Abstract
Een van de belangrijkste vragen in de microbiële ecologie is "wie is daar?" Deze vraag kan worden beantwoord met behulp van verschillende instrumenten, maar een van de langdurige gouden standaard is om 16S ribosomaal RNA (rRNA) gen ampliconen gegenereerd door domain-niveau PCR sequencen reacties amplificeren van genomisch DNA. Traditioneel werd dit uitgevoerd door klonen en Sanger (capillaire elektroforese) sequencing van PCR amplicons. De komst van de next-generation sequencing is enorm vereenvoudigd en vergroot de sequencing diepte voor 16S rRNA-gen sequencing. De introductie van tafelmodel sequencers maakt het nu kleine labs hun 16S rRNA-sequencing in-house uit te voeren in een kwestie van dagen. Hier is een aanpak voor het 16S rRNA-gen amplicon sequencing met behulp van een tafelmodel volgende generatie sequencer gedetailleerd. De milieu DNA wordt eerst geamplificeerd met PCR met gebruik van primers die sequencing adapters en barcodes bevatten. Zij worden dan gekoppeld met bolvormige deeltjes via emulsie PCR. De deeltjes zijn loaded op een wegwerp chip en de chip is in de sequentiemachine waarna de sequencing wordt uitgevoerd geplaatst. De sequenties worden opgehaald FASTQ formaat, gefiltreerd en barcodes gebruikt om het monster lidmaatschap bepalen van de leest. De gefilterde en weggegooid leest worden vervolgens verder geanalyseerd met behulp van publiek beschikbare gereedschappen. Een voorbeeld analyse waar het leest werden ingedeeld met een-taxonomie vinden algoritme binnen het softwarepakket Mothur wordt gegeven. De methode die hier wordt beschreven is eenvoudig, goedkoop en eenvoudig en zou moeten helpen kleinere labo's om te profiteren van de voortgaande genomische revolutie.
Introduction
Metagenomic sequencing is een zeer krachtige technologie, en richt het geheel van de genetische informatie in een milieumonster. Er zijn verschillende smaken van metagenomic sequencing, waaronder shotgun sequencing, grote inserts bibliotheken en amplicon sequencing. Amplicon sequencing biedt het voordeel dat relatief goedkoop, snel en kan produceren leest uit een genomisch gebied dat algemeen kan worden uitgelijnd. Bovendien wordt de gegevensanalyse workflow amplicon sequencing meestal gestandaardiseerd. Echter, omdat deze is gebaseerd op PCR heeft de vooroordelen betrekking op de onvolledige specificiteit onvolledig zijn en primer spant 1,2, die het de semi-kwantitatieve hoogstens maakt. Verschillende genomische gebieden worden gericht voor amplicon sequencing waaronder functionele genen, maar de meest populaire opties zijn merkergenen zoals het 16S rRNA gen gebruiken om een community profiel genereren. Traditioneel, 16S rRNA-gen amplicon Sequencing werd uitgevoerd middels arbeidsintensieve technieken die klonering in E. coli, kolonieselectie en plasmide-extractie gevolgd door Sanger sequentiebepaling van de geïsoleerde plasmiden, en dus de meeste studies geanalyseerd minder dan 100 klonen per monster. Next-generation sequencing bracht twee belangrijke ontwikkelingen: massieve parallellisatie van de sequencing reacties en, belangrijker nog, klonale scheiding van templates, zonder de noodzaak om de gen fragmenten in te voegen in een gastheer. Dit heeft enorm vereenvoudigd de volgorde van 16S rRNA gen amplicons, die nu terug als routine kenmerk van veel Environmental Microbiology studies, resulterend in een "Renaissance" voor 16S rRNA gen amplicon sequencing 3.
