan tillkomsten av Roche 454 sekvense 2005 4, har flera andra nästa generations sekvenseringsteknologier dykt upp på marknaden (t.ex. Illumina, Solid, PacBio). På senare tid, införandet av bänk-topp sekvensrs kommer till små labb sekvensekapaciteten gång exklusivt till stora sekvensecentra. Fem stationär maskiner är för närvarande tillgängliga: den 454 GS Junior, Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) och Proton, och Illumina MiSeq och NextSeq 500 Även om alla dessa sequencers erbjuder mindre läsningar per körning och färre baser per dollar än de flesta heltids skala sequencers, de är mer flexibla, snabbare, och deras låga anskaffningskostnader och köra har råd med små akademiska laboratorier. Fasta sequencers är särskilt väl lämpade för amplikon, liten arvsmassa och låg komplexitet metagenome sekvensemiljö mikrobiologi studier, eftersom denna typ av studier i allmänhet inte kräver en extrem djup av sekvensering. Till exempel är det allmänt accepterat att för 16S rRNA genen sekvense studerar antalet läsningar per prov inte är avgörande, eftersom ~ 1.000 läsningar kan generera samma mönster som flera miljoner läser datamängder 5. Med detta sagt, bänk nästa gene n sequencers fortfarande genererar stora mängder sekvensdata, med maximal avkastning på ~ 35 Mbp (454 GS Junior), ~ 2 GBP (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (Ion Torrent Proton), ~ 10 GBP (Illumina MiSeq) och ~ 100 GBP (Illumina Nästa Seq 500), vilket är mer än tillräckligt för de flesta miljö mikrobiologi studier.

Nästa generations sekvensering av 16S rRNA-amplikoner med användning av stationär sequencers har nyligen tillämpats på en mängd olika miljöer. Till exempel har Ion Torrent PGM använts för gemenskap analyser av urangruvavfall som hade särskilt högt pH och låg permeabilitet 6, för recirkulerande vattenbrukssystem 7, av kolväte-förorenad arktiska jordar 8,9 av oljesand gruv drabbade sediment och biofilmer från Athabasca River 10,11, i rizosfären av pilträd planteras i förorenad mark 12, de mänskliga och djurkroppar 13-16 och rötkammare 17.

jove_content "> I detta bidrag vi detalj vår inställning att sekvensera 16S rRNA genen amplikoner internt med hjälp av en bänk nästa generations sekvense (Ion Torrent PGM). Efter DNA-extraktion, 16S rRNA gener förstärks med hjälp av bakteriella primers domännivå som innehåller sekvense adaptrar och unika, provspecifika sekvenser (streckkoder). amplikonema renas, kvantifieras och slogs samman till ett ekvimolärt förhållande. De poolade proverna sedan klonalt förstärks i en emulsion PCR och sekvens. resulterar sekvenser analyseras med allmänt tillgängliga bioinformatiska verktyg ( t.ex. Mothur).

Protocol

1 16S rRNA Gene Amplicon Library Förberedelse av Fusion Method

  1. Tina primers (Forward, F343-IONA-MIDXX: 5'CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 ', omvänd, R533-IonP1: 5'CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG PÅ EN TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 "djärva: Ion Torrent specifika adaptrar, kursiv stil: sekvense nyckel för att kalibrera signalintensitet i början av sekvense run vanlig font: mallspecifika primers; X ... X: 10 bp streckkod, se tabell 1 för vissa streckkodssekvenser), 2x HotStartTaq Plus huvudblandning och proverna. Blanda väl före användning, med undantag av befälhavaren mix som ska blandas försiktigt.
  2. Bered en PCR-blandning (20 | il reaktioner) med 0,5 | iM av den omvända primern, 0,4 mg / ml av bovint serumalbumin (BSA) och 1x HotStartTaq Plus mastermixen. Lägg 18,5 l av Master Mix till each PCR-rör.
  3. Lägg till en framåtriktad primer (0,5 pl vid 20 mM) med en annan streckkod för varje prov som skall sekvenseras tillsammans. Tillsätt 1 l av provet (1-10 ng / | il) till PCR-rör.
  4. Placera rören i en PCR-maskin och kör följande program: initial denaturering vid 95 ° C under 5 minuter; 25 cykler av 95 ° C under 30 sek, 55 ° C under 30 sek och 72 ° C under 45 sek; slutlig förlängning vid 72 ° C under 10 min. PCR-produkter kan hållas vid 4 ° CO / N eller frystes tills den användes.

