Abstract
सूक्ष्म पारिस्थितिकी में प्रमुख प्रश्नों में से एक "कौन है?" है इस सवाल विभिन्न उपकरणों का उपयोग कर दिए, लेकिन लंबे समय तक चलने वाले सोने के मानकों में से एक डोमेन स्तरीय पीसीआर द्वारा उत्पन्न 16S ribosomal शाही सेना (rRNA) जीन amplicons दृश्य के लिए किया जा सकता है जीनोमिक डीएनए से amplifying प्रतिक्रियाओं. परंपरागत रूप से, यह क्लोनिंग और सेंगर (केशिका वैद्युतकणसंचलन) पीसीआर amplicons की अनुक्रमण द्वारा किया गया था. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के आगमन काफी सरल है और -16 rRNA जीन अनुक्रमण के लिए अनुक्रमण गहराई बढ़ गया है. benchtop sequencers की शुरूआत अब छोटे प्रयोगशालाओं दिन के एक मामले में घर में उनके -16 rRNA अनुक्रमण प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है. इधर, एक benchtop अगली पीढ़ी Sequencer का उपयोग -16 rRNA जीन amplicon अनुक्रमण के लिए एक दृष्टिकोण विस्तृत है. पर्यावरण डीएनए पहली अनुक्रमण एडेप्टर और बारकोड होते हैं कि प्राइमरों का उपयोग पीसीआर से परिलक्षित होता है. वे तो पायस पीसीआर के माध्यम से गोलाकार कण के लिए मिलकर कर रहे हैं. कणों कर रहे हैं lएक डिस्पोजेबल चिप पर oaded और चिप अनुक्रमण किया जाता है, जिसके बाद अनुक्रमण मशीन में डाला जाता है. दृश्यों, fastq प्रारूप में लिया फ़िल्टर और बारकोड पढ़ता का नमूना सदस्यता की स्थापना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. फिर आगे की सार्वजनिक रूप से उपलब्ध साधनों का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं पढ़ता फ़िल्टर और binned. पढ़ता है जहां एक उदाहरण विश्लेषण Mothur दिया जाता है सॉफ्टवेयर पैकेज के भीतर एक वर्गीकरण खोजने एल्गोरिथ्म के साथ वर्गीकृत किया गया. यहाँ उल्लिखित विधि सरल, सस्ता और सरल है और चल रहे जीनोमिक क्रांति से लाभ लेने के लिए छोटे लैब्स की मदद करनी चाहिए.
Introduction
यह एक पर्यावरणीय नमूने में निहित आनुवंशिक जानकारी की सम्पूर्णता लक्ष्य के रूप में Metagenomic अनुक्रमण एक बहुत शक्तिशाली तकनीक है. बन्दूक अनुक्रमण, बड़े डालने पुस्तकालयों और amplicon अनुक्रमण सहित metagenomic अनुक्रमण के विभिन्न जायके हैं. Amplicon अनुक्रमण आम तौर पर गठबंधन किया जा सकता है कि एक ही जीनोमिक क्षेत्र से अपेक्षाकृत सस्ती, तेज और पढ़ता उत्पादन करने में सक्षम होने का लाभ प्रदान करता है. इसके अलावा, amplicon अनुक्रमण के लिए डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह ज्यादातर मानकीकृत है. यह पीसीआर पर आधारित है हालांकि, बाद से, यह सब अधूरा विशिष्टता, अधूरा कवरेज और प्राइमर से संबंधित पूर्वाग्रहों पर सबसे अच्छा अर्द्ध मात्रात्मक इस दृष्टिकोण बनाता है जो 1,2, biases है. कई जीनोमिक क्षेत्रों कार्यात्मक जीन सहित amplicon अनुक्रमण के लिए लक्षित किया जा सकता है, लेकिन सबसे लोकप्रिय विकल्पों में एक समुदाय प्रोफ़ाइल उत्पन्न करने के लिए इस तरह के -16 rRNA जीन के रूप में मार्कर जीन का उपयोग करने के लिए कर रहे हैं. परंपरागत रूप से, -16 rRNA जीन amplicon sequencing ई में क्लोनिंग शामिल है कि श्रम गहन तकनीक का उपयोग किया गया था कोलाई, कॉलोनी उठा और अलग प्लास्मिड पर सेंगर अनुक्रमण द्वारा पीछा प्लाज्मिड निकासी, और इसके परिणामस्वरूप, सबसे पढ़ाई नमूना प्रति 100 से कम क्लोन का विश्लेषण किया. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दो प्रमुख अग्रिमों लाया: सबसे महत्वपूर्ण बात अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं और, की भारी parallelization, टेम्पलेट्स के प्रतिरूप जुदाई एक मेजबान में जीन टुकड़े डालने की जरूरत के बिना. यह काफी -16 rRNA जीन amplicon अनुक्रमण 3 के लिए एक "पुनर्जागरण" में जिसके परिणामस्वरूप, अब वापस कई पर्यावरण सूक्ष्म जीव विज्ञान के अध्ययन का एक नियमित विशेषता के रूप में है जो -16 rRNA जीन amplicons की अनुक्रमण, सरल बनाया गया है.