Sinds de komst van Roche 454 sequencing in 2005 4, zijn er verschillende andere next-generation sequencing technologieën op de markt verschenen (bijvoorbeeld Illumina, Solid, PacBio). Meer recent, de invoering van de bench-top sequencers gebracht om kleine labs de sequencing capaciteit ooit exclusief voor grote sequencing centers. Vijf tafelmodel machines zijn momenteel beschikbaar: de 454 GS Junior, de Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) en Proton, en de Illumina MiSeq en NextSeq 500 Terwijl al deze sequencers bieden minder leest per run en minder bases per dollar dan de meeste full- schaal sequencers, zijn ze meer flexibel, snel, en hun lage aanschaf en run kosten maakt ze betaalbaar voor kleine academische laboratoria. Tafelmodel sequencers zijn bijzonder goed geschikt voor amplicon, klein genoom en lage complexiteit metagenoom sequencing in ecologische microbiologie studies, omdat deze vorm van studies over het algemeen niet een extreme diepte van sequencing vereisen. Bijvoorbeeld wordt algemeen aanvaard dat voor 16S rRNA gensequentie bestudeert het aantal leest per monster is niet cruciaal, zo ~ 1000 leest kan dezelfde patronen genereren multi-miljoen leest datasets 5. Dat gezegd hebbende, tafelmodel next-generatio n sequencers nog steeds het genereren van grote hoeveelheden sequence data, met een maximale opbrengst van ~ 35 Mbp (454 GS Junior), ~ 2 GBP (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 GBP (Ion Torrent Proton), ~ 10 GBP (Illumina MiSeq) en ~ 100 GBP (Illumina Volgende Seq 500), wat meer dan genoeg voor de meeste natuurlijke microbiologie studies.
Next-generation sequencing van 16S rRNA amplicons gebruikt benchtop sequencers is onlangs toegepast op een grote verscheidenheid van omgevingen. Zo heeft de Ion Torrent PGM is gebruikt voor de gemeenschap analyses van uranium mijnafval dat bijzonder hoge pH en lage permeabiliteit 6 had, gerecirculeerd aquacultuursystemen 7, van koolwaterstof-verontreinigde bodems Arctic 8,9, van oliezandoperatie beïnvloed sedimenten en biofilms van de Athabasca River 10,11, van de rhizosfeer van wilgen geplant in vervuilde bodems 12, van het menselijk en dierlijk lichaam 13-16 en van anaërobe vergisters 17.
jove_content "> In deze bijdrage hebben we detail onze benadering van 16S rRNA-gen ampliconen in-house te sequencen met behulp van een tafelmodel volgende generatie sequencer (de Ion Torrent PGM). Na DNA-extractie, 16S rRNA genen worden versterkt met behulp van domain-niveau bacteriële primers die bevatten sequencing adapters en unieke, sample-specifieke sequenties (barcodes). worden de amplicons gezuiverd, gekwantificeerd en samengevoegd in een equimolaire verhouding. De gepoolde monsters worden vervolgens klonaal versterkt in een emulsie PCR en gesequenced. resulteren sequenties geanalyseerd met behulp van publiek beschikbare bioinformatica ( bv Mothur).Protocol
1 16S rRNA Gene Amplicon Bibliotheek Voorbereiding door de Fusion Methode
- Ontdooi de primers (Forward, F343-Iona-MIDXX: 5'CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 '; achteruit, R533-IonP1: 5'-CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT Een TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 '; bold: Ion Torrent specifieke adapters; cursief: sequencing sleutel voor het kalibreren van het signaal intensiteit aan het begin van de sequencing run; normaal lettertype: sjabloon-specifieke primers; X ... X: 10 bp barcode, zie tabel 1 voor een aantal barcode sequenties), de 2x HotStartTaq Plus master mix en de monsters. Meng grondig voor gebruik, met uitzondering van de master mix die voorzichtig moeten worden gemengd.
- Bereid een PCR-mix (20 ul reacties) met 0,5 uM van de reverse primer, 0,4 mg / ml Bovine Serum Albumine (BSA) en 1x HotStartTaq Plus Master mix. Voeg 18,5 ul van de master mix aan each PCR-buis.