2. Amplicon Rening, Kvantifiering och Pooling

  1. Bered en 2% agarosgel med användning av de största kammar tillgängliga. Lägg 5 | il 6x gelpåföringsfärgämne till reaktionen och belastning på gelén, som separerar varje prov genom en tom brunn. Kör gelen vid 70 V under 50 min.
  2. Ta en bild av gelen och skär banden (förväntad storlek ca 250 bp: 190 bp produkt plus 63 adaptrar bp och streckkoder) med hjälp av en ren skalpell.
  3. t.ex. Qiaquick gelextraheringskit).
  4. Kvantifiera varje PCR-produkt med PicoGreen och göra utspädningar för att få en stamlösning på 5 x 10 9 molekyler / l (ca 1 ng / l). Om vissa prover visar lägre förstärkning, justera späd till en lägre koncentration, med tanke på att den lägsta koncentrationen som lämpar sig för efterföljande förfaranden är 1,57 x 10 7 molekyler / l (26 pm).
  5. Pool 10 l av varje utspädd PCR-produkt för att få en ekvimolär pool av prover. Förbered en separat pool för var och en av de planerade sekvense körningen. De sammanslagna PCR-produkterna kan förvaras i frys tills de användes.

3. Emulsion PCR och sekvensering

  1. Utför emulsions PCR:
    1. Späd de sammanslagna PCR-produkterna till 26 pM i en volym av 25 | il. Tina reagenser från en Ion PGM-mall kit.
    2. Förbered emulsionen PCR-blandning (reagenser som ingår i satsen) i en PCR huva och lägga de sammanslagna PCR-produkter och sfärpartiklar (medföljer) på bänken. Blanda väl och lägg blandningen i en filterpatron och försiktigt topp med emulsionsolja (medföljer).
    3. Sakta vända filterpatronen och belastning på automatiserade emulsionen PCR apparat (t.ex. Ion One Touch 2 instrument). Välj rätt program och starta proceduren.
  2. Efter den automatiserade emulsionen PCR har avslutat, avlägsna supernatanten från uppsamlingsrören och hämta sfärpartiklarna i botten av rören. Resuspendera sfärer i 100 ul tvättlösning (finns i kitet) och ta en 2,0 l alikvot för biblioteks kvantifiering.
  3. Utför biblioteks kvantifiering.
    1. Blanda 100 pl av SSPE-buffert (150 mM NaCl, 10 mM NaPO 4, 1 mM Na 2 EDTA) med 2 | il av Adapter B'-FAM (5'-FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 ') prob och 2 | il av Adapter A-Cy5 (5'-Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3')-sond. Lägg 52 pl av denna blandning till 2,0 pl alikvot som tagits i steg 3.2 och tillsätt 2 l av tvättlösning (från mallen satsen) till de återstående 52 pl som en tomt för kvantifiering.
    2. Inkubera vid 95 ° C under 2 minuter, därefter vid 37 ° C under 2 min. Överför blandningarna i 1,5 ml rör.
    3. Lägg 1,0 ml av TEX-buffert (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,01% Triton X-100, pH 8,0), blanda och centrifugera vid 15.500 xg under 3 min vid RT. Avlägsna supernatanten och lämna 20 | il i varje rör. Upprepa detta tvättproceduren två gånger.
    4. Lägg 180 l av TEX buffert, resuspendera pelleterade partiklar och överför till 500 ^ qubit rör.
    5. Mät fluorescens för FAM och Cy5 med hjälp av en Qubit apparat och beräkna förhållandet mellan positiva sfärer använder kalkylatorn som finns på Ion gemenskaps hemsida.
  4. Berika resten av sfär partiklar för positiva sfärer (som innehåller förstärkta DNA) med hjälp av ett automatiserat anrikningssystem (t.ex., Ion One Touch Enrichment System).
    1. Pipet reagens i lämpliga brunnar i den medföljande 8-bra band: Well 1: sphere partiklar från steg 3,2; Tja 2: förtvättad MyOne Streptavidin C1 pärlor (13 il); Jo 3, 4 och 5: tvättlösning (ges i mallen satsen); Väl 6: tom; Well 7: smält-off-lösning (125 mM NaOH, 0,1% Tween 20); Well 8: tomt.
    2. Installera ett tips på pipetterings arm och ett 0,2 ml rör för provtagning. Starta instrumentet. I slutet av berikning, tillsätt 10 pl neutraliserande lösning (medföljer). De anrikade pärlor kan hållas en 4 ° C i upp till 15 dagar.
  5. Initiera sekvense instrumentet:
    1. Anslut till sekvenseringsinstrument och förbereda en sekvense kör plan specificera detaljerna i sekvense körningen.
    2. Install tvättlösningen # 2 (tillhandahålls i Ion PGM sekvense kit), tvättlösningen # 1 (350 pl 100 mM NaOH) och buffertlösningen auto pH (medföljer).
    3. Starta återställningsproceduren och när du lägger till dATP, dGTP dCTP och dTTP nukleotider (medföljer) i sina respektive 50 ml rör. Skruva rören på sekvense maskinen och fortsätter återställningsproceduren. När initieringen är klar, starta proceduren tillfälle omedelbart.
  6. Förbered prover för sekvensering och ladda chip:
    1. Samla de anrikade sfärerna från steg 3,4 vid botten av röret genom centrifugering vid 15.500 xg under 1,5 min. Avlägsna supernatanten lämnar exakt 3 pl.
    2. Lägg 3 pl av sekvenseringsprimer (tillgänglig i sekvenseringssatsen), blanda omsorgsfullt genom pipettering upp och ned för att återsuspendera partiklarna. Inkubera vid 95 ° C under 2 minuter, därefter vid 37 ° C under 2 min.
    3. Tillsätt 1 l av polymeras (medföljer), blanda väl och incubåt vid RT i 5 min. Fortsätt att fylla på den enzym sfär blandningen på sekvense chipet inom 30 min.
    4. Under inkubation, ladda sekvense chip på sequencern och utför ett chip kvalitetskontroll. Avlägsna vätskan från chipet genom centrifugering och ladda provet i chippet genom att långsamt pipeting ner enzym sfären mix (7 l) och undvika att införa bubblor i chippet.
    5. Centrifugera chip tre gånger under 1 minut i en mikrocentrifug. Ändra orienteringen av chipet vid varje centrifugering och blanda genom att pipettera upp och ner i mellan varje körning.
    6. Fyll på chip i instrumentet och starta körningen.

