Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit Published: June 13, 2014 doi: 10.3791/51711
Automatic Translation
1, *1, *1, 2, 1
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology
* These authors contributed equally

Summary

Tabaksplanten werden gebruikt om een ​​schimmel cellulase, TrCel5A produceren via een tijdelijk expressiesysteem. De uitdrukking zou kunnen worden gecontroleerd met behulp van een fluorescerende fusie-eiwit, en het eiwit activiteit werd gekenmerkt post-expressie.

Abstract

Cellulose afbrekende enzymen, cellulasen, zijn doelwit van zowel onderzoek en industriële belangen. Het overwicht van deze enzymen op moeilijk-cultuur organismen, zoals hyfen opbouw schimmels en anaërobe bacteriën is bespoedigd het gebruik van recombinante technologieën op dit gebied. Plant expressiewerkwijzen zijn gewenst voor grootschalige productie van enzymen en andere industrieel bruikbare eiwitten. Hierin werkwijzen voor de transiënte expressie van een endoglucanase schimmel, Trichoderma reesei Cel5A in Nicotiana tabacum worden gedemonstreerd. Succesvolle eiwitexpressie blijkt, gecontroleerd door fluorescentie met een mCherry-enzym fusieproteïne. Bovendien, een aantal standaard tests worden gebruikt om de activiteit van tijdelijk tot expressie T. onderzocht reesei Cel5A, waaronder SDS-PAGE, Western blotting, zymografie, evenals fluorescentie en kleurstoffen gebaseerde substraat degradatie assays. Het hier beschreven systeem kan worden gebruikt om een ​​actieve cel producerenUlase in een korte tijdsperiode, om het potentieel voor verdere productie in planten te evalueren door constitutieve of induceerbare expressiesystemen.

Introduction

Afbraak van lignocellulose biomassa en het aanmaken van vloeibare brandstof is voorgesteld als een methode om afhankelijkheid van fossiele brandstoffen. Een belangrijke hindernis bij het ​​vaststellen economisch haalbare biomassa-systemen in de enzymatische afbraak van cellulose en hemicellulose 1. Plant expressiesystemen enorme mogelijkheden voor de productie van enzymen op industriële schaal. Landbouwsystemen te oogsten planten economisch als in volume zijn al gevestigd, zoals ze al duizenden jaren zijn geweest. De productie van cellulasen in planten gewenst door factoren zoals het gemak van autohydrolysis 2, en de mogelijkheden voor maximalisering van het gebruik van lagere enzym niveaus door het verhogen van de verteerbaarheid van plantaardige celwanden 1. Tot slot, plantaardige systemen maken het mogelijk de targeting van recombinante eiwitten naar specifieke gebieden van plantencellen en zijn in staat om enzymen waar vereist 3 posttranslationeel wijzigen.

ve_content ">

Nicotiana tabacum (tabak) wordt zeer vaak gebruikt als modelorganisme voor heterologe eiwitexpressie studies in planten, vanwege de snelle groei en biomassa accumulatie functies 4. Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten is een techniek die eiwitproductie mogelijk maakt in korte perioden 5, met behoud van flexibiliteit om de lokalisatie en dus posttranslationele modificaties van de geselecteerde eiwitten, namelijk cellulasen. Dit maakt de productie van de cellulase (s) voor basis-analyse, terwijl ook de basis te leggen voor verdere expressie strategieën in planten. Met dergelijke transiënte expressie strategie is een endoglucanase van glycosyl hydrolase familie 5, Cel5A, afgeleid van de schimmelgastheer Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 geproduceerd (hierna TrCel5A). TrCel5A is een 42 kDa eiwit dat natief geglycosyleerd en is zeer actief in hydroylzing celluloseketens 7.

De tijdelijke expressie techniek die hier beschreven is gebaseerd op relatief gebruikte systeem, infiltreren de bladeren met Agrobacterium die het gen van belang in een geschikte expressievector. Te zorgen voor een snelle analyse van succesvolle in planta expressie, kan TrCel5A ook worden uitgedrukt als een fusie-eiwit met mCherry, een monomeer fluorescerend eiwit oorspronkelijk afkomstig van Discosoma sp. Eiwit DsRed 8, met een extra zes Histidineresten (His-tag) gefuseerd met de C-terminus (TrCel5A-mCherry). Expressie van het heterologe fusie-eiwit, TrCel5A-mCherry kunnen dus worden gecontroleerd in de groeiende plant met groen licht mCherry verspreiding te onderzoeken. Desgewenst kunnen dunne secties van het plantenmateriaal met groen licht worden microscopisch onderzocht op de specifieke lokalisatie van het eiwit vast. Voor dit werk, signaal en tranzitten peptiden werden opgenomen in het construct, om het heterologe eiwit export naar het endoplasmatisch reticulum 9 lokaliseren.