- Voeg een voorwaartse primer (0,5 gl 20 mM) met een verschillende barcode voor elk van de monsters die samen worden gesequenced. Voeg 1 pl monster (1-10 ng / ul) aan de PCR buis.
- Plaats de buizen in een PCR-machine en start het volgende programma: de initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 5 minuten; 25 cycli van 95 ° C gedurende 30 seconden, 55 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 45 seconden; laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten. PCR producten kunnen bij 4 ° CO bewaard / N of ingevroren tot gebruik.
2 Amplicon zuivering, de kwantificering en pooling
- Bereid een 2% agarose gel met het grootste kammen beschikbaar. Voeg 5 ui 6x gel laadkleurstof de reactie en belasting van de gel, elk monster scheiden door een lege goed. Laat de gel bij 70 V gedurende 50 minuten.
- Maak een foto van de gel en snijd de banden (verwachte grootte van ongeveer 250 bp 190 bp product plus 63 bp adapters en barcodes) en een schone scalpel.
- Kwantificeren elk PCR product met PicoGreen en maak verdunningen een voorraadoplossing te verkrijgen bij 5 x 10 9 moleculen / pl (ongeveer 1 ng / ul). Als sommige monsters vertonen lagere versterking, passen de verdunningen aan een lagere concentratie, in gedachten houden dat de laagste geschikt voor volgende procedures concentratie is 1,57 x 10 7 moleculen / ul (26 uur).
- Pool 10 pl van elk verdund PCR-product aan een equimolaire pool van monsters. Bereid een apart zwembad voor elk van de geplande sequencing run. De samengevoegde PCR producten in de vriezer bewaard tot gebruik.
3 Emulsie PCR en sequencing
- Voeren emulsie PCR:
- Verdun de samengevoegde PCR producten tot 26 pM in een volume van 25 pl. Ontdooi reagentia uit een Ion PGM template kit.
- Bereid de emulsie PCR-mix (reagentia die in de kit) in een PCR-kap en de gepoolde PCR-producten en de sfeer deeltjes (meegeleverd) toe te voegen op de bank. Meng goed en breng het mengsel in een filterpatroon en zorgvuldig top met emulsie olie (meegeleverd).
- Langzaam keren de filter cartridge en de belasting op de geautomatiseerde emulsie PCR-apparaat (bijvoorbeeld Ion One Touch 2 instrument). Selecteer het juiste programma en start de procedure.
- Na de geautomatiseerde emulsie PCR is voltooid, de bovenstaande vloeistof uit de verzamelbuizen en de bol deeltjes halen onderaan de buizen. Resuspendeer de bollen in 100 pi wasoplossing (verstrekt in de kit) en neem een 2,0 ul aliquot voor bibliotheek kwantificering.
- Voer de bibliotheek kwantificering.
- Meng 100 ul van SSPE buffer (150 mM NaCl, 10 mM NaPO 4, 1 mM Na 2 -EDTA) met 2 pl Adapter B'-Fam (5'-FAM -CTG CTG AGA CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 ') probe en 2 ui Adapter A-Cy5 (5'-Cy5 -CCa TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3') probe. Voeg 52 ul van dit mengsel aan de 2.0 ul aliquot genomen in stap 3.2 en voeg 2 pl wasoplossing (van de template kit) de resterende 52 pl als blanco voor kwantificering.
- Incubeer bij 95 ° C gedurende 2 min, vervolgens bij 37 ° C gedurende 2 minuten. Breng het mengsel in 1,5 ml buizen.
- Voeg 1,0 ml van TEX buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,01% Triton X-100, pH 8,0), meng en centrifugeer bij 15.500 xg gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en laat 20 pl in elke buis. Herhaal deze wasprocedure tweemaal.