4 Grundläggande Sequence Data Analysis

  1. Anslut till sekvensedataserver och hämta fastq filen. Skapa en tabbavgränsad "oligos" fil som innehåller primer och streckkodsinformation (se exempel i tabell 1). Hämta de Greengenes referensfiler från MotHur webbplats ( http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ).
  2. Starta Mothur och utför analyser:
    1. Konvertera fastq filen till en FASTA och en kvalitet-fil med följande kommando: fastq.info (fastq = test.fastq)
    2. Bestäm grupptillhörighet för varje sekvens och trimma sekvenserna med följande kommando: trim.seqs (FASTA = test.fasta, oligor = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minlength = 150, keepforward = T)
    3. De olika alternativen kan ändras i enlighet med den önskade stringensen
    4. Klassificera sekvenserna i greengenes taxonomi med följande kommando: classify.seqs (FASTA = test.trim.fasta, metod = wang, grupp = test.groups, mall = gg_99_otus.fasta, taxonomi = gg_99_otus.tax, cutoff = 50)

Representative Results

Efter rening på gel, med 25 cykler av PCR-amplifiering, amplifieringsprodukterna är vanligtvis vid en koncentration av 0,2 till 10,0 ng i 50 pl vatten. Detta kan variera i stor utsträckning beroende på utgångs DNA-koncentrationen, typen av provet och reningskit användas. Det rekommenderas att hålla antalet PCR-cykler till lägsta möjliga för att undvika chimär bildning och minska förstärknings fördomar, med tanke på att alla prover bör förstärkas med hjälp av samma antal cykler. För att minimera antalet polyklonala läsningar och tomma områden och maximera antalet läsningar bör Qubit förhållandet vara mellan 0,1 och 0,3 och FAM fluorescens bör vara över 200 Använda ett 314 chip på en Ion Torrent PGM, är den genomsnittliga produktionen på 0,3-0,5 M bra kvalitet läser efter filtrering av resultaten i Mothur. Tabell 2 visar en typisk fördelning av antalet läsningar efter varje steg i förfarandet för en körning som innehåller 36 multiplex miljömentala prov amplifieras med primers som riktar sig V3-4 region av 16S och analyseras med hjälp Mothur. I Mothur, det trim.seqs förfarandet generera en "* .trim.fasta" fil som innehåller de sekvenser som passerade kvalitets filter och en "* .scrap.fasta" som innehåller de sekvenser som inte klarade kvalitetsfilter tillsammans med anledningen för avstötning i sekvensen huvudet. Då levereras med streckkoder i "oligos" fil, kommer detta kommando även generera en "* .groups" fil som innehåller grupptillhörighet i varje sekvens baserad på streckkodssekvensen. Förfarandet classify.seqs genererar en ".tax.summary" som kan öppnas i Excel. Den här filen innehåller sammanfattningen av den taxonomiska tillhörighet (i rader) för varje prov (i kolumner). Denna fil kan användas för efterföljande statistiska analyser och att visualisera samhällets sammansättning på olika taxonomiska nivåer. Den ".taxonomy" filen innehåller detaljerade taxonomiskatillhörighet för varje sekvens. Den genomsnittliga samhälls komposition vid fylum / klassnivå inom alla 36 prover visas i figur 1.