Om de activiteit van plantaardige expressie cellulasen, zoals TrCel5A een aantal cellulase activiteit testen kunnen uitgevoerd worden geanalyseerd. Na de winning van de totale oplosbare plantaardige eiwitten, kan TrCel5A gedeeltelijk worden gezuiverd met behulp van een thermische incubatie techniek. Eiwit maat wordt ingesteld met behulp van SDS-PAGE gevolgd door Western blotting. Zymografie kan worden gebruikt om de activiteit te analyseren tegen substraten, bijv. cellulose die carboxy-gemethyleerd is (waardoor carboxymethylcellulose CMC) voor oplosbaarheid 10. Cellulase en glucosidase activiteit kan worden gecontroleerd met de fluorofoor 4-methylumbelliferyl (4-MU) geassocieerd met β-D-cellobioside (gecombineerde 4-MUC). Een andere methode om endoglucanase activiteit bij omvat de spectrometrische analyse CMC die is geassocieerd met een azo-dgij (Remazolbrilliant Blue R) 11. Daarnaast kunnen eiwit activiteit van zowel endoglucanasen en verschillende cellulasen worden gecontroleerd door het gebruik van een suiker analysetest, zoals p-hydroxybenzoëzuur hydrazide (PAHBAH) test 12. Deze technieken kunnen gebruikt worden om op te helderen en kwantificeren van de activiteit van de tot expressie gebrachte cellulase plaats.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Groei van Wild Type N. tabacum Planten

  1. N. groeien tabacum L. cv. Petit Havana SR1 planten op de bodem, plaatst tabak zaden op de juiste potten gevuld met normale potgrond voor kieming. Na 2 weken overdragen zaailingen individuele potten. Incubeer planten in een kas met een constante 22 ° C (donkere periode) of 25 ° C (licht periode) en 70% relatieve luchtvochtigheid. Zorg voor verlichting in een 16/8 uur licht / donker-cyclus (bv. Philips IP65 400 W lampen, 180 micromol · sec -1 · m -2; λ = 400-700 nm) en water dagelijks.

2. Transient Expressie van TrCel5A en TrCel5A-mCherry Eiwitten

  1. Onder steriele omstandigheden, pick enkele kolonies van Agarobacterium tumefaciens (GV3101 :: pMP90RK gmr, KmR, RifR) die ofwel pTRAkc-ER-TrCel5A of pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry en transfer naar een erlenmeyer met 10 ml gistextractbouillon (YEB, bereid volgens specificaties van de fabrikant) medium en kanamycine (50 mg / ml), rifampicine (50 mg / ml) en carbenicilline (100 mg / ml) voor selectie. Incubeer 36-40 uur bij 26 ° C en 180 rpm. Opmerking: Het ontwerpen van passende constructies voor eiwitexpressie is buiten het bestek van dit artikel, maar voor begeleiding kunnen de werkwijzen van Maclean et al. 13 en Munro en Pellham 14 worden gevolgd voor construct ontwerp..
  2. Neem 200 pi van elke cultuur 20 ml YEB inoculeren met antibioticum concentraties bovengenoemde en incuberen onder dezelfde omstandigheden als hiervoor.
  3. Na 36-40 uur, preinduce de kweken door toevoegen van 2 pl acetosyringon (200 uM eindconcentratie), 100 pl 40% (w / v) glucoseoplossing en 200 gl 1 M MES-buffer pH 5,6. Incubeer overnacht.
  4. Bereid 100 ml 2x infiltratie buffer (100 g / L sucrose, 3,6 g / L glucose, 8,6 g / l Murashige en Skoog basale zouten, Breng de pH op 5,6 met behulp van kaliumhydroxide).
  5. Meet OD 600 van de kweken met 1:05 verdunningen tot deze een OD600 van 5-6 bereikt. Bereken cultuur benodigde volume 30 ml infiltratie medium bij OD 600. Voeg 15 ml 2x infiltratie buffer, voeg dan gedemineraliseerd H 2 O om de buffer te maken tot 30 ml.
  6. Neem planten uit de kas en gebruik een pipet tip om nick de abaxiale kant van de 3e tot 5e blad van de top naar infiltratie verlichten.
  7. Gebruik een pipet tip om nick de abaxiale kant van de bladeren om infiltratie te verlichten.
  8. Vul een spuit met infiltratie medium en zet het (zonder naald) op een van de eerder gemaakte nicks. Ondersteunen spuit met een vinger op de adaxiale blad zijde. Druk het medium voorzichtig in het weefsel van Intraveneuze blad zones. Opmerking: Na infiltratie cultiveren planten in een kas onder dezelfde omstandigheden als hierboven beschreven. Ook, maar ook een gelijk aandeel van untrat 's avonds, niet-transiënte expressie planten (NTEPs) als controles, onder dezelfde voorwaarden als geïnfiltreerd planten.