- Voeg 180 ul van TEX buffer, resuspendeer de gepelleteerde deeltjes en zetten in 500 pi Qubit buizen.
- Meet de fluorescentie voor FAM en Cy5 met een Qubit apparaat en bereken de verhouding van positieve sferen met behulp van de rekenmachine beschikbaar op de Ion Gemeenschap website.
- Verrijken de rest van de bol deeltjes positieve (bevatten geamplificeerd DNA) een geautomatiseerd verrijking (bv, Ion One Touch Enrichment System).
- Pipet reagentia in de geschikte putjes van de meegeleverde 8-goed strip: Nou 1: bol deeltjes uit stap 3.2; Goed 2: voorgewassen MyOne Streptavidin C1 kralen (13 pl); Goed 3, 4 en 5: wasoplossing (verschaft in de kit sjabloon); Nou 6: leeg; Well 7: smelt-off oplossing (125 mM NaOH, 0,1% Tween 20); Nou 8: leeg.
- Installeer een tip over het pipetteren arm en een 0,2 ml tube voor monstername. Start het instrument. Aan het einde van de verrijking, voeg 10 ul van neutraliserende oplossing (ontvangen). De verrijkte kralen kunnen een 4 ° C bewaard gedurende 15 dagen.
- Initialiseren van de sequencing-instrument:
- Maak verbinding met het sequencing instrument en bereiden een sequencing run plan, waarin de details van de sequencing run.
- Install de wasoplossing # 2 (verschaft in de Ion PGM sequencing kit), de wasoplossing # 1 (350 pi 100 mM NaOH) en de automatische pH bufferoplossing (ontvangen).
- Start de initialisatie procedure en wanneer gevraagd voeg de dATP, dGTP dCTP en dTTP nucleotiden (meegeleverd) in hun respectievelijke 50 ml buizen. Schroef de buizen op de sequencing machine en de initialisatie procedure voortzetten. Wanneer de initialisatie is voltooid, onmiddellijk beginnen met de run procedure.
- Bereiden monsters voor sequencing en laadt de chip:
- Verzamel de verrijkte bollen van stap 3.4 op de bodem van de buis door centrifugeren bij 15.500 xg gedurende 1,5 minuten. Verwijder het supernatant laat precies 3 ui.
- Voeg 3 pi van sequencing primer (meegeleverd in de sequencing kit), meng goed door en neer te pipetteren om de deeltjes te mengen. Incubeer bij 95 ° C gedurende 2 min, vervolgens bij 37 ° C gedurende 2 minuten.
- Voeg 1 ul van polymerase (meegeleverd), meng goed en incubaten bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Ga verder met het enzym-sfeer mengsel op het sequencing chip binnen 30 minuten te laden.
- Tijdens de incubatie, laadt de sequencing chip op de sequencer en het uitvoeren van een chip kwaliteitscontrole. Verwijder de vloeistof uit de chip door centrifugatie en plaats het monster in de chip door langzaam pipetteren door het enzym bol mix (7 ui) en het vermijden van de introductie van luchtbellen in de chip.
- Centrifugeer de chip drie keer gedurende 1 minuut in een microcentrifuge. Verander de richting van de chip op elke centrifugering en meng door en neer te pipetteren tussen elke run.
- Laad de chip in het toestel en start de run.
4 Basic Sequence Data Analysis
- Verbinding maken met de sequencing data server en download het FASTQ bestand. Maak een door tabs gescheiden "oligo" bestand met de primer en barcode-informatie (zie voorbeeld tabel 1). Download de Greengenes referentiebestanden van de Mothur website ( http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ).
- Lanceren Mothur en analyses uit te voeren:
- Zetten de FASTQ bestand naar een fasta en een kwaliteit-bestand met behulp van de volgende opdracht: fastq.info (FASTQ = test.fastq)
- Bepaal de groep lidmaatschap van elke sequentie en trim de sequenties met behulp van de volgende opdracht: trim.seqs (fasta = test.fasta, oligo = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, MinLengte = 150, keepforward = T)
- De verschillende opties kunnen worden aangepast aan de gewenste stringentie
- Classificeren van de sequenties in de greengenes taxonomie met de volgende opdracht: classify.seqs (fasta = test.trim.fasta, methode = wang, groep = test.groups, template = gg_99_otus.fasta, taxonomie = gg_99_otus.tax, cutoff = 50)
Representative Results
Na zuivering op gel, met 25 cycli van PCR-amplificatie, de amplificatieproducten meestal in een concentratie van 0,2-10,0 ng in 50 pl water. Dit kan sterk variëren afhankelijk van het uitgangsmateriaal DNA-concentratie, het type monster en de zuivering kit gebruikt. Het wordt aanbevolen om het aantal PCR-cycli houden de laagst mogelijk chimera vorming vermijden en amplificatie vooroordelen verminderen, rekening houdend met alle monster wordt geamplificeerd met hetzelfde aantal cycli. Om het aantal polyklonale leest en lege gebieden minimaliseren en het aantal leest, moet qubit verhouding tussen 0,1 en 0,3 en FAM fluorescentie moet boven 200 met een chip 314 op een Ion Torrent PGM, de gemiddelde output ongeveer 0,3-0,5 M goede kwaliteit leest na het filteren van de resultaten in Mothur. Tabel 2 toont een typische verdeling van het aantal leest na elke stap van de procedure voor een run met 36 multiplex environmentale monsters geamplificeerd met primers gericht op de V3-4 gebied van de 16S en geanalyseerd met Mothur. In Mothur, de trim.seqs procedure genereert een "* .trim.fasta" bestand met de sequenties die de kwaliteit filters en een "* .scrap.fasta" dat de sequenties bevat die niet de kwaliteit filters niet doorgegeven hebben, samen met de reden voorbij voor afwijzing in de sequence header. Met de volgende barcodes in de "oligo" bestand, zal deze opdracht ook het genereren van een "* .Groepen" bestand dat de groep het lidmaatschap van elke rij op basis van de barcode sequentie bevat. De classify.seqs procedure genereert een ".tax.summary" dat in Excel kan worden geopend. Dit bestand bevat de samenvatting van de taxonomische aansluiting (in lijnen) voor elk van de monsters (in kolommen). Dit bestand kan worden gebruikt voor downstream statistische analyses en om de gemeenschap samenstelling visualiseren op verschillende taxonomische niveaus. De ".taxonomy" bestand bevat de gedetailleerde taxonomischewat het lidmaatschap voor elke sequentie. De gemiddelde gemeenschapssamenstelling het phylum / klasseniveau voor alle 36 monsters wordt getoond in figuur 1.
Figuur 1 Gemiddelde gemeenschap compositie aan de stam / klasse niveau in alle monsters.
| vooruit | TACGGRAGGCAGCAG | |
| barcode | CTAAGGTAAC | Sample01 |
| barcode | TAAGGAGAAC | Sample02 |
| AAGAGGATTC | Sample03 | |
| barcode | TACCAAGATC | Sample04 |
| barcode | CAGAAGGAAC | Sample05 |
| barcode | CTGCAAGTTC | Sample06 |
| barcode | TTCGTGATTC | Sample07 |
| barcode | TTCCGATAAC | Sample08 |
| barcode | TGAGCGGAAC | Sample09 |
| barcode | CTGACCGAAC | Sample10 |
Tabel 1: Voorbeeld "oligo" bestand voor gebruik in Mothur.
| # Van leest | % Van de vorige stap | Gem. per sample | |
| Aantal putten | 1262519 | - | 35.070 |
| Wells met kralen | 1114108 | 88.20% | 30.947 |
| Kralen met sjablonen | 1112746 | 99.90% | 30.910 |
| Monoklonale kralen | 826805 | 74,30% | 22.967 |
| Goede kwaliteit leest (Uitvoer van de sequencer) | 782204 | 94,60% | 21.728 |
| Pass Mothur filters (min. Gem. Kwaliteit score van 20 over een 50 bp raam, min. Lengte van 150bp) | 372168 | 47.60% | 10.338 |
| Geclassificeerd op het phylum niveau GreenGenes (50% vertrouwen drempel) | 342171 | 91.90% | 9.505 |
| Geclassificeerd op gezinsniveau in GreenGenes (50% vertrouwen drempel) | 316512 | 92.50% | 8.792 |
| Geclassificeerd op het genus-niveau in GreenGenes (50% vertrouwen drempel) | 289899 | 91.60% | 8.053 |
Tabel 2 Aantal leest geproduceerd uit een typische run voor 36 milieu-monsters gemultiplexeerd op een Ion Torrent 314 chip.
Discussion
De hier gepresenteerde methode is eenvoudig en goedkoop, en moet het mogelijk maken vele laboratoria om de kracht van metagenomic sequencing. Hoewel afhankelijk van de sequencing platform gebruikt, zodra de bibliotheken geconstrueerd weinig hands-on tijd nodig, met de meeste werkwijze worden geautomatiseerd. Voor de sequencing platform hier gebruikt (Ion Torrent PGM), kan de volledige procedure worden uitgevoerd binnen de twee dagen van het werk. Op het moment van schrijven (september 2013), het reagens kosten voor het bovenstaande voorbeeld beschreven is als volgt: PCR-amplificatie van 36 monsters: $ 25, gelzuivering en PicoGreen DNA kwantificering van 36 monsters: $ 125, emulsie PCR voor een samengevoegd amplicon sample : $ 150 en sequentiebepalingsreagentia: $ 250, voor een totaal van $ 550 of $ 15 per monster of $ 0,0015 per kwaliteit gefilterd lezen. Deze prijs is instrument servicecontract, afschrijvingen instrument, technicus salaris en laboratoriumruimte gebruik bevatten.
tent "> Een van de belangrijkste stappen is voor de producten bundelen in een equimolaire verhouding, teneinde soortgelijke aantal halen van leest voor elk van de monsters. PicoGreen kwantificering werd hier gebruikt, maar andere methoden kunnen geschikt, maar minder nauwkeurig (bijvoorbeeld UV kwantificering-gel kwantificering). Zelfs doende de kwantificatie en pooling, er enige variabiliteit in het aantal leest per monster en in typische run in tabel 2, het varieert van 4.380 tot 32.750 leest, met een gemiddelde van 10.338 leest. Indien voor groot aantal monsters (meer dan 40-50), kunnen enkele kolom gel zuivering vervangen door gel zuivering in plaat of zuivering met korrels met een strenge maat cutoff (bijvoorbeeld AMPure korrels) .Tot op heden, de meest gebruikte next-generation sequencing technologie voor de 16S rRNA-gen is 454 De Ion Torrent sequencing technologie die wordt gebruikt in dit protocol is conceptueel zeer vergelijkbaar454 en beide technieken zijn gevoelig voor dezelfde soort sequencingfouten. Vanzelfsprekend werd aangetoond dat Ion Torrent sequencing geleid sequencing resultaten vergelijkbaar met 454 sequencing 10. Recent hebben vele onderzoekers het gebruik van Illumina technologie 16S rRNA gen amplicon sequencing 18,19 onderzocht. In ieder geval zou het gemakkelijk zijn om het huidige protocol voor andere stationaire sequencers zoals de Illumina MiSeq of 454 GS Junior aangepast door het veranderen van de fusie primer sequenties van de adapters en barcodes nodig voor deze sequentietechnologieën passen, zoals in de werkwijze recent beschreven voor de Illumina MiSeq 19. Als alternatief zou de onderzoekers volgen de stappen 1 en 2 van het protocol hier beschreven en stuur de gepoolde amplicons een sequencing centrum waar de emulsie PCR en sequencing zou worden uitgevoerd.
De 16S rRNA gen leest werden geknipt en geclassificeerd middels Mothur, maar veel andere analyses kunnen worden uitgevoerd op16S rRNA gen amplicons. Zo kunnen beta diversiteit worden geëvalueerd door het berekenen van de afstand tussen elk Unifrac monsterparen volgens de procedure beschreven in http://unifrac.colorado.edu/ 20. Alpha diversiteit indices en aantal operationele taxonomische eenheden van elk monster kan worden berekend met gereedschappen in QIIME zoals AmpliconNoise 21 of volgens de procedure Huse et al. 22 en die binnen Mothur geschetst.
De hier gebruikte primers geamplificeerd de variabele gebieden 3 en 4 van het 16S rRNA gen, maar veel andere gebieden kunnen worden aangewezen. In dit onderzoek werden 16S rRNA genen geamplificeerd uit plantaardig materiaal en de keuze van primer werd aan amplificatie van chloroplast 16S rRNA gen 23,24 vermijden. Er is een grote verscheidenheid van andere primers beschikbaar die verschillen in termen van de productlengte, taxonomische kracht en nut 25,26. Echter, in alle gevallen 200-400 bp leest van het 16S rRNA-gen niet betrouwbaar kan worden aangemerkt op het niveau van soorten, en de analyses worden beperkt tot het geslacht en hogere taxonomische niveaus. Andere genen zou beter zijn dat soortniveau informatie nodig, zoals cpn60 en rpoB-genen 27,28. Toekomstige drastische dalingen van de kosten van sequencing en verhogingen van de kracht van analyse-instrumenten zou kunnen maken het mogelijk om 16S rRNA-gen sequencing vervangen door shotgun metagenomica, maar tot die tijd 16S rRNA-gen sequencing blijft de gouden standaard van Environmental Microbiology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ion 314 Chip Kit v2 | Life Technologies | 4482261 | |
| Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 | Life Technologies | 4482006 | |
| Ion PGM Template OT2 200 Kit | Life Technologies | 4480974 | |
| HotStarTaq Plus Master Mix Kit | Qiagen | 203646 | |
| Primers and probes | IDT | NA | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BSA 20 mg/ml | Roche | 10,711,454,001 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65001 |
References
- Sipos, R., et al. Addressing PCR biases in environmental microbiology studies. Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies. PLoS ONE. 6, e27310 (2011).
- Tringe, S. G., Hugenholtz, P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).
- Margulies, M., et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. 437, 376-380 (2005).
- Kuczynski, J., et al. Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns. Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).
- Bondici, V. F., et al. Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects. J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).
- Auffret, M., et al. Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems. FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).
- Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil. FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).
- Bell, T. H., et al. Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance. ISME J. 7, 1200-1210 (2013).
- Yergeau, E., et al. Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).
- Yergeau, E., et al. Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations. Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).
- Yergeau, E., et al. Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination. ISME J. 8, 344-358 (2013).
- Deagle, B. E., et al. Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count. Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).
- Milani, C., et al. Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol. PLoS ONE. 8, e68739 (2013).
- Jünemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing. PLoS ONE. 7, e41606 (2012).
- Petrof, E., et al. Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut. Microbiome. 1, 3 (2013).
- Whiteley, A. S., et al. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform. J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6, 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., et al. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).
- Hamady, M., et al. Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data. ISME J. 4, 17-27 (2010).
- Quince, C., et al. Removing noise from pyrosequenced amplicons. BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).
- Huse, S. M., et al. Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering. Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).
- Edwards, J. E., et al. Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen. FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).
- Rastogi, G., et al. A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments. J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).
- Baker, G. C., et al. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).
- Links, M. G., et al. The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data. PLoS ONE. 7, e49755 (2012).
- Vos, M., et al. Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity. PLoS ONE. 7, e30600 (2012).