Figur 1
Figur 1 Genomsnittlig samhällets sammansättning på fylum / klassnivå inom alla prover.

streckkod
framåt TACGGRAGGCAGCAG
streckkod CTAAGGTAAC Sample01
streckkod TAAGGAGAAC Sample02
AAGAGGATTC Sample03
streckkod TACCAAGATC Sample04
streckkod CAGAAGGAAC Sample05
streckkod CTGCAAGTTC Sample06
streckkod TTCGTGATTC Sample07
streckkod TTCCGATAAC Sample08
streckkod TGAGCGGAAC Sample09
streckkod CTGACCGAAC Sample10

Tabell 1 Exempel "oligos" fil för användning i Mothur.

# Av läsningar % Av tidigare steg Avg. per prov
Antal brunnar 1.262.519 - 35.070
Brunnar med pärlor 1.114.108 88,20% 30.947
Pärlor med mallar 1.112.746 99,90% 30.910
Monoklonala pärlor 826.805 74,30% 22.967
Bra kvalitet läser (Utgång från sequencer) 782.204 94,60% 21.728
Pass Mothur filter (min. Avg. Kvalitetsresultat på 20 över ett 50 bp fönster, min. Längd 150bp) 372.168 47,60% 10.338
Classified på stammen nivån i GreenGenes (50% konfidensintervall tröskel) 342.171 91.90% 9505
Classified på familjenivå i GreenGenes (50% konfidensintervall tröskel) 316.512 92,50% 8792
Classified på släktet nivån i GreenGenes (50% konfidensintervall tröskel) 289.899 91,60% 8053

Tabell 2 Antal läsningar framställs av en typisk körning för 36 miljöprover multiplexeras på en Ion Torrent 314 chip.

Discussion

Den metod som presenteras här är enkel och billig, och bör göra det möjligt många laboratorier för att komma åt kraften i metagenomic sekvensering. Även om det varierar beroende på sekvense plattform som används, när biblioteken är konstruerade väldigt lite praktisk tid krävs, med de flesta av den process som automatiseras. För sekvense plattform som används här (Ion Torrent PGM), kan hela förfarandet utföras inom två dagars arbete. I skrivande stund (September 2013), reagens kostnaderna för exemplet beskrivs ovan var följande: PCR-förstärkning av 36 prover: $ 25, gelrening och PicoGreen DNA kvantifiering av 36 prover: $ 125, emulsion PCR för en sammanslaget amplikon prov : $ 150 och sekvense reagenser: $ 250, för totalt $ 550 eller $ 15 per prov eller $ 0,0015 per kvalitets filtrerad läsning. Detta pris inkluderar inte instrument servicekontrakt, instrument avskrivningar, tekniker lön och laboratorieutrymme.

tält "> En av de viktigaste stegen är att samla alla produkterna i ett ekvimolärt förhållande, för att hämta liknande antal läsningar för varje prov. PicoGreen kvantifiering användes här, men andra metoder kan vara lämpliga, men mindre exakt (t.ex. UV-kvantifiering, gel-baserad kvantifiering). Även genom att göra den mest exakta kvantifiering och poolning, det finns en viss variation i antalet läsningar per prov, och i den typiska körningen beskrivs i tabell 2 varierar den från 4,380 till 32,750 läser, med ett genomsnitt på 10.338 läsningar. Om bearbeta stort antal prov (mer än 40 till 50), kan en enda kolonn gelrening ersättas av gelrening i plåt eller rening med användning av pärlor med en stringent storlek cutoff (t.ex. AMPure pärlor) .

Hittills är det mest använda nästa generations sekvenseringsteknologi för 16S rRNA genen 454. Ion Torrent sekvenseringsteknologi som används i detta protokoll är begreppsmässigt mycket liktill 454 och båda teknikerna är benägna att samma typ av sekvensfel. Inte överraskande visade det sig att Ion Torrent sekvense ledde sekvense resultaten mycket liknar 454 sekvense 10. Nyligen har många forskare undersökt användningen av Illumina teknologi för 16S rRNA-genen amplikon sekvense 18,19. I vilket fall skulle det vara lätt att anpassa det nuvarande protokollet för andra stationär sequencers såsom Illumina MiSeq eller 454 GS Junior genom att ändra fusions primersekvensema att matcha adaptrar och streckkoder som behövs för dessa sekvenseringsteknologier, som i metoden som nyligen beskrivna för Illumina MiSeq 19. Alternativt kunde forskarna följa steg 1 och 2 i protokollet beskrivs här och skicka de poolade amplikonema till en sekvense centrum där emulsionen PCR och sekvensering skulle utföras.