2005 4 में रॉश 454 अनुक्रमण के आगमन के बाद से, कई अन्य अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के बाजार पर दिखाई दिया है (उदाहरण के लिए, Illumina, ठोस, PacBio). पीठ टॉप अनुक्रम की अभी हाल ही में परिचयरुपये छोटे प्रयोगशालाओं के लिए बड़े अनुक्रमण केन्द्रों के लिए एक बार अनन्य अनुक्रमण क्षमता लाया. पांच benchtop मशीनों वर्तमान में उपलब्ध हैं: 454 जी एस जूनियर, आयन धार व्यक्तिगत जीनोम मशीन (PGM) और प्रोटॉन, और Illumina MiSeq और NextSeq 500 इन सभी sequencers कम की पेशकश सबसे पूर्ण से चलाने के लिए और डॉलर प्रति कम अड्डों प्रति पढ़ता है जबकि पैमाने sequencers, वे तेजी से, अधिक लचीला कर रहे हैं, और उनके कम अधिग्रहण और रन लागत छोटे शैक्षिक प्रयोगशालाओं के लिए उन्हें सस्ती बनाता है. अध्ययन के इस प्रकार के आम तौर पर अनुक्रमण का एक चरम गहराई की आवश्यकता नहीं है क्योंकि benchtop sequencers विशेष रूप से अच्छी तरह से, पर्यावरण सूक्ष्म जीव विज्ञान के अध्ययन में amplicon, छोटे जीनोम और कम जटिलता metagenome अनुक्रमण के लिए उपयुक्त हैं. उदाहरण के लिए, यह आम तौर -16 rRNA जीन अनुक्रमण की संख्या के अध्ययन के लिए बहु मिलियन डेटासेट 5 पढ़ता के रूप में एक ही पैटर्न उत्पन्न कर सकते हैं पढ़ता 1000 ~ के रूप में, नमूना प्रति पढ़ता सर्वोपरि नहीं है कि सहमति व्यक्त की है. वाले ने कहा कि, benchtop अगली generatio n sequencers अभी की अधिक से अधिक पैदावार के साथ अनुक्रम डेटा की बड़ी मात्रा में उत्पन्न ~ 35 MBP (454 जी एस जूनियर), ~ 2 GBP (आयन टोरेंट PGM), ~ 10-15 GBP (आयन टोरेंट प्रोटोन), ~ 10 GBP (Illumina MiSeq) और सबसे पर्यावरण सूक्ष्म जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए पर्याप्त से अधिक है जो ~ 100 GBP (Illumina अगला Seq 500),.
Benchtop sequencers का उपयोग -16 rRNA amplicons की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण हाल ही में वातावरण की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया गया है. उदाहरण के लिए, आयन धार PGM समुदाय के लिए इस्तेमाल किया गया है तेल रेत खनन प्रभावित अवसादों की, हाइड्रोकार्बन दूषित आर्कटिक मिट्टी 8,9 के एक्वाकल्चर सिस्टम 7, recirculating की, विशेष रूप से उच्च पीएच और कम पारगम्यता 6 था कि यूरेनियम खदान के अवशेष का विश्लेषण करती है और मानव और पशुओं के शव 13-16 से, दूषित मिट्टी 12 में लगाए विलो की और anaerobic digesters 17 के rhizosphere के Athabasca नदी 10,11 से biofilms,.