3. Beoordeling van TrCel5A-mCherry Expressie in Plant Leaves

  1. Na 4-6 dagen, nemen planten geïnfiltreerd met A. tumefaciens met pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry uit de kas en leg ze in een donkere kamer voor fluorescentie analyse.
  2. Om de fluorescentie te visualiseren in blad secties uitdrukken TrCel5A-mCherry, licht planten met behulp van een draagbare lichtbron emitting groen licht bij 515 nm met een rode filter (620-750 nm). Opmerking: In diepte karakterisering van eiwit expressie in de plant bladeren kunnen worden bereikt door dunne-snijden bladeren met een vibratoom en onderzoek onder licht en fluorescentie microscopie. Hiervoor volgt u de onderstaande stappen:
    1. Snijd kleine secties van ongeveer 5 x 5 mm grootte van een geïnfiltreerd blad en insluiten in 4% agarose opgelost in 50 mM fosfaatbuffer (pH 5,7).
    2. Gesnedensectie van 80-90 micrometer grootte van ingesloten bladeren met behulp van een vibratome. Leg ze op een microscoop dia, dek af met buffer of een dekglas en onderzoekt ze met behulp van een microscoop bij een vergroting van 10x met een fluorescentie detector, met dezelfde golflengte en filter hierboven vermeld.

4. TrCel5A Winning Tabaksbladeren

  1. Snijd stukken uit tabaksbladeren tot een gewicht van 1 g bij benadering uit planten geïnfecteerd met A. tumefaciens met pTRAkc-ER-TrCel5A en plaats in een mortier voorgekoeld met vloeibare stikstof. Voeg een geschikte hoeveelheid vloeibare stikstof aan de monsters. Grind laat tot poeder met behulp van een voorgekoeld stamper.
  2. Voeg 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride de grond bladkwestie en meng tot het meeste blad materie in suspensie. Centrifugeer extract bij 15.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en te-eiwit bevattende supernatant.
  3. Centrifuge het extract bij 15.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en te-eiwit bevattende supernatant voorzichtig de pellet te verstoren. Gooi de pellet.
  4. Gedeeltelijk zuiveren TrCel5A door het incuberen van het eiwit bevattende supernatant bij 55 ° C gedurende 10 minuten. Laat rusten bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Herhaal gedeeltelijke zuivering van niet-geïnfiltreerde planten controlemonsters verkrijgen. Gebruik deze monsters voor alle volgende experimenten. Opmerking: Eiwit oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 week bij -20 ° C maximaal 3 maanden.
  5. Herhaal de gedeeltelijke zuivering van niet-geïnfiltreerde planten controlemonsters verkrijgen. Gebruik deze monsters voor alle volgende experimenten. Opmerking: Eiwit oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 week bij -20 ° C maximaal 3 maanden.

5. SDS-PAGE, Western blotting, en Azo-CMC zymografie van TrCel5A-mCherry </ P>

  1. Aankoop of bereid 12% (w / v) SDS-PAGE gels volgens gevestigde methoden 15.
  2. CMC oplossen in water tot een 1,5% (w / v) oplossing. CMC-SDS-PAGE gels maken, vervangen 1 ml 1,5% CMC 1 ml water in 10 ml SDS-PAGE-gel mix oplossing, resulterend in een 0,1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) SDS-PAGE gel mix. Giet gel normaal. Opmerking: Zorg ervoor dat de CMC in de oorspronkelijke oplossing volledig is opgelost door een combinatie van roeren en verwarmen tot 40 ° C (herhalen direct voorafgaand aan de voorbereiding van de gel-oplossing).
  3. Denatureren monsters door koken in de aanwezigheid van SDS, volgens vastgestelde methoden 12. Als een positieve controle, gebruikt een 1:500 verdunning van een in de handel verkrijgbaar mengsel van cellulase T. reesei, zoals T. reesei ATCC 26921. Als negatieve controle gebruikt een vergelijkbare wijze bereid eiwitoplossing van niet-geïnfiltreerde bladeren (NTEPs).
  4. Voer de elektroforese als per normale protocollen 15,bijvoorbeeld gebruiken 200 V ~ 50 min met de elektroforese gestopt wanneer de kleurstof voorkant tot de onderkant van de gel.
  5. Vlekken op een SDS-PAGE-gel met 0,1% (w / v) Coomassie brilliant blauw en destain met methanol / ijsazijn. Opmerking: Snelle kleuren en ontkleuren kan worden uitgevoerd door voorzichtige verwarming kleuring en ontkleuren oplossingen, dat wil zeggen met een magnetron ~ 15 seconden eerst warm (maar niet koken) kleuring en het ontkleuren oplossingen, veranderen de ontkleuroplossing na 10 min , of wanneer gekoeld, en herhaal met nieuwe ontkleuroplossing.
  6. Voer Western blot van een SDS-PAGE gel met vastgestelde protocollen 16,17. Gebruik de volgende antilichamen: een polyklonaal konijn antilichaam tegen een His-tag (primair) en een polyklonaal geit anti-konijn antilichaam Fc-gebied dat is geconjugeerd aan een alkalische fosfatase (secundaire). Opmerking: secondaire antilichamen worden gekozen visualisatie mogelijk gebruik nitroblue tetrazoolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-indolyphosphate p-toluidine zout (NBT / BCIP), zoals beschreven 18.
  7. Voer in-gel proteïne hervouwing van 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-gel door het incuberen van de gel in 1,5% (w / v) β-cyclodextrine, 20 mM fosfaat-citraatbuffer, pH 6,5, bij kamertemperatuur zacht schudden gedurende 15 minuten 19.
  8. Gooi de β-cyclodextrine oplossing Spoel even de gel met H2O Incubeer bij kamertemperatuur in 50 mM natriumacetaatbuffer (pH 4,8) gedurende een verdere 15 minuten. Voer CMC zymografie met het hervouwen 0,15% CMC SDS-PAGE-gel door het incuberen van de gel in 30 mM natriumacetaat buffer pH 4,8 gedurende 20 minuten bij 50 ° C.
  9. Voer CMC zymografie met het hervouwen 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-gel door het incuberen van de gel in 30 mM natriumacetaatbuffer (pH 4,8) gedurende 20 min bij 50 ° C.
  10. Vlekken op de gel gedurende 10 minuten met een 0,1% gew / vol oplossing Congo rood en destain gedurende 30 minuten of totdat duidelijke banden worden waargenomen met behulp van 1 M NaCl. Was de gel met 0,3% (v / v) azijnzuur duidelijkere beeldvorming.

6. 4-MUC activiteit Assay van TrCel5A

  1. Bereid een voorraad oplossing van 10 mM 4-MUC in 50% (v / v) methanol, en bewaar deze in het donker bij kamertemperatuur
  2. Onmiddellijk voorafgaand aan de test, bereiden een 4-MUC 2x werkende oplossing, bestaande uit 1 mm 4-MUC en 60 mM natriumacetaat, pH 4,8.
  3. Voer deze test monsters die 100 gl blad eiwit (met of zonder TrCel5A induceerbaar expressie), 100 pi van een commercieel verkrijgbaar mengsel van cellulase T. reesei 1:1000 en zuivere H2O respectievelijk. Run elk monster in drievoud.
  4. Pipetteer 100 ul van de 4-MUC werkoplossing in afzonderlijke putjes van een 96-well plaat, voeg 100 ul van elk monster.
  5. Bepaal 0 min tijdpunt van 4-MU fluorescentie door fluorescentie spectroscopie, met een excitatiegolflengte van 360 nm en een emissiegolflengte van 465 nm.
  6. Incubeer de platen gedurende 20min bij 50 ° C, bedekt met lijm deksels om verdamping te voorkomen. Stop de reactie door bevriezing (of door combinatie van 100 pi 0,15 M glycine, pH 10,0, en 100 gl monster in een afzonderlijke plaat).
  7. Bepaal het eindpunt van 4-MU fluorescentie door fluorescentie spectroscopie, met een excitatiegolflengte van 360 nm en een emissiegolflengte van 465 nm. Trek 0 min van eindpunt (20 min) tijdpunt de verandering in fluorescentie waarden te komen.

7. Azo-carboxymethylcellulose activiteit Assay van TrCel5A

  1. Bereid een voorraad van 1,5% (w / v) Azo-CMC wordt opgeslagen bij kamertemperatuur en een neerslag oplossing die 18 mM zinkacetaat, 0,5 M natriumacetaat, pH 5 en 80% ethanol (v / v), opslag bij kamertempera temperatuur.
  2. Vlak voor de test bereidt een Azo-CMC 2x werkoplossing, bestaande uit 1% (w / v) Azo-CMC (in H2O) en 60 mM natriumacetaat, pH 4,8.
  3. Combineer 50 pi monster en 50 ul van de werking oplossing in 1,5 ml buizen.
  4. Testmonsters die 50 ul blad eiwit (met of zonder TrCel5A tijdelijk tot expressie); 100 pi van een commercieel verkrijgbaar mengsel van cellulase T. reesei verdund 1:1000; en zuiver H2O Run monsters en standaarden in drievoud.
  5. Incubeer monsters gedurende 20 minuten bij 50 ° C. Stop de reactie door toevoeging van 250 ul van neerslag oplossing. Vortex elk monster krachtig gedurende 10 seconden te waarborgen oplossingen werden volledig gecombineerd.
  6. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en daarna weer vortex. Centrifugeer monsters bij 1000 xg gedurende 10 minuten. Verwijder 200 pi van elk monster supernatant van een 96-well plaat, verzorgen de pellet te verstoren.
  7. Assay middels absorptie spectroscopie bij een golflengte van 590 nm.

8. PAHBAH Assay van TrCel5A

  1. Gebruik een hole-punch om een ​​cirkel (~ 5,5 mm diameter) van de filter papier te snijden. Voeg 100 ul 60 mM NaAc, pH 4,8, en 100 pl monsters, hetzij met blad eiwit (met of zonder TrCel5A induceerbaar expressie) of een commercieel T. reesei cellulase mengsel verdund 1:1000 en incubeer met filtreerpapier cirkels gedurende 20 uur bij 50 ° C met 300 rpm schudden. Voor elk monster geïncubeerd met filterpapier, ook uitbroeden een duplicaat oplossing zonder papieren filter als individuele steekproef-controles.
  2. Bereid een 330 mM p-hydroxybenzoëzuur hydrazide (PAHBAH) oplossing A door oplossen PAHBAH in H2O onder toevoeging van 5 ml geconcentreerd HCl gedurende een totaal van 100 ml oplossing, en bewaar bij kamertemperatuur. Opmerking: De beste resultaten worden bereikt door het toevoegen van de HCl tot een kleiner volume PAHBAH suspensie, namelijk 30 ml, die is geroerd onder temperatuur oplossen helpen alvorens het volume op 100 ml met H2O
  3. Bereid PAHBAH oplossing B, die 50 mM natriumcitraat, 10 mM calciumchloride, en 500 mM NaOH en bewaar bij kamertemperatuur.
  4. Immediately voorafgaand aan de test bereid een 1.5x werkoplossing van 1 ml PAHBAH reagens 9 ml bufferoplossing, opslag tot gebruik op ijs (te gebruiken binnen 4 uur).
  5. Bereid monsters thermostabiele 0,2 of 0,5 ml buizen. Combineer 5 ui van elke oplossing geïncubeerd met filtreerpapier (stap 8.1) 45 ui H2O en 100 ui PAHBAH werkoplossing. Voorbeeld controles (monsters geïncubeerd zonder filterpapier) worden uitgevoerd onder dezelfde concentraties (5 pl monster, 45 pl H2O, 100 pl PAHBAH werkoplossing). Ook testen 5 normen (5 ui) die tussen 0 en 0,2 g / l glucose en zuiver H2O Run monsters en standaarden in drievoud.
  6. Incubeer monsters gedurende precies 10 minuten bij 100 ° C, daarna afgekoeld bij kamertemperatuur gedurende precies 10 minuten. Pipetteer oplossingen in een plaat met 96 putjes en spectroscopisch onderzoek bij een golflengte van 410 nm. Aftrekken individuele sample-controles (geïncubeerd zonder papieren filter) van monsters definitief te verkrijgenwaarden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TrCel5A en TrCel5A-mCherry succesvol in tabaksplanten uitgedrukt in het tijdelijke expressiesysteem (Figuren 1A en 1B). Onderzoek van het expressiepatroon van de TrCel5A-mCherry fusie-eiwit onthulde gezonde bladeren (figuur 1C), die wijdverspreid eiwitexpressie onder groen licht (figuur 1D) toonde.

Extractie van totaal oplosbare proteïnen werd uitgevoerd op tabak planten die bladeren die bevatte had tijdelijk tot expressie TrCel5A eiwit en SDS-PAGE toonde een grote verscheidenheid van eiwitten aanwezig waren (Figuur 2A, laan 1). De totale oplosbare eiwit monster uit TrCel5A expressie planten en totaal oplosbaar eiwit monster afkomstig van NTEPs, werden gedurende 10 minuten bij 55 ° C. TrCel5A stabiel en actief bij 55 ° C terwijl vele andere (natieve tabak) eiwitten niet stabiel bij deze temperatuur. Zo veel niet-essentiAl eiwitten werden geprecipiteerd door deze behandeling, waardoor een gedeeltelijk gezuiverd monster van TrCel5A. Na deze thermische precipitatie-stap werd een sterke eiwitband waargenomen bij ~ 40 kDa (Figuur 2A, laan 1). Dit is waarschijnlijk het katalytische domein (CD) van de TrCel5A, die eerder aangetoond is om met deze grootte bij expressie in planten 4 zijn. De negatieve en positieve controlemonsters (Figuur 2A, lanen 3 en 4 respectievelijk) toonden lage concentraties van resterende thermo-tolerante tabak eiwitten uit NTEPs (negatieve controle, Figuur 2A, laan 3) en meerdere banden aangeeft een mengsel van T. reesei eiwitten (positieve controle, Figuur 2A, baan 4).

De grootte van het TrCel5A werd bevestigd door antilichaam kleuring gericht tegen de His-6tag opgenomen in de TrCel5A C-terminus, die werd gezien afwezig beide controles (figuur 2B) zijn. De TrCel5A werd aangetoondendoglucanase activiteit behouden CMC zymografie (fig. 2C, lanen 1 en 2), waarbij de opnieuw gevouwen proteïne creëerde een sterk open plek, aangeeft CMC degradatie, op dezelfde hoogte als de Coomassie gekleurde SDS-PAGE-gel en Western blot. Geen activiteit werd waargenomen voor de niet-cellulase eiwit mengsels van NTEPs (Figuur 2C, baan 3), en het mengsel van T. reesei eiwitten uitgevoerd als een positieve controle vertoonde endoglucanase activiteit van meerdere componenten (fig. 2C, laan 4).

Om de cellulolytische activiteit van TrCel5A drie assays werden gebruikt kwantificeren. Ten eerste, de afbraak van 4-MUC werd geanalyseerd door om het toegenomen fluorescentie-emissie bij 465 nm (geëxciteerd bij 360 nm) van de vrijgemaakte 4-MU. TrCel5A bleek 4MUC degraderen, evenals een 1:1000 verdunning van een in de handel verkrijgbaar mengsel van T. reesei cellulase (Figuur 3A).

Een kwantificeerbare analysede activiteit van TrCel5A tegen CMC werd uitgevoerd door meting van de afgifte van een azo-kleurstof bij 590 nm van Azo-CMC. TrCel5A activiteit onder deze omstandigheden was gelijk aan activiteit om een 1:1000 verdunning van bovengenoemde (Figuur 3B) genoemd cellulase mengsel.

Het vermogen van TrCel5A filterpapier degraderen werd ook geanalyseerd. Voor deze test werd een eerste versuikering test uitgevoerd (namelijk de TrCel5A oplossing afbrekende het filtreerpapier) en de bovenstaande vloeistof werd geanalyseerd door de PAHBAH bepaling van de hoeveelheid reducerende suikers model (Figuur 3B) bepalen.

Figuur 1
Figuur 1. Plantenexpressievectoren cassettes voor TrCel5A bouwt en heterologe expressie van TrCel5A-mCherry in tebacco verlaat gevisualiseerd door fluorescentie onder groen licht. Schematische voorstelling van de plant expressiecassette gebruikt voor TrCel5A (A) en TrCel5A-mCherry (B) worden getoond. Na voorbijgaande TrCel5A-mC expressie, werden tabaksbladeren onderzocht onder normale (C) of groen licht (D). Voor panelen (A) en (B) de CaMV promotor (P35SS) en terminator signaal (pA35S) zijn aangegeven in lichtblauw. 5'-UTR van chalcon synthase (CHS), en de His6 coderende sequentie (His6) zijn aangegeven in blauw. De plant-codon geoptimaliseerde leader peptide (LPH) afgeleid van de zware keten van het muizen mAb24 is weergegeven in groen. LPH bereikt de uitscheiding van het recombinante eiwit naar de apoplast, waarna een C-terminale KDEL signaal aangegeven in rood, vertraagt ​​het eiwit de ER. Pijlen etiket van de bindingsplaats voor primer om de CaMV 35SS expressiecassette versterken. Voor panelen (C) en (D) het groene licht had een excitatie 515 nm.Beelden werden genomen zonder vergroting.

Figuur 2
. Figuur 2 grootte en activiteit van TrCel5A getoond door SDS-PAGE, Western blotting, en CMC zymografie Scheiding van het totale oplosbare eiwit:. Van tabaksplanten waar TrCel5A transiënt tot expressie werd voor (1) en na (2) thermische precipitatie zuivering; van tabaksplanten waar TrCel5A niet aanwezig, ook na thermische neerslag (3); of van een in de handel verkrijgbaar mengsel van T. reesei cellulase (4). SDS-PAGE gescheiden eiwitten worden gevisualiseerd met Coomassie Blue kleuring (A), Western blotting tegen de His-tag regio TrCel5A (B), en de cellulase-activiteit getoond door zymografie met CMC gevisualiseerd met Congo rood (C). PageRuler Plus(Fermentas) werd toegepast als het molecuulgewicht merker (M).

Figuur 3
Figuur 3. Enzymactiviteit kwantificering van TrCel5A. TrCel5A werd geïncubeerd met 4-MUC (A), Azo-CMC (B) en filterpapier (C) en het substraat afbraak gemeten door afgifte van de fluorofoor 4-MU (A), een azo-kleurstof (B), of door het kwantificeren van reducerende suikers door monitoring van de kleurverandering van PAHBAH (C). Elke test toont de resultaten voor drie herhalingen. Fout balken geven de standaarddeviatie. In alle drie de tests de geanalyseerde monsters waren alleen buffer, TrCel5A na thermische neerslag zuivering, NTEP (WT Nt) na thermische precipitatie zuivering, en een in de handel verkrijgbaar mengsel van T. reesei cellulases.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Recombinante expressie van cellulasen is een gebied van groot belang, vanwege het verlangen naar efficiëntere biobrandstoffen productiesystemen 1. Planten bieden vele mogelijkheden voor een succesvolle cellulase productie, met functies zoals economische oogsttechnieken en autohydrolysis methoden zeer wenselijke eigenschappen voor grootschalige productie van biobrandstoffen. Verder, het gebruik van verschillende lokalisaties voor het produceren van eiwitten toestaan, indien nodig, posttranslationele modificaties 20. Het wijzigen planten constitutieve expressie van cellulasen mogelijk, terwijl het duidelijke voordelen, een tijdrovende werkwijze die al dan niet succesvol zijn. Technieken zoals vastlegging van de tot expressie gebrachte eiwitten en induceerbare expressie mechanismen de kans op succesvolle cellulase productie in planten, maar deze nog wel vele maanden vast te stellen. Hier worden transiënte expressiewerkwijzen aangetoond aan de mogelijke specifieke cellulase illustrerenbinnen enkele dagen worden geproduceerd door plantensystemen.

Een fusie met het fluorescerende eiwit mCherry werd hier gebruikt om het succes van de transiënte eiwitexpressie methoden tonen. TrCel5A-mCherry was duidelijk verdeeld over de meerderheid van de bladeren die waren geïnfiltreerd met de vector-bevattende Agrobacteria. Lokaliseren van het endoplasmatisch reticulum maakt posttranslationele modificaties van het tot expressie gebrachte eiwit. Het vermogen van een expressiesysteem zoals glycosylering mogelijk is bijzonder belangrijk voor de cellulasen die oorspronkelijk afkomstig zijn van fungale organismen, zoals T. reesei 21. Gistexpressiesystemen, die worden steeds populairder voor heterologe cellulase expressie, vaak leiden tot hyper-glycosylering van de enzymen, die wordt gedebatteerd om een potentiële belemmering voor volledige cellulase-activiteit 22 zijn. Plant glycosylering mechanismen eenopnieuw zonder het nadeel van hyper-glycosylering. Bovendien expressie in plantensystemen maakt lokalisatie gebieden waarmee of die posttranslationele modificaties niet toe, waardoor afstemmen om de bron van het eiwit. Het systeem hier getoond kunnen ook worden gebruikt, door toepassing van verschillende signaalsequenties 14 voor lokalisatie naar de apoplast, chloroplast, cytosol en Golgi blaasjes. Het gebruik van fluorescente proteïne fusies, zoals TrCel5A-mCherry, kan het succes van eiwitexpressie en de lokalisatie van het eiwit aantonen. Echter worden dergelijke conjugaten niet nodig is voor verdere activiteitstesten. Daarom wordt aanbevolen dat een niet-mCherry TrCel5A construct worden gebruikt voor alle verdere tests, zoals hier is afgebeeld, om nauwkeuriger gegevens over de activiteiten van het tot expressie cellulase verkrijgen. Wat betreft besturingen voor verdere experimenten worden monsters van niet-transient geïnfiltreerd planten vaak bekeken om adequate controles zijn.

5. Zymografie analyse van activiteit tegen CMC aangegeven dat de overige peptide actief als endoglucanase. Terwijl de SDS-PAGE en Western blotting zijn zeer vaak assays, CMC zymografie is een veel meer specifieke test voor cellulase (en in het bijzonder endoglucanase) activiteit. Enkele belangrijke factoren om in gedachten te houden voor een succesvolle zymografie resultaten zijn a) dat het substraat (in dit geval CMC) moet volledig oplosbaar zijn en verspreid gelijkmatig over de gel; b) dat het eiwit moet succes worden hervouwen, bij voorkeur in een korte periode de hoeveelheid eiwit diffusie beperkt door de gel; en c)de activiteit test moet op de optimale temperatuur voor het enzym wordt geanalyseerd (bij TrCel5A tussen 50 en 60 ° C) en een korte scherper banden van degradatie mogelijk moet zijn.

Kwantitatieve analyse van de cellulase activiteit van tot expressie TrCel5A aangetoond dat het enzym actief was tegen een reeks substraten, waaronder 4-MUC, CMC en filtreerpapier. Elk van de substraten werd onderzocht met behulp van een andere spectroscopische test, hetzij via een fluorofoor (4-MU) of door lichtverstrooiing analyse van een kleur reactie (Azo-kleurstof of PAHBAH). Alle drie substraten en assays worden veel gebruikt voor de beoordeling van cellulase-activiteit en zijn relatief eenvoudig assays. 4-MUC wordt gebruikt als een basis substraat glycosyl hydrolase activiteit te bepalen, als een groot aantal van deze enzymen (endoglucanasen, exoglucanasen en β-glucosidase) werkzaam tegen zijn. De snelheid van de assay beperkt aantal eisen, hoge gevoeligheiden het vermogen van veel cellulases aan de ondergrond kleven, maakt dit een nuttige test voor algemene screening voor cellulasen, of voor het sonderen van het succes van een expressie run. Een punt in gedachten te houden bij het gebruik van 4-MUC is dat dit substraat is bijzonder geschikt voor de activiteit van β-glucosidasen, waardoor de activiteit van endoglucanasen (zoals TrCel5A) of exoglucanasen verschijnen zwak in vergelijking met enzymen of mengsels β-glucosidase die bevatten β-glucosidase. Bij het uitvoeren van een 4-MUC assay met lage concentraties eiwit of anderszins lage activiteit wordt aanbevolen de toevoeging van glycine (pH 10) gebruiken als een stop oplossing de pH verandering verhoogt de fluorescentie van 4-MU. CMC is een specifiek substraat voor het enzym hier uitgedrukt, aangezien het slechts wordt afgebroken door endoglucanasen. De Azo-CMC test is ingewikkelder dan die voor 4-MUC vanwege de noodzaak om precipitatie van de cellulose (en methanol) door zink. Het grote voordeel van dit substraat, en dus assay, Is dat het specifiek is voor endoglucanase-activiteit, waardoor het zeer nuttig voor het vaststellen van de aard van de cellulase geproduceerd. Filterpapier degradatie is een andere veelgebruikte test voor het vaststellen van cellulase-activiteit. De hoeveelheid waargenomen afbraak varieert sterk afhankelijk van de eigenschappen van de cellulase wordt beoordeeld, en is een voorkeurs substraat voor het onderzoeken van de activiteit van enzym mengsels. De PAHBAH test hier gebruikt filtreerpapier degradatie onderzocht, erkent de hoeveelheid vrijgemaakte suikers na versuikering en dus ook voor diverse modelsubstraten hier niet aangetoond, zoals CMC, lichenan, β-glucan, α-cellulose Avicel , xylan en xyloglucan. Voor deze test, moet erop worden gelet dat de normen op dezelfde plaat (of in dezelfde run) op te nemen als de monsters worden beoordeeld, zoals variatie in incubatietijd kan leiden tot verschillen in de resultaten. Het is daarom belangrijk om de analyse herhaald om nauwkeurigheid te garanderen. Bovendien, Een monstercontroleassay altijd worden uitgevoerd, wanneer het monster wordt geïncubeerd zonder cellulose substraat te controleren voor reducerende suikers van nature aanwezig in de monsters die kunnen worden geïdentificeerd door de PAHBAH en anders valse positieve resultaten.

Tenslotte worden werkwijzen voor tijdelijke expressie en karakterisering van een recombinant cellulase duidelijk aangetoond. Deze technieken bieden een eenvoudige manier om voldoende hoeveelheden eiwit te genereren voor verder onderzoek van een of meer cellulasen, met activiteitstesten zoals die hier gedemonstreerd. In het bijzonder bieden deze methodes een snelle manier om het potentieel van aangewezen cellulasen voor in planta productie onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse" en de Cluster of Excellence 'op maat uit biomassa ", dat wordt gefinancierd door de Excellence initiatief van de Duitse federale en deelstaatregeringen om de wetenschap te bevorderen en onderzoek aan Duitse universiteiten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside SIGMA-ALDRICH M6018
Acetic acid ROTH 3738
Acetosyringon (concentrated) ROTH 6003
Antibiotic - kanamycin ROTH T832
Antibiotic - rifampicin ROTH 4163
Antibiotic - carbenicillin ROTH 6344
Antibody - rabbit anti His(6) pAb ROCKLAND 600-401-382
Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb DIANOVA 111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose MEGAZYME S-ACMC
β-cyclodextrin SIGMA-ALDRICH C4805
Calcium chloride dihydrate SIGMA-ALDRICH C5080
Carboxymethyl cellulose ROTH 3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 SIGMA-ALDRICH C2730
Congo red SIGMA-ALDRICH 75768
Coomasie brilliant blue G 250 ROTH 9598.2
D(+)-glucose ROTH 8337
Ethanol ROTH K928
Filter paper - Rotilabo blotting paper ROTH CL67
NBT/BCIP SIGMA-ALDRICH 72091
MES buffer ROTH 4256
Methanol ROTH 8388
Sodium citrate ROTH 3580
Sodium dodecylsulfate SERVA 20765
Sodium hydroxide ROTH 6771
Soil, Einheitserde classic  PATZER GMBH
Spectrometer - Infinite M200 TECAN
Sucrose SIGMA-ALDRICH S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  SIGMA-ALDRICH H9882
Phosphate buffered saline ROTH 1058
UV light source - BLAK RAY UVP
Vibratome - VT1000S Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
  2. Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
  3. Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
  4. Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
  5. Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
  6. Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
  7. Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
  8. Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
  9. Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
  10. Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
  11. Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
  12. Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
  13. Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
  14. Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  16. Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
  17. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  18. Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
  19. Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
  20. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
  21. Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).

Tags

Environmental Sciences heterologe expressie endoplasmatisch reticulum endoglucanase cellulose glycosyl-hydrolase fluorescentie cellulase, Tabaksplanten
Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In tabaksplanten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garvey, M., Klinger, J., Klose, H.,… More

Garvey, M., Klinger, J., Klose, H., Fischer, R., Commandeur, U. Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants. J. Vis. Exp. (88), e51711, doi:10.3791/51711 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter