Summary
담배 식물은 일시적 발현 시스템을 통해, 진균 셀룰라아제, TrCel5A을 제조 하였다. 발현은 형광 융합 단백질을 사용하여 모니터링 할 수 있고, 단백질 활성은 사후 발현 분석되었다.
Abstract
셀룰로오스 분해 효소, 셀룰라아제는 연구와 산업의 이익 모두 대상입니다. 그러한 균사 구축 진균류 및 혐기성 세균과 같은 어려운 배양 생물, 이러한 효소의 우세는,이 분야에서 재조합 기술의 사용을 재촉하고있다. 식물 발현 방법은 효소 및 기타 산업적으로 유용한 단백질의 대규모 생산을위한 바람직한 시스템이다. 여기서,는 담배 tabacum에서 곰팡이 endoglucanase, 트리코더마 reesei Cel5A의 일시적 발현을위한 방법이 설명되어 있습니다. 성공적인 단백질 발현은 mCherry 효소 융합 단백질을 사용하여 형광 모니터링 도시된다. 또한 기본적인 테스트 세트는 일시적 발현 T.의 활성을 조사하는 데 사용 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, zymography뿐만 아니라 형광 염료 계 기질 분해 분석법 등 reesei Cel5A. 여기에 설명 된 시스템은 활성 세포를 생산하는 데 사용될 수있다짧은 시간주기에서 ulase, 구성 적 또는 유도 성 발현 시스템을 통해 식물에 추가 생산 잠재력을 평가하도록.
Introduction
리그 노 셀룰로오스 바이오 매스 액체 연료로의 전환의 저하는 화석 연료에 대한 의존도를 줄일 수있는 방법으로 구상하고있다. 경제성 매스 처리 시스템을 확립 한 가지 중요한 장애물은 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스 (1)의 효소 적 분해에있다. 식물 발현 시스템은 산업 규모에 효소의 생산을위한 큰 잠재력을 보여줍니다. 그들은 수천 년 동안왔다으로 수확 식물 경제적 볼륨에 농업 시스템이 이미 설치되어 있습니다. 식물에서 셀룰라아제의자가 가수 분해에 의한 생산은 2의 용이성 및 식물 세포벽 하나의 소화성을 증가시켜 하부 효소 수준의 사용을 최대화하기위한 전위와 같은 요인들에 바람직하다. 마지막으로, 식물 시스템은 식물 세포의 특정 영역에 대한 재조합 단백질의 타겟팅을 허용하고 세 posttranslationally 필요한 효소를 수정할 수있다.
"ve_content>된 담배 (담배)은 매우 일반적으로 인해 빠른 성장과 바이오 매스 축적 기능 4, 식물의 이종 단백질 발현 연구를위한 모델 생물로 사용됩니다. 재조합 단백질의 일시적 발현은 현지화으로 유연성을 유지하고, 따라서 선택된 단백질, 즉 셀룰라아제의 번역 후 변형 동안에, 짧은 시간 기간 5에서 단백질 생산을 가능하게하는 기술이다. 또한 식물에서 더 표현 전략을위한 기반을 마련하면서는 기본적인 분석을위한 셀룰라아제 (들)의 생산을 가능하게한다. 이러한 일시적 발현 전략을 사용하여, 진균 숙주 트리코더마 reesei (Hypocrea의 jecorina)로부터 유도 된 글리코 하이드 롤라 가족 05 Cel5A, 6 endoglucanase은 (이하 TrCel5A라고 함) 제조된다. TrCel5A는 기본적으로 당화 된 42 kDa의 단백질과 유압에 매우 활성화되어셀룰로오스 사슬 7을 roylzing.
여기에 설명 된 일시적 발현 기술은 식물 아그로 박테리아는 적절한 발현 벡터에 대한 관심의 유전자를 운반 남긴다 침윤, 비교적 널리 사용되는 시스템에 기초한다. 란타 식 성공의 신속한 분석을 허용하기 위해 TrCel5A 또한 mCherry 원래 Discosoma SP에 유래 모노머 형광 단백질과 융합 단백질로서 발현 될 수있다. 단백질에 융합 된 추가적인 여섯 히스티딘 (그의 태그)와, 8 DsRed를 C-말단 (TrCel5A - mCherry). 이종 융합 단백질, TrCel5A - mCherry의 표현 따라서 mCherry 분산을 검토하는 녹색 빛을 사용하여 식물 성장에서 모니터링 할 수 있습니다. 원하는 경우, 식물 재료의 얇은 부분은 단백질의 특정 지역화를 확립 녹색광 현미경으로 관찰 할 수있다. 이 작품, 신호 전송 용앉아 펩티드는 소포체 9 이종 단백질의 수출을 집중하기 위해, 구조에 통합되었다.
셀룰라아제 활성 시험의 수가 실행될 수 TrCel5A 포함한 식물 발현 셀룰라아제의 활성을 분석한다. 전체 수용성 식물 단백질 추출 후 TrCel5A 부분적 열 배양 기술을 이용하여 정제 할 수있다. 단백질의 크기는 웨스턴 블로 팅 다음 SDS-PAGE를 사용하여 설정됩니다. 용해도 10 : (CMC 카르복시 메틸 셀룰로오스를 만드는) Zymography는 기판, 카르복시 메틸화왔다 예 셀룰로오스 대 활성을 분석하기 위해 사용될 수있다. 셀룰라아제 및 글루코시다 활동 (: 4-MUC 결합) β-D-cellobioside과 관련된 형광 물질 4 - 메틸 움 (4-MU)를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. endoglucanase 활동을 평가하는 또 다른 방법은 아조-D와 연결되었습니다 CMC의 분광 분석을 포함너희 (Remazolbrilliant 블루 R) 11. 또, endoglucanases 및 셀룰라아제의 범위 모두의 단백질 활성은 P-하이드 록시 벤조산 하이 드라 자이드 (PAHBAH) 분석으로서 12 설탕 분석 시험의 사용에 의해 모니터링 될 수있다. 이러한 기술은 또한 표현 셀룰라아제의 활성을 규명하고 정량화 할 수있다.
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Protocol
야생형 N.의 tabacum 식물 1. 성장
- N. 성장 tabacum L. 이력서. 토양에 쁘띠 하바나 SR1 식물, 발아 일반 화분 용 흙으로 가득 적절한 냄비에 담배 씨앗을 배치합니다. 이주 후, 각각의 화분에 모종을 전송합니다. 상수 22 ° C (어두운 기간) 또는 25 ° C (빛 기간)과 온실에서 식물과 70 %의 상대 습도를 품어. 8분의 16 시간 빛 / 어둠주기에 조명을 제공합니다 (예 : 필립스 IP65 400 W 램프, 180 μmol · 초 -1 · m -2, λ = 400 ~ 700 nm의) 매일 물.
TrCel5A 및 TrCel5A - mCherry 단백질의 2. 일시적 발현
- 멸균 조건에서 Agarobacterium 튜메 파시 엔스의 단일 콜로니 (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) pTRAkc-ER-TrCel5A 또는 pTRAkc-ER-TrCel5A - mCherry 10 ㎖의 효모 추출물을 함유하는 삼각 플라스크로 전송 중 하나를 포함을 선택선택을위한 국물 (YEB, 제조업체의 사양에 따라 준비) 중간 및 카나마이신 (50 ㎎ / ㎖), 리팜피신 (50 ㎎ / ㎖) 및 카르 베니 실린 (100 ㎎ / ㎖). 26 ° C에서 36 ~ 40 시간, 180 rpm으로 배양한다. 참고 : 단백질 발현에 적합한 구조의 디자인은이 글의 범위를 벗어나지 만, 지침, 맥클레인 등 13 먼로와 Pellham (14)의 방법은 구조 설계에 따라 할 수있다..
- 위에서 언급 한 항생제 농도 YEB 20 ㎖를 접종하고 이전과 같은 조건에서 배양 각 문화의 200 μl를 가져 가라.
- 36-40 시간 후, 2 μL의 acetosyringon (200 μM 최종 농도), 100 ㎕의 40 % (w / v)의 포도당 용액 1 M MES 버퍼 산도 5.6의 200 μL.을 추가하여 문화를 preinduce 밤새 품어.
- 배 침투 버퍼 (100g / L의 자당, 3.6 g / L의 포도당, 8.6 g / L 무라 시게와 스쿡 기초 염 100 ㎖를 준비,)의 수산화 칼륨을 사용하여 pH를 5.6로 조정합니다.
- 이 OD 5-6의 (600)에 도달 할 때까지 1시 5분 희석와 문화의 OD 600을 측정합니다. OD 600에서 30 ㎖의 침투 매체에 필요한 문화의 볼륨을 계산합니다. 배 침투 버퍼의 15 ML을 추가하고 30 ㎖까지 버퍼를 만들기 위해 탈 H 2 O를 추가합니다.
- 온실에서 식물을 타고 침투를 용이하게하기 위해 정상에서 5 번째 잎에 닉에 제 3의 배축면을 피펫 팁을 사용합니다.
- 침투를 용이하게하기 위해 대화명에 잎의 배축면을 피펫 팁을 사용합니다.
- 침투 매체와 주사기를 입력하고 이전에 만든 닉 중 하나에 (바늘없이)에 넣어. 향축 잎면에 손가락으로 주사기를 지원합니다. interveinal 잎 영역의 조직으로주의 깊게 매체를 누릅니다. 참고 : 침윤 후, 상술 한 바와 동일한 조건 하에서 식물을 온실에서 재배. 또한, untr의 동일한 비율을 유지침투 식물과 같은 조건에서 컨트롤로들 어갈, 비 일시적 발현 식물 (NTEPs).
식물 잎의 TrCel5A - mCherry 식 3. 평가
- 4-6일 후, A. 침투와 식물을 온실에서 pTRAkc-ER-TrCel5A - mCherry을 포함하는 형광 분석을위한 어두운 방에 배치 튜메 파시 엔스.
- 빨간색 필터 (620-750 nm의)와 515 nm에서 녹색 빛을 방출 휴대용 광원을 사용 TrCel5A - mCherry, 빛 식물을 표현 잎 부분에서 형광을 시각화합니다. 참고 : 깊이에서 식물의 잎에서 단백질 발현의 특성은 빛과 형광 현미경 아래 vibratome 및 검사에 얇은 절편 잎에 의해 달성 될 수있다. 이를 위해 아래의 단계를 따릅니다 :
- 침투 잎에서 약 5 × 5 ㎜ 크기의 작은 부분을 잘라 아가로 오스 50 mM의 인산염 완충액 (pH 5.7)에 녹인 4 %에이를 포함 할 수 있습니다.
- 절단vibratome를 사용하여 임베디드 잎에서 80 ~ 90 ㎛의 크기의 섹션. 버퍼 또는 커버 슬립 커버와 상기 한 바와 같은 파장 필터를 사용하여 형광 검출기로 10 배 배율의 현미경을 사용하여 검사, 현미경 슬라이드에 배치합니다.
담배 잎에서 4. TrCel5A 추출
- A. 감염된 식물에서 1g의 대략적인 무게에 담배 잎에서 조각을 잘라 pTRAkc-ER-TrCel5A 및 액체 질소로 미리 냉각 박격포 위치를 포함하는 튜메 파시 엔스. 샘플에 액체 질소의 적절한 금액을 추가합니다. 갈기는 예비 냉각 유를 사용하여 분말로 떠난다.
- 지상 잎 물질에 1mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS) 2 ㎖를 추가하고 잎 물질의 대부분은 현탁액이 될 때까지 혼합한다. 4 ° C에서 20 분 동안 15,000 XG에 단백질 함유 상층 액을 원심 분리기 추출물.
- 원심FUGE 4 ° C에서 20 분 동안 15,000 XG에 추출하고 펠렛을 방해하지 않도록주의하고 단백질 함유 상층 액을. 펠렛을 폐기하십시오.
- 부분적으로 10 분 동안 55 ° C에서 단백질 함유 상층 액을 배양하여 TrCel5A을 정화. RT에서 10 분 동안 15,000 XG에서 원심 분리 한 후, 추가로 실온에서 10 분 동안 휴식을 허용한다. 제어 샘플을 얻기 위해 비 침투 식물에 대한 부분 정제 과정을 반복합니다. 다음의 모든 실험이 샘플을 사용합니다. 참고 : 단백질 솔루션은 최대 3 개월까지 1 주일 또는 -20 ° C에서 11 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 제어 샘플을 얻기 위해 비 침투 식물의 부분적인 정화 과정을 반복합니다. 다음의 모든 실험이 샘플을 사용합니다. 참고 : 단백질 솔루션은 최대 3 개월까지 1 주일 또는 -20 ° C에서 11 ° C에 저장할 수 있습니다.
5. SDS-PAGE, 웨스턴 블로 팅 및 TrCel5A - mCherry <의 아조-CMC Zymography/ P>
- 구매 또는 설치 방법 15에 따라 (W / V) SDS-PAGE 젤 12 %를 준비합니다.
- 1.5 % (w / v) 용액을 수득 물에 녹여 CMC. CMC-SDS-PAGE 젤을 만들려면 (w / v) CMC + 12 % (W / V 0.1 %의 결과로, 10 ㎖ SDS-PAGE 젤 혼합 용액에 물 1 ㎖에 1.5 % CMC 1 ㎖를 대체 ) SDS-PAGE 젤 혼합. 일반적으로 젤을 붓는다. 주 : (직접 사전 겔 용액을 제조하는 과정을 반복) 기존의 해결에서 CMC가 완전히 40 ° C로 교반 및 가열의 조합에 의해 용해되는 것을 확신합니다.
- 설치 방법 (12)에 따라, SDS의 존재에 끓여 샘플을 변성. 양성 대조군으로서, T.로부터 시판 셀룰라아제 혼합물의 1:500 희석을 사용 이러한 T.로 reesei, reesei ATCC 26921. 음성 대조군으로 비 침투 잎 (NTEPs)에서 유사하게 제조 단백질 용액을 사용합니다.
- 일반 프로토콜 15에 따라 전기 영동을 수행,염료 전면 겔의 하단에 도달하면 예를 들면 정지 전기로 50 분 ~ 200 V를 사용합니다.
- 0.1 %를 사용한 한 SDS-PAGE 겔을 염색 (w / v) 쿠마시 브릴리언트 블루 및 메탄올 / 빙초산 혼합물을 사용한 destain. 참고 : 빠른 염색과 destaining 부드럽게 염색을 가열하고 10 분 후 destaining 솔루션을 변경, 따뜻하게 (그러나 비등) 먼저 염색을하고 destaining 솔루션 15 초 ~를위한 전자 레인지를 사용하여 즉, 솔루션을 destaining하여 수행 할 수 있습니다 또는 냉각하고, 새로운 destaining 용액으로 반복하면.
- 설립 프로토콜 (16, 17)를 사용하여 하나의 SDS-PAGE 젤 웨스턴 블로 팅을 수행합니다. (보조), 알칼리 인산 분해 효소에 접합 된 그의 태그 (주) 및 폴리 클로 날 염소 항 - 토끼 항체 Fc 영역에 대한 다 클론 토끼 항체 : 다음과 같은 항체를 사용합니다. 참고 : 2 차 항체는 nitroblue의 테트라를 사용하여 시각화를 가능하게 선택해야윰 chloride/5-bromo-4-chloro-3 '- indolyphosphate의 P-톨루이딘 소금 (NBT / BCIP), 18 설명한대로.
- 0.15 %에 접힘에 젤 단백질 (W / V) 실온에서 β-사이클로 덱스트린, 20 mM의 인산 구연산 버퍼, 산도 6.5, 1.5 %에 젤을 배양하여 (w / v) CMC SDS-PAGE 젤을 수행 부드러운 15 분 19 진탕.
- β-사이클로 덱스트린 솔루션을 취소하고 잠시 H 2 O와 젤을 씻어 추가로 15 분 동안 50mM의 아세트산 나트륨 완충액 (pH 4.8)에서 RT에서 배양한다. 50 ℃에서 20 분 동안 30 mM의 아세트산 나트륨 완충액 pH를 4.8에서 젤을 배양하여 접힘 0.15 % CMC SDS-PAGE 젤을 사용하여 CMC의 zymography를 수행
- (w / v) CMC SDS-PAGE 겔 50 ℃에서 20 분 동안 30 밀리미터 아세트산 나트륨 완충액 (pH 4.8)에 젤을 배양하여 접힘 0.15 %를 사용하여 CMC의 zymography를 수행
- 0.1 %를 사용하여 10 분 동안 젤을 얼룩 W / 30 분 콩고 레드 솔루션 destain V 또는 명확한 밴드가 1 M 나를 사용하여 관찰 될 때까지CL. 선명한 영상을위한 0.3 % (V / V) 아세트산 젤을 씻으십시오.
TrCel5A 6. 4 MUC 활동 분석
- 50 %에서 10 mM의 4-MUC (v / v) 메탄올의 스톡 용액을 준비하고, 그것을 실온에서 어두운 곳에서 보관
- 직전에 분석을, 4-MUC 배 일 1 ㎜ 4-MUC로 구성된 솔루션, 60 MM의 아세트산 나트륨, 산도 4.8을 준비하고 있습니다.
- (inducibly 표현 또는 TrCel5A없이) 잎 단백질의 100 μL, T. 100 ㎕를 시판 셀룰라아제의 혼합물을 포함하는 샘플에서이 테스트를 수행 reesei의 1:1,000, 및 순수한 H 2 O였다. 세중의 각 샘플을 실행합니다.
- 96 - 웰 플레이트의 별도의 우물에 4 MUC 작업 솔루션의 피펫 100 μL는, 각 샘플의 100 μl를 추가합니다.
- 360 ㎚의 여기 파장 및 465 ㎚의 방출 파장을 이용한 형광 분광법을 통해 4-MU 형광 0 분 평가시기를 결정한다.
- 20 접시를 품어50 ° C에서 분, 증발을 방지하기 위해 접착제 뚜껑으로 덮여있다. 냉동 (또는 ㎕의 0.15 M 글리신, pH가 10.0, 별도의 플레이트에 샘플 100 μl를 (100)를 결합하여)에 의해 반응을 중지합니다.
- 360 ㎚의 여기 파장 및 465 ㎚의 방출 파장을 이용한 형광 분광법을 통한 4-MU 형광의 종점을 결정한다. 형광 값의 변화를 얻기 위해 엔드 포인트 (20 분) 평가시기에서 0 분을 뺍니다.
TrCel5A 7. 아조-카르복시 메틸 셀룰로오스 활동 분석
- 1.5 %의 재고를 준비 (w / v) RT에서 저장되고, 아조 - CMC 18 mM의 아연 아세테이트, 0.5 M 아세트산 나트륨, pH를 5 ~ 80 % 에탄올 (v / v), 룸에서 상점을 함유 침전 용액 온도.
- 직전에 분석에 1 %로 구성 아조-CMC 배 작업 솔루션, (W / V) 아조-CMC (H 2 O의)와 60 mM의 나트륨 아세테이트, 산도 4.8을 준비하고 있습니다.
- 샘플의 50 μL와 작품의 50 μl를 결합1.5 ML 튜브에 용액을 주입.
- (일시적으로 표현하거나 TrCel5A없이) 잎 단백질의 50 μl를 포함하는 테스트 샘플; T.로부터 시판 셀룰라아제 혼합물의 100 μL reesei는 1:1,000 희석; 순수한 H 2 O 세중 실행 시료와 표준.
- 50 ℃에서 20 분 동안 샘플을 품어 침전 용액 250 μl를 첨가하여 반응을 정지. 소용돌이 적극적으로 10 초 동안 각각의 샘플 솔루션이 완전히 결합 된 보장합니다.
- 다시 10 분 후 소용돌이 RT에서 샘플을 품어. 10 분 1,000 XG에 원심 분리기 샘플. 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 96 - 웰 플레이트에 각 시료의 상층 액 200 μl를 제거합니다.
- 590 ㎚의 파장에서 흡수 분광법을 이용하여 분석.
TrCel5A 8. PAHBAH 분석
- 여과지의 원형 (~ 5.5 mm 직경)을 잘라 구멍 펀치를 사용합니다. 100 ㎕의 60 mM의 NaAc, 산도 4.8, 1 추가샘플 (inducibly 표현하거나 TrCel5A없이) 잎의 단백질을 포함하는 하나 또는 상업적 T. 00 μL reesei 셀룰라아제 혼합물, 1:1,000 희석하고, 300 rpm으로 흔들어으로 50 ° C에서 20 시간 동안 필터 종이 서클 품어. 종이 필터와 함께 배양 각 샘플의 경우, 개별 샘플 - 컨트롤과 같은 종이 필터없이 중복 솔루션을 품어.
- RT에서 5 100 ㎖의 용액의 총 염산 집중 ML 및 저장소의 추가와 H 2 O에 PAHBAH을 용해하여 330 밀리미터 P-하이드 록시 벤조산 하이 드라 지드 (PAHBAH) 솔루션을 준비합니다. 참고 : 최상의 결과를 H 2 O 100 ml의 볼륨을하기 전에 해산을하는 데 도움이 온도에서 교반 PAHBAH 슬러리, 즉 30 ㎖의 작은 부피에 염산을 추가하여 달성된다
- RT에서 50 mM의 시트르산 나트륨, 10mM의 염화칼슘 및 500 mM의 수산화 나트륨 및 판매자를 함유 PAHBAH 용액 B를 준비한다.
- IMMEDiately 전에 분석에 사용할 때까지 (4 시간 내에서 사용되는) 얼음에 10 ㎖의 완충 용액, 상점에 1 ㎖의 PAHBAH 시약의 1.5 배의 작업 솔루션을 준비합니다.
- 내열성 0.2 또는 0.5 ML 튜브에 샘플을 준비합니다. 종이 필터 (단계 8.1) H 2 O 45 μL와 PAHBAH 작업 용액 100 μL와 함께 배양 각 솔루션의 5 μL를 결합합니다. 샘플 컨트롤 (종이 필터없이 배양하는 샘플)는 같은 농도 (5 ㎕의 샘플, 45 μL의 H 2 O, 100 μL의 PAHBAH 작업 용액)에서 실행해야합니다. 또한 0과 포도당 0.2 g / L를 포함하는 5 기준 (5 μL), 순수한 H 2 O를 테스트 세중 실행 시료와 표준.
- 100 ° C에서 정확히 10 분 동안 샘플을 품어 후 정확히 10 분 동안 실온에서 냉각. 410 nm의 파장에서 96 웰 플레이트와 분석 광학적 피펫 솔루션을 제공합니다. 최종 얻기 위해 샘플에서 (종이 필터없이 배양) 개별 샘플 컨트롤을 빼기값.
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Representative Results
TrCel5A 및 TrCel5A-mCherry는 일시적 발현 시스템 (도 1a 및도 1b)를 사용하여 담배 식물에서 성공적으로 발현되었다. TrCel5A - mCherry 융합 단백질의 발현 패턴의 시험은 건강한 나뭇잎 녹색 빛 (그림 1D)에서 널리 단백질 발현을 보였다 (그림 1C)를 공개했다.
총 수용성 단백질의 추출이 포함 된 잎을 가지고 담배 공장에서 수행 된 일시적 TrCel5A 단백질을 발현하고 SDS-PAGE가 존재 (그림 2A, 레인 1)이었다 단백질의 큰 다양성을 보여 주었다. 식물 및 NTEPs 유래의 전체 가용성 단백질 샘플을 발현 TrCel5A에서 전체 가용성 단백질 샘플을, 55 ℃에서 10 분 동안 배양시켰다 다른 많은 (기본 담배) 단백질이이 온도에서 안정되지 동안 TrCel5A는 55 ° C에서 안정과 활성 상태로 유지됩니다. 따라서, 많은 비 essenti알 단백질은 TrCel5A의 부분 정제 샘플을 떠나,이 처리에 의해 침전되었다. 이 열 석출 공정 후, 강한 단백질 밴드 ~ 40 kDa의 (도 2a, 레인 1)에서 관찰되었다. 이 식물 4로 표현하면이 크기에 실행 이전에 표시되었습니다 TrCel5A의 촉매 도메인 (CD)가 될 가능성이 높습니다. 네거티브 및 포지티브 컨트롤 샘플 (도 2a는, 차선 각각 3 및 4) NTEPs (음성 대조군,도 2a, 레인 3) 및 다중 대역에서 T.의 혼합물을 나타내는 나머지 열 내성 담배 단백질의 낮은 농도를 보였다 reesei 단백질 (양성 대조군, 그림 2A, 레인 4).
TrCel5A의 크기는 두 컨트롤 (그림 2B)를위한 존재로 간주되었다 TrCel5A C-말단에 통합 그의-6tag에서 감독 항체 염색으로 확인 하였다. TrCel5A이 증명되었습니다CMC의 zymography 의해 endoglucanase 활성 유지 (도 2C, 레인 1 및 2) SDS-PAGE 겔 및 웨스턴 블롯을 더러워 쿠마 같이, 여기서 리 폴딩 된 단백질은 동일한 높이, CMC 저하를 나타내는 강한 클리어 영역을 만들었다. 어떤 활동은 NTEPs (그림 2C, 레인 3)에서 비 셀룰라아제 단백질 혼합물에 대한 관찰, 그리고 한 (T)의 혼합물 양성 대조군으로 실행 reesei 단백질은 여러 구성 요소 (그림 2C, 레인 4)에서 endoglucanase 활동을 보여 주었다.
세 가지 분석이 사용되었다 TrCel5A의 cellulolytic 활동을 정량화. 먼저, 4 - MUC의 열화 릴리스 4-MU의 (360 ㎚에서 여기 된) 465 nm에서의 형광 방출 증가를 관찰하여 분석 하였다. T.의 시판 혼합물의 1:1,000 희석이했던 것처럼 TrCel5A는 4MUC을 저하 것으로 나타났다 reesei의 셀룰라아제 (그림 3A).
정량 분석CMC에 대한 TrCel5A의 활동의 아조-CMC에서 540 nm에서의 아조 염료의 방출을 측정하여 이루어졌다. 이러한 조건에서 TrCel5A 활동은 (그림 3B) 위에서 언급 한 셀룰라아제 혼합물의 1:1,000 희석에 활동의 상당했다.
여과지를 저하 TrCel5A의 능력은 또한 분석 하였다. 이 분석을 위해, 초기 당화 분석 (즉 여과지 저하 TrCel5A 용액)을 수행 한 후, 상층 액 (도 3b) 풀어 환원당의 양을 확인하기 PAHBAH 분석법에 의해 분석 하였다.
에 TrCel5A의 구조와 TrCel5A - mCherry의 이종 발현을위한 그림 1. 식물 발현 카세트바코는 녹색 빛 아래에서 형광에 의해 시각 잎. TrCel5A (A)와 TrCel5A - mCherry (B)에 사용되는 식물 발현 카세트의 도식 표현이 표시됩니다. 과도 TrCel5A-MC 발현 후, 담배 잎은 (C) 또는 녹색 등 (D) 정상으로 관찰되었다. 패널 (A)와 (B) CaMV 프로모터 (P35SS) 및 종료 신호 (pA35S)는 밝은 파란색으로 표시됩니다. 카르 콘 합성 효소 (CHS), 그리고 된 His6 코딩 서열 (을 His6)의 5'-UTR은 파란색으로 표시됩니다. 쥐 mAb24의 무거운 사슬에서 파생 된 식물 코돈 최적화 된 리더 펩타이드 (LPH)은 녹색으로 그려져 있습니다. LPH 빨간색으로 표시된 C-말단 KDEL 신호, ER로 단백질을 지연시킨다 그 후, apoplast으로 재조합 단백질의 분비를 달성한다. 화살표는 CaMV 35SS 발현 카세트를 증폭하는 프라이머의 결합 부위에 레이블을. 패널 (C) 및 (D)를 들어 녹색광은 515 nm의 여기 있었다.이미지를 확대하지 않고 촬영했다.
. 그림 2 크기와 SDS-PAGE, 웨스턴 블로 팅 및 CMC의 zymography로 표시 TrCel5A의 활동을 총 수용성 단백질의 분리 :. TrCel5A이 일시적 전에 표현 된 담배 식물에서 (1)과 (2) 열 침전 정제 후; TrCel5A도 열 침전 후, 존재하지 않았다 담배 식물 (3); 또는 T.의 시판 혼합물 reesei의 셀룰라아제 (4). SDS-PAGE 분리 된 단백질을 쿠마시 블루 염색 (A), TrCel5A (B)의 그의 태그 영역에 대해 웨스턴 블롯 및 CMC를 사용 zymography로 나타낸 셀룰라아제 활성을 시각화 콩고 레드 (C)를 사용하여 시각. PageRuler 플러스(Fermentas)는 분자량 마커 (M)로서 사용 하였다.
도 3. TrCel5A. TrCel5A의 효소 활성의 정량은 4 - MUC (A), 아조 - CMC (B), 및 필터 종이 (C) 및 형광 물질 4-MU (A)의 방출에 의해 측정 된 기판의 열화와 함께 배양시켰다 아조 염료 (B), 또는 PAHBAH (C)의 색 변화를 모니터링함으로써 환원당 정량화함에 따라. 각각의 분석은 세 가지 반복 실험의 결과를 보여줍니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 세 가지 분석법으로 분석 샘플은 단독 TrCel5A 버퍼되었습니다 열 침전 정제 후, NTEP (Nt 개의 WT) 열 침전 정제하고, T.의 시판 혼합물 후의 reesei의 셀룰라아제.
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Discussion
셀룰라아제의 재조합 발현으로 인해보다 효율적인 바이오 연료 생산 시스템 1에 대한 욕구에 큰 관심 분야입니다. 식물은 경제 수확 기술과 대규모 바이오 연료 생산을위한 매우 바람직한 특성 인자가 가수 분해 방법 등의 기능과 함께, 성공 셀룰라아제 생산을위한 많은 가능성을 제공합니다. 또한, 단백질을 제조하기위한 다른 언어 버전의 사용이 필요한 경우, 번역 후 변형 (20)에게 허용한다. 분명한 혜택을 제공하는 동시에, 셀룰라아제의 구성 적 표현을 가능하게하는 식물을 바꾸거나, 성공하지 않을 수도 있습니다 시간이 소요되는 방법입니다. 그러한 단백질 발현 유도 및 발현 메카니즘의 격리 같은 기술은 식물에서 성공적인 셀룰라아제 생산의 가능성을 증가하지만 이들은 여전히 확립 수개월 간다. 여기서, 일시적 발현 방법은 특정 셀룰라아제의 가능성을 설명하기 위해 설명된다며칠 내에 공장 시스템을 통해 생산된다.
형광 단백질 mCherry와 융합 과도 단백질 발현 방법의 성공을 설명하기 위해 여기에 사용되었다. TrCel5A - mCherry 명확 벡터 함유 아그로 박테리아에 침투했다 잎의 대부분에 걸쳐 분산되었다. 소포체에 현지화가 발현 된 단백질의 번역 후 변형이 가능합니다. 예를 들어, 글리코 실화를 활성화하는 발현 시스템의 능력은 T. 같은 원래 진균 유기체로부터 유래되는 그 셀룰라아제에 특히 중요 reesei 21. 이종 셀룰라아제 표현을위한 점점 인기있는 효모 발현 시스템은 자주 전체 셀룰라아제 활동 22에 잠재적 인 방해로 논의되는 효소의 하이퍼-글리코 실화의 원인. 식물 당화기구하이퍼-글리코 실화의 단점없이 다시. 또한, 공장 시스템의 표현 따라서 단백질의 소스에 맞게 수 있도록 허용하거나 전사 후 수정을 허용하지 않는 지역에 현지화 할 수 있습니다. 여기서 증명 시스템은 또한 apoplast, 엽록체, 세포질 또는 골지체 소체에 지역화, 상이한 신호 서열 (14)의 애플리케이션에 의해 사용될 수있다. 그러한 TrCel5A-mCherry 같은 형광 단백질 융합체,의 사용은 단백질 발현의 성공뿐만 아니라 단백질의 현지화를 입증 할 수있다. 그러나, 이러한 복합체는 더 활동 테스트를 위해 필요하지 않습니다. 따라서이 여기에 표시 한 같은 비 mCherry TrCel5A 구조가 표현 셀룰라아제의보다 정확한 활동 데이터를 얻기 위해, 모든 추가 시험에 사용하는 것이 좋습니다. 추가 실험을위한 컨트롤에 대한 비 일시적으로 침투 식물에서 샘플은 일반적으로 적절한 컨트롤로 볼 수 있습니다.
표현 TrCel5A의 셀룰라아제 활성의 정량 분석은 효소가 4 MUC, CMC 및 종이 필터 등 기판의 범위에 대해 활성화 된 것을 보여 주었다. 각 기판은 어느 형광 물질 (4-MU)를 통해 또는 발색 반응 (아조 염료 또는 PAHBAH)의 광 산란 분석에 의해, 서로 다른 분광 테스트를 사용하여 조사 하였다. 세 기판 및 분석 널리 셀룰라아제 활동의 평가를 위해 사용하고, 상대적으로 곧장 앞으로의 분석에 근거합니다. MUC-4는 이들 효소 (endoglucanases, exoglucanases 및 β-글루코시다 제)의 다양한으로서 대하여 활성, 글리코 가수 분해 효소의 활성을 측정하기 기초 기판으로서 사용된다. 분석의 속도, 요구 한정수, 고감도및 상기 기판을 절단하는 많은 셀룰라아제의 능력이 셀룰라아제위한, 또는 식 매수의 성공을 프로빙 일반적인 스크리닝 유용한 분석한다. 4 MUC를 사용할 때 한 가지 유념해야 할 점은이 기판 (예 TrCel5A 등) endoglucanases의 활동을하고, β-글루코시다 제의 활성에 특히 적합하다 또는 exoglucanases가 또는 효소 혼합물-글루코시다 제를 β에 비해 약한 나타나는 인 β-글루코시다 제를 포함한다. 낮은 단백질 농도를 가진 4-MUC 분석하거나 낮은 활동 수준을 수행 할 때 그것은 산도의 변화는 4-MU의 형광을 향상으로, 스톱 솔루션으로 글리신 (산도 10)의 추가를 사용하는 것이 좋습니다. 그것만 endoglucanases 의해 열화로서 CMC, 여기에 표현 된 효소에 대한보다 구체적인 기판이다. 아조-CMC 분석 인해 아연에 의한 셀룰로오스 (메탄올)의 침전에 대한 필요성을, 4-MUC에 대한보다 더 복잡합니다. 중요한이 기판의 이익, 따라서 분석그것은 생산되는 셀룰라아제의 성격을 확립하기위한 매우 유용하고, endoglucanase 활동에 대한 구체적인 것입니다. 여과지 저하는 셀룰라아제 활성을 확립하기위한 또 다른 일반적인 테스트입니다. 관찰 열화 량은 평가되고 셀룰라아제의 특성에 크게 의존 변화, 그리고 효소 혼합물의 활성을 조사하기위한 바람직한 기판이다. 여과지 저하를 검사 여기에 사용 PAHBAH 분석은, 당화 이후에 출시 된 설탕의 양을 인식하고 그래서 또한 CMC, lichenan, β-글루칸, α-셀룰로오스, AVICEL 포함, 여기에 설명되지 모델 기판의 넓은 범위에 적용 할 수있다 , 크 실란 및 크 실로 글루칸. 샘플이 평가 된 것으로 배양 시간의 변화가 결과의 차이로 이어질 수있는이 분석의 경우, 치료는, 같은 플레이트 (또는 같은 실행에있는)에 대한 기준을 포함하도록주의해야한다. 그것은 정확도를 보장하기 위해 분석을 반복하는 것도 따라서 중요하다. 또한샘플이 PAHBAH에 의해 식별 될 수있는 샘플에 자연적으로 존재하는 환원당을위한 제어, 셀룰로오스 기판없이 배양하고, 그렇지 않으면 거짓 긍정적 인 결과를 줄 것입니다 경우, 샘플 컨트롤은 항상 실행해야합니다.
결론적으로, 재조합 셀룰라아제의 일시적 발현 및 특성 분석을위한 방법이 명확하게 입증된다. 이러한 기술은 여기에 설명 된 것과 같은 활성 시험을 사용하여, 하나 이상의 셀룰라아제의 추가 조사를 위해 충분한 양의 단백질을 생성하는 간단한 방법을 제공한다. 특히, 이러한 방법은 란타 생산에 대한 지정 셀룰라아제의 가능성을 검토하는 신속한 방법을 제공한다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 BMBF Forschungsinitiative에 의해 지원되었다 "BioEnergie 2021 - Forschung 모피 Nutzung 폰 Biomasse 다이"과학을 촉진하기 위해 독일 연방 정부 및 주 정부의 우수 이니셔티브 재정 지원을 통해 우수 "바이오 매스에서 맞춤형 연료"의 클러스터 독일 대학의 연구.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic - kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic - rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic - carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody - rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper - Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer - Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source - BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome - VT1000S | Leica |
References
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