इस योगदान हम विस्तार एक benchtop अगली पीढ़ी Sequencer (आयन टोरेंट PGM) का उपयोग घर में -16 rRNA जीन amplicons दृश्य के लिए हमारे दृष्टिकोण में jove_content ">. डीएनए निष्कर्षण के बाद -16 rRNA जीन होते हैं जो डोमेन स्तरीय बैक्टीरियल प्राइमरों का उपयोग परिलक्षित कर रहे हैं अनुक्रमण एडेप्टर और अद्वितीय, नमूना विशिष्ट दृश्यों (बारकोड). amplicons एक equimolar अनुपात में, शुद्ध मात्रा निर्धारित और जमा कर रहे हैं. जमा नमूने तो clonally एक पायस पीसीआर में परिलक्षित और अनुक्रम रहे हैं. परिणामस्वरूप दृश्यों (सार्वजनिक रूप से उपलब्ध जैव सूचना विज्ञान उपकरण का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं जैसे, Mothur).Protocol
फ्यूजन विधि से 1 -16 rRNA जीन Amplicon पुस्तकालय तैयारी
- 5'- सी सी टी सीटीसी:;, रिवर्स R533-IonP1 5'- सीसीए TCT कैट सीसीसी टी जी सी GTG TCT CCG एसी टी सीएजी XXX XXX XXX XTA CGG चीर जीसीए जीसीए जी 3 ': प्राइमरों (आगे, F343-Iona-MIDXX पिघलना एक TTA CCG CGG CTG CTG जीसी -3 'में बुनना GGG सीएजी टीसीजी GTG; बोल्ड: आयन टोरेंट विशिष्ट एडाप्टर, इटैलिक:; फ़ॉन्ट अनुक्रमण रन की शुरुआत में संकेत तीव्रता औजार के लिए अनुक्रमण कुंजी: टेम्पलेट विशिष्ट प्राइमरों, एक्स ... एक्स: 10 बीपी बारकोड, कुछ बारकोड दृश्यों के लिए 1 टेबल देखें), 2x HotStartTaq प्लस मास्टर मिश्रण और नमूने. धीरे मिलाया जाना चाहिए कि मास्टर मिश्रण को छोड़कर, उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं.
- रिवर्स प्राइमर का 0.5 माइक्रोन, 0.4 मिलीग्राम / गोजातीय सीरम Albumine (बीएसए) और 1x HotStartTaq प्लस मास्टर मिश्रण के मिलीलीटर के साथ एक पीसीआर मिश्रण (20 μl प्रतिक्रियाओं) तैयार करें. ई मास्टर मिश्रण के 18.5 μl जोड़ेंACH पीसीआर ट्यूब.
- एक साथ अनुक्रम किया जाएगा कि नमूनों में से प्रत्येक के लिए एक अलग बारकोड के साथ एक आगे प्राइमर (20 मिमी 0.5 μl) जोड़ें. पीसीआर ट्यूब के लिए नमूने के 1 μl (1-10 एनजी / μl) जोड़ें.
- एक पीसीआर मशीन में ट्यूबों की जगह और निम्नलिखित प्रोग्राम चलाने: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण; 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्र, 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस और 45 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम बढ़ाव. पीसीआर उत्पादों 4 डिग्री सीओ पर रखा / एन या इस्तेमाल किया जब तक जमे हुए किया जा सकता है.
2 Amplicon शोधन, मात्रा और Pooling
- सबसे बड़ा कंघी उपलब्ध का उपयोग कर एक 2% agarose जेल तैयार करें. अच्छी तरह से एक खाली द्वारा प्रत्येक नमूने को अलग करने, जेल पर प्रतिक्रिया और लोड करने के लिए 6x जेल लोडिंग डाई के 5 μl जोड़ें. 50 मिनट के लिए 70 वी में जेल चलाएँ.
- जेल की एक तस्वीर ले लो और बैंड कटौती (250 बीपी के आसपास होने की उम्मीद आकार: 190 बी.पी. उत्पाद प्लस 63 बीपी एडेप्टर और बारकोड) एक स्वच्छ स्केलपेल का उपयोग.
- PicoGreen साथ प्रत्येक पीसीआर उत्पाद यों और 5 एक्स 10 9 अणुओं / μl (लगभग 1 एनजी / μl) पर एक शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए dilutions बनाओ. कुछ नमूने कम प्रवर्धन दिखाने के लिए, बाद में प्रक्रियाओं के लिए उपयुक्त सबसे कम एकाग्रता 1.57 10 x 7 अणुओं / μl (26 बजे) है कि ध्यान में रखते हुए, एक कम एकाग्रता के लिए dilutions समायोजित.
- प्रत्येक पतला पीसीआर उत्पाद के पूल 10 μl नमूने की एक equimolar पूल प्राप्त करने के लिए. योजना बनाई अनुक्रमण रन से प्रत्येक के लिए एक अलग पूल तैयार करें. इस्तेमाल किया जब तक जमा पीसीआर उत्पादों फ्रीजर में रखा जा सकता है.
3 इमल्शन पीसीआर और अनुक्रमण
- पायस पीसीआर प्रदर्शन करना:
- 25 μl की मात्रा में 26 बजे तक जमा पीसीआर उत्पादों पतला. एक आयन PGM टेम्पलेट किट से पिघलना अभिकर्मकों.
- एक पीसीआर हुड में पायस पीसीआर मिश्रण (किट में दिए गए अभिकर्मकों) तैयार करें और बेंच पर जमा पीसीआर उत्पादों और (प्रदान) क्षेत्र कणों जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और एक फिल्टर कारतूस में मिश्रण डालें और ध्यान से पायस तेल के साथ शीर्ष (प्रदान).
- धीरे धीरे स्वचालित पायस पीसीआर तंत्र (जैसे, आयन एक टच 2 साधन) पर फिल्टर कारतूस और लोड रिवर्स. उपयुक्त प्रोग्राम का चयन करें और प्रक्रिया शुरू करते हैं.
- पीसीआर पूरा कर लिया है स्वचालित पायस के बाद, संग्रह ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला हटाने और ट्यूब के तल पर क्षेत्र कण निकालते हैं. (किट में प्रदान की) धोने समाधान के 100 μl में क्षेत्रों Resuspend और पुस्तकालय मात्रा का ठहराव के लिए एक 2.0 μl विभाज्य ले.
- पुस्तकालय मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करना.
- SSPE बफर (150 मिमी NaCl, 10mm Napo 4, 1 मिमी ना 2 -EDTA) एडाप्टर B'-परिवार के 2 μl (साथ 5'- परिवार -CT के 100 μl मिक्सजी आगा CTG सीसीए AGG सीएसी एसीए GGG जी ए टी AGG -3 ') जांच और अनुकूलक एक Cy5 के 2 μl (5'- Cy5 -CCA TCT कैट सीसीसी टी जी सी GTG TCT CCG अधिनियम सीएजी -3') जांच. 3.2 कदम में लिया 2.0 μl विभाज्य के लिए इस मिश्रण की 52 μl जोड़ें और quantitation के लिए एक खाली के रूप में शेष 52 μl के लिए (टेम्पलेट किट से) धो समाधान के 2 μl जोड़ें.
- 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर तब, 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मिश्रण स्थानांतरण.
- आरटी पर 3 मिनट के लिए 15,500 XG पर TEX बफर (10 मिमी Tris, 1 मिमी EDTA, 0.01% ट्राइटन X-100, पीएच 8.0) के 1.0 मिलीलीटर, मिश्रण जोड़ें और अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और प्रत्येक ट्यूब में 20 μl छोड़ दें. इस धोने प्रक्रिया दो बार दोहराएँ.
- , टेक्स बफर के 180 μl जोड़ें pelleted कणों resuspend और 500 μl Qubit ट्यूबों में हस्तांतरण.
- एक qubit तंत्र का उपयोग परिवार और Cy5 के लिए प्रतिदीप्ति उपाय और आयन समुदाय वेबसाइट पर उपलब्ध कैलकुलेटर का उपयोग सकारात्मक क्षेत्रों के अनुपात की गणना.
- एक स्वचालित संवर्धन प्रणाली (जैसे, आयन एक टच संवर्धन सिस्टम) का उपयोग (प्रवर्धित डीएनए युक्त) सकारात्मक क्षेत्रों के लिए क्षेत्र कणों के शेष समृद्ध.
- प्रदान की 8 अच्छी तरह से पट्टी का उचित कुओं में pipet अभिकर्मकों: ठीक 1: 3.2 कदम से क्षेत्र कण; 2 खैर: MyOne streptavidin सी 1 मोती (13 μl) पूर्व धोया; खैर 3, 4 और 5: धोने समाधान (टेम्पलेट किट में प्रदान की); 6 खैर: खाली; खैर 7: पिघल बंद समाधान (125 मिमी NaOH, 0.1% के बीच 20); खैर 8: खाली.
- Pipetting बांह पर एक टिप और नमूना संग्रह के लिए एक 0.2 मिलीलीटर ट्यूब को स्थापित करें. साधन प्रारंभ करें. संवर्धन के अंत में, समाधान (प्रदान) को निष्क्रिय करने की 10 μl जोड़ें. समृद्ध मोती अप करने के लिए 15 दिनों के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस रखा जा सकता है.
- अनुक्रमण साधन प्रारम्भ करें:
- अनुक्रमण रन का विवरण निर्दिष्ट अनुक्रमण साधन से कनेक्ट और एक अनुक्रमण रन योजना तैयार करते हैं.
- जमानाएल धोने समाधान # 2 (आयन PGM अनुक्रमण किट में प्रदान की), धोने समाधान # 1 (350 μl 100 मिमी NaOH) और ऑटो पीएच बफर समाधान (प्रदान).
- Initialization प्रक्रिया शुरू करें और जब उनके संबंधित 50 मिलीलीटर ट्यूब में dATP, dGTP dCTP और dTTP न्यूक्लियोटाइड (प्रदान) जोड़ने के लिए प्रेरित किया. अनुक्रमण मशीन पर ट्यूब पेंच और initialization प्रक्रिया जारी है. आरंभीकरण पूरा हो गया है, तुरंत रन प्रक्रिया शुरू करते हैं.
- अनुक्रमण के लिए नमूने तैयार करने और चिप लोड:
- 1.5 मिनट के लिए 15,500 XG पर centrifuging द्वारा ट्यूब के नीचे 3.4 कदम से समृद्ध क्षेत्रों लीजिए. वास्तव में 3 μl छोड़ने पर तैरनेवाला निकालें.
- (अनुक्रमण किट में प्रदान की) अनुक्रमण प्राइमर के 3 μl जोड़ें, कण resuspend करने के लिए नीचे से ऊपर pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से और. 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर तब, 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- पोलीमरेज़ (प्रदान), अच्छी तरह से मिश्रण और incub की 1 μl जोड़ें5 मिनट के लिए आरटी पर खा लिया. 30 मिनट के भीतर अनुक्रमण चिप पर एंजाइम क्षेत्रः मिश्रण लोड करने के लिए आगे बढ़ें.
- ऊष्मायन के दौरान, Sequencer पर अनुक्रमण चिप लोड और एक चिप गुणवत्ता की जांच करते हैं. Centrifugation द्वारा चिप से तरल निकालें और धीरे धीरे एंजाइम क्षेत्र मिक्स (7 μl) नीचे pipeting और चिप में बुलबुले की शुरूआत से बचने के द्वारा चिप में नमूना लोड.
- एक microcentrifuge में 1 मिनट के लिए चिप तीन बार अपकेंद्रित्र. प्रत्येक centrifugation पर चिप का ओरिएंटेशन बदलने और ऊपर pipetting द्वारा और प्रत्येक रन के बीच में नीचे मिश्रण.
- साधन में चिप लोड और रन शुरू.
4 मूल अनुक्रम डेटा विश्लेषण
- अनुक्रमण डेटा सर्वर से कनेक्ट और fastq फाइल डाउनलोड. प्राइमर और बारकोड जानकारी (तालिका 1 में उदाहरण देखें) युक्त एक टैब सीमांकित "oligos" फाइल बनाएं. चुटकुला से Greengenes संदर्भ फ़ाइलों को डाउनलोड करेंहूर वेबसाइट ( http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ).
- Mothur शुरू करने और विश्लेषण प्रदर्शन:
- निम्न आदेश का उपयोग कर एक FASTA को fastq फाइल और एक गुणवत्ता फ़ाइल कन्वर्ट: fastq.info (fastq = test.fastq)
- प्रत्येक दृश्य के समूह सदस्यता का निर्धारण करें और निम्न आदेश का उपयोग दृश्यों ट्रिम: trim.seqs (FASTA = test.fasta, oligos = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, MINLENGTH = 150, keepforward = टी)
- विभिन्न विकल्पों में वांछित तंगी के अनुसार संशोधित किया जा सकता है
- निम्न आदेश का उपयोग greengenes वर्गीकरण में दृश्यों को वर्गीकृत: classify.seqs (FASTA = test.trim.fasta, विधि = वैंग, समूह = test.groups, टेम्पलेट = gg_99_otus.fasta, वर्गीकरण = gg_99_otus.tax, कटऑफ = 50)
Representative Results
जेल पर शुद्धि के बाद, पीसीआर प्रवर्धन के 25 चक्रों के साथ, प्रवर्धन उत्पादों पानी की 50 μl में एनजी 0.2-10.0 की एकाग्रता में आम तौर पर कर रहे हैं. यह शुरू करने से डीएनए एकाग्रता, नमूना के प्रकार और इस्तेमाल शुद्धि किट के आधार पर व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं. यह सभी नमूने के चक्र का एक ही नंबर का उपयोग परिलक्षित किया जाना चाहिए कि ध्यान में रखते हुए, कल्पना गठन से बचने और प्रवर्धन पूर्वाग्रहों को कम करने के लिए कम से कम संभव करने के लिए पीसीआर चक्र की संख्या रखने की सिफारिश की है. पॉलीक्लोनल की संख्या पढ़ता है और खाली क्षेत्रों को कम करने और की पढ़ता संख्या को अधिकतम करने के लिए, qubit अनुपात, औसत उत्पादन लगभग 0.1 और 0.3 और परिवार प्रतिदीप्ति एक आयन टोरेंट PGM पर एक 314 चिप का प्रयोग 200 से ऊपर होना चाहिए के बीच होना चाहिए 36 मल्टिप्लेक्स वातावरण युक्त एक रन के लिए प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के बाद पढ़ता के 0.3-0.5 एम अच्छी गुणवत्ता Mothur में परिणामों की छानने के बाद पढ़ता है. तालिका 2 नंबर की एक ठेठ टूटने से पता चलता हैमानसिक नमूने प्राइमरों -16 की V3-4 क्षेत्र को लक्षित और Mothur का उपयोग विश्लेषण के साथ परिलक्षित. Mothur में, trim.seqs प्रक्रिया गुणवत्ता फिल्टर और कारण के साथ गुणवत्ता फिल्टर पारित नहीं किया था कि दृश्यों में शामिल है कि एक "* .scrap.fasta" पारित किया कि दृश्यों से युक्त एक "* .trim.fasta" फाइल उत्पन्न अनुक्रम शीर्षक में अस्वीकृति के लिए. "Oligos" फ़ाइल में बारकोड के साथ आपूर्ति की है, जब इस आदेश भी बारकोड अनुक्रम के आधार पर हर अनुक्रम का समूह सदस्यता में शामिल है कि एक "* .groups" फ़ाइल उत्पन्न होगा. classify.seqs प्रक्रिया एक्सेल में खोला जा सकता है कि एक ".tax.summary" उत्पन्न करता है. यह फ़ाइल (कॉलम में) नमूनों में से प्रत्येक के लिए (लाइनों में) वर्गीकरण संबद्धता का सारांश होता है. इस फ़ाइल को नीचे की ओर सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और विभिन्न वर्गीकरण स्तर पर समुदाय रचना कल्पना करने के लिए. ".taxonomy" फाइल विस्तृत वर्गीकरण होता हैप्रत्येक दृश्य के लिए संबद्धता. सभी 36 नमूने भर जाति / वर्ग के स्तर पर औसत समुदाय रचना चित्र 1 में दिखाया गया है.
सभी नमूनों भर जाति / वर्ग के स्तर पर 1 टूटने समुदाय संरचना चित्रा.
| आगे | TACGGRAGGCAGCAG | |
| बारकोड | CTAAGGTAAC | Sample01 |
| बारकोड | TAAGGAGAAC | Sample02 |
| AAGAGGATTC | Sample03 | |
| बारकोड | TACCAAGATC | Sample04 |
| बारकोड | CAGAAGGAAC | Sample05 |
| बारकोड | CTGCAAGTTC | Sample06 |
| बारकोड | TTCGTGATTC | Sample07 |
| बारकोड | TTCCGATAAC | Sample08 |
| बारकोड | TGAGCGGAAC | Sample09 |
| बारकोड | CTGACCGAAC | Sample10 |
Mothur में उपयोग के लिए तालिका 1 उदाहरण "oligos" फ़ाइल.
| # की पुस्तकें | पिछले चरण की% | औसत. नमूना प्रति | |
| कुओं की संख्या | 1262519 | - | 35,070 |
| मोतियों के साथ वेल्स | 1114108 | 88.20% | 30,947 |
| टेम्पलेट्स के साथ मोती | 1112746 | 99.90% | 30,910 |
| मोनोक्लोनल मोती | 826805 | 74.30% | 22,967 |
| अच्छी गुणवत्ता पढ़ता (Sequencer से आउटपुट) | 782204 | 94.60% | 21,728 |
| दर्रा Mothur फिल्टर (मिनट. औसत. एक 50bp खिड़की पर 20 के गुणवत्ता स्कोर, मि. 150bp की लंबाई) | 372168 | 47.60% | 10,338 |
| GreenGenes में जाति स्तर पर वर्गीकृत (50% विश्वास दहलीज) | 342171 | 91.90% | 9505 |
| GreenGenes में परिवार के स्तर पर वर्गीकृत (50% विश्वास दहलीज) | 316512 | 92.50% | 8792 |
| GreenGenes में जीनस स्तर पर वर्गीकृत (50% विश्वास दहलीज) | 289899 | 91.60% | 8053 |
एक आयन धार 314 चिप पर मल्टिप्लेक्स 36 नमूने पर्यावरण के लिए एक ठेठ रन से उत्पादित पढ़ता तालिका 2 नंबर.
Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि सरल और सस्ता है, और कई प्रयोगशालाओं metagenomic अनुक्रमण की शक्ति का उपयोग करने की अनुमति चाहिए. इसे इस्तेमाल अनुक्रमण मंच पर निर्भर करता है, एक बार पुस्तकालयों प्रक्रिया का सबसे automatized होने के साथ बहुत कम हाथों पर समय की आवश्यकता है, निर्माण कर रहे हैं. यहां इस्तेमाल अनुक्रमण मंच (आयन टोरेंट PGM) के लिए, पूरी प्रक्रिया काम के दो दिन के भीतर किया जा सकता है. पीसीआर 36 नमूनों की प्रवर्धन: 36 नमूनों की $ 25, जेल शुद्धि और PicoGreen डीएनए quantitation इस प्रकार है: (2013 सितम्बर) लिखने का फिलहाल, ऊपर विस्तृत उदाहरण से संबंधित अभिकर्मक लागत थे 125 डॉलर पायस पीसीआर एक जमा amplicon नमूने लिए : $ 550 या नमूना प्रति $ 15 या गुणवत्ता फ़िल्टर पढ़ें प्रति $ 0.0015 की कुल के लिए $ 250, $ 150 और अनुक्रमण अभिकर्मकों. यह कीमत साधन सेवा अनुबंध, साधन मूल्यह्रास, तकनीशियन वेतन और प्रयोगशाला अंतरिक्ष उपयोग शामिल नहीं है.
नमूनों में से प्रत्येक के लिए पढ़ता तम्बू "> सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक समान संख्या प्राप्त करने के लिए, एक equimolar अनुपात में सभी उत्पादों पूल करने के लिए है. PicoGreen मात्रा का ठहराव यहां इस्तेमाल किया गया था, लेकिन अन्य तरीकों हालांकि कम सही, उपयुक्त हो सकता है (जैसे, यूवी मात्रा का ठहराव, जेल आधारित मात्रा का ठहराव). यहां तक कि सबसे सही मात्रा का ठहराव और पूलिंग करके, नमूना प्रति पढ़ता की संख्या में कुछ परिवर्तनशीलता है, और तालिका 2 में विस्तृत विशिष्ट समय में, यह 4,380 से 32,750 के बीच है 10,338 की औसत पढ़ता के साथ पढ़ता है. नमूने (अधिक 40-50 की तुलना में) की बड़ी संख्या प्रसंस्करण, तो एक स्तंभ जेल शुद्धि एक कड़े आकार कटऑफ के साथ थाली या शुद्धि का उपयोग मोतियों में जेल शुद्धि द्वारा बदला जा सकता है (उदाहरण के लिए, AMPure मोती) .तिथि करने के लिए, -16 rRNA जीन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया 454. आयन धार अनुक्रमण प्रौद्योगिकी धारणा बहुत समान है454 के लिए और दोनों प्रौद्योगिकियों अनुक्रमण त्रुटियों के एक ही प्रकार से ग्रस्त हैं. आश्चर्य नहीं कि यह आयन धार अनुक्रमण 454 अनुक्रमण 10 के लिए बहुत ही अनुक्रमण परिणाम में हुई है कि दिखाया गया था. हाल ही में, कई शोधकर्ताओं -16 rRNA जीन amplicon अनुक्रमण 18,19 के लिए Illumina प्रौद्योगिकी के उपयोग का पता लगाया है. किसी भी मामले में, यह विधि में हाल ही में वर्णित की तरह, इन अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के लिए आवश्यक एडेप्टर और बारकोड मैच के लिए संलयन प्राइमर दृश्यों बदलकर Illumina MiSeq या 454 जी एस जूनियर जैसे अन्य benchtop sequencers के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल अनुकूलन के लिए आसान होगा Illumina MiSeq 19 के लिए. वैकल्पिक रूप से, शोधकर्ताओं कदम यहाँ विस्तृत प्रोटोकॉल का 1 और 2 का पालन करें और पायस पीसीआर और अनुक्रमण प्रदर्शन किया जाएगा, जहां एक अनुक्रमण केंद्र के लिए जमा amplicons भेज सकता है.
-16 RRNA जीन छंटनी और Mothur का उपयोग कर वर्गीकृत, लेकिन कई अन्य विश्लेषण पर प्रदर्शन किया जा सकता गया पढ़ता-16 RRNA जीन amplicons. उदाहरण के लिए, बीटा विविधता में उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग कर प्रत्येक नमूना जोड़ी के बीच Unifrac दूरी की गणना के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता http://unifrac.colorado.edu/ 20. अल्फा विविधता सूचकांक और प्रत्येक नमूने की परिचालन वर्गीकरण इकाइयों की संख्या AmpliconNoise 21 तरह QIIME के भीतर उपकरण का उपयोग कर या Mothur भीतर HUSE एट अल. 22 और उपलब्ध द्वारा उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग कर की गणना की जा सकती है.
यहां इस्तेमाल किया प्राइमरों -16 rRNA जीन से चर क्षेत्रों 3 और 4 परिलक्षित है, लेकिन कई अन्य क्षेत्रों को निशाना बनाया जा सकता है. वर्तमान अध्ययन में, -16 rRNA जीन संयंत्र सामग्री से परिलक्षित थे और प्राइमर का चुनाव क्लोरोप्लास्ट -16 rRNA जीन 23,24 के प्रवर्धन से बचने के लिए किया गया था. उत्पाद की लंबाई, वर्गीकरण शक्ति और उपयोगिता 25,26 की अवधि में भिन्नता है कि उपलब्ध अन्य प्राइमरों की एक विस्तृत विविधता है. हालांकि, सभी मामलों में 200-400 बीपी मज़बूती प्रजातियों स्तर पर वर्गीकृत नहीं किया जा सकता -16 rRNA जीन की पढ़ता है, और विश्लेषण जीनस और उच्च वर्गीकरण के स्तर तक ही सीमित हैं. प्रजातियों स्तर जानकारी cpn60 और rpoB जीन 27,28 तरह की जरूरत है, अगर अन्य जीन अधिक उपयुक्त हो सकता है. विश्लेषणात्मक उपकरणों के सत्ता में अनुक्रमण और बढ़ जाती है की लागत में भविष्य कठोर बूंदों यह संभव बन्दूक metagenomics द्वारा -16 rRNA जीन अनुक्रमण बदलने के लिए कर सकता है, लेकिन तब तक -16 rRNA जीन अनुक्रमण पर्यावरण सूक्ष्म जीव विज्ञान के सोने के मानक बनी हुई है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ion 314 Chip Kit v2 | Life Technologies | 4482261 | |
| Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 | Life Technologies | 4482006 | |
| Ion PGM Template OT2 200 Kit | Life Technologies | 4480974 | |
| HotStarTaq Plus Master Mix Kit | Qiagen | 203646 | |
| Primers and probes | IDT | NA | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BSA 20 mg/ml | Roche | 10,711,454,001 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65001 |
References
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