16S rRNA-genen läser trimmades och klassificerats med hjälp Mothur, men många andra analyser kan utföras på16S rRNA-genen amplikoner. Till exempel kan beta mångfald utvärderas genom beräkning av de Unifrac avstånden mellan varje provpar hjälp av proceduren beskriven vid http://unifrac.colorado.edu/ 20. Alpha mångfald index och antal operativa taxonomiska enheter av varje prov kan beräknas med hjälp av verktyg inom QIIME som AmpliconNoise 21 eller genom att använda det förfarande som beskrivs av Huse et al. 22 och finns inom Mothur.

De primers som användes här förstärks de variabla regionerna 3 och 4 från 16S rRNA-genen, men många andra regioner skulle kunna utformas. I föreliggande studie har 16S rRNA-gener amplifierades från växtmaterial och valet av primer gjordes för att undvika förstärkning av kloroplast 16S rRNA-genen 23,24. Det finns ett brett utbud av andra primers som finns som varierar i tid av produktlängden, taxonomisk makt och användbarhet 25,26. Men i samtliga fall 200-400 bp läsningar av 16S rRNA genen inte tillförlitligt klassificeras på artnivå och analyser är begränsade till släktet och högre taxonomiska nivåer. Andra gener kan vara mer lämpligt om det behövs informations artnivå, liksom cpn60 och rpoB gener 27,28. Framtida drastiska droppar i kostnaden för sekvensering och ökar i kraft av analytiska verktyg kan göra det möjligt att byta ut 16S rRNA genen sekvensering genom kul- metagenomik, men tills dess 16S rRNA genen sekvensering är fortfarande den gyllene standarden för miljömikrobiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ion 314 Chip Kit v2 Life Technologies 4482261
Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 Life Technologies 4482006
Ion PGM Template OT2 200 Kit Life Technologies 4480974
HotStarTaq Plus Master Mix Kit Qiagen 203646
Primers and probes IDT NA
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
BSA 20 mg/ml Roche 10,711,454,001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sipos, R., et al. Addressing PCR biases in environmental microbiology studies. Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).
  2. Schloss, P. D., et al. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies. PLoS ONE. 6, e27310 (2011).
  3. Tringe, S. G., Hugenholtz, P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).
  4. Margulies, M., et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. 437, 376-380 (2005).
  5. Kuczynski, J., et al. Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns. Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).
  6. Bondici, V. F., et al. Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects. J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).
  7. Auffret, M., et al. Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems. FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).
  8. Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil. FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).
  9. Bell, T. H., et al. Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance. ISME J. 7, 1200-1210 (2013).
  10. Yergeau, E., et al. Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).
  11. Yergeau, E., et al. Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations. Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).
  12. Yergeau, E., et al. Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination. ISME J. 8, 344-358 (2013).
  13. Deagle, B. E., et al. Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count. Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).
  14. Milani, C., et al. Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol. PLoS ONE. 8, e68739 (2013).
  15. Jünemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing. PLoS ONE. 7, e41606 (2012).
  16. Petrof, E., et al. Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut. Microbiome. 1, 3 (2013).
  17. Whiteley, A. S., et al. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform. J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).
  18. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6, 1621-1624 (2012).
  19. Kozich, J. J., et al. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).
  20. Hamady, M., et al. Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data. ISME J. 4, 17-27 (2010).
  21. Quince, C., et al. Removing noise from pyrosequenced amplicons. BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).
  22. Huse, S. M., et al. Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering. Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).
  23. Edwards, J. E., et al. Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen. FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).
  24. Rastogi, G., et al. A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments. J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).
  25. Baker, G. C., et al. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).
  26. Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).
  27. Links, M. G., et al. The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data. PLoS ONE. 7, e49755 (2012).
  28. Vos, M., et al. Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity. PLoS ONE. 7, e30600 (2012).

Tags

Molecular Biology metagenomik bakterier 16S ribosom RNA gen Amplicon sekvense Nästa generations sekvense stationär sequencers
Nästa generations sekvensering av 16S ribosom RNA Gene amplicons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanschagrin, S., Yergeau, E.More

Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons. J. Vis. Exp. (90), e51709, doi:10.3791/51709 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter