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Espressione ricombinante Cellulase Cel5A da Published: June 13, 2014 doi: 10.3791/51711
Automatic Translation
1, *1, *1, 2, 1
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology
* These authors contributed equally

Summary

Piante di tabacco sono stati usati per produrre una cellulasi fungine, TrCel5A, tramite un sistema di espressione transiente. L'espressione potrebbe essere monitorato utilizzando una proteina di fusione fluorescente, e l'attività della proteina è stata caratterizzata post-espressione.

Abstract

Enzimi degradanti Cellulosa, cellulasi, sono obiettivi sia di ricerca e di interessi industriali. La preponderanza di questi enzimi in-a-cultura difficili organismi, come funghi ife costruzione e batteri anaerobici, ha accelerato l'uso di tecnologie ricombinanti in questo campo. Metodi di espressione pianta sono un sistema desiderabile per la produzione su larga scala di enzimi e altre proteine ​​industrialmente utili. Qui, sono dimostrati metodi per l'espressione transitoria di un endoglucanasi fungina, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum. Espressione della proteina successo è mostrato, monitorato mediante fluorescenza utilizzando una proteina di fusione mCherry-enzima. Inoltre, una serie di test di base sono utilizzati per esaminare l'attività di transitoriamente espresso T. reesei Cel5A, compresi SDS-PAGE, Western blotting, zimografia, nonché fluorescenza e substrato saggi degradazione dye. Il sistema qui descritto può essere usato per produrre una cella attivaulase in un breve periodo di tempo, in modo da valutare il potenziale di ulteriore produzione in impianti attraverso sistemi di espressione costitutiva o inducibile.

Introduction

La degradazione della biomassa lignocellulosica e la sua conversione in combustibile liquido è stato immaginato come un metodo per ridurre la dipendenza dai combustibili fossili. Un ostacolo importante nella realizzazione di sistemi di elaborazione biomassa economicamente realizzabili è nella degradazione enzimatica della cellulosa ed emicellulosa 1. Sistemi di espressione vegetali mostrano un grande potenziale per la produzione di enzimi su scala industriale. Sistemi agricoli ad impianti di raccolta economicamente e di volume sono già stabiliti, come lo sono stati per migliaia di anni. La produzione di cellulasi in piante è desiderabile a causa di fattori come la facilità di autohydrolysis 2, e la possibilità di massimizzare l'uso degli enzimi inferiori aumentando la digeribilità delle pareti cellulari vegetali 1. Infine, sistemi vegetali consentono il targeting di proteine ​​ricombinanti ad aree specifiche di cellule vegetali e sono in grado di modificare posttranslationally enzimi ove richiesto 3.

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Nicotiana tabacum (tabacco) è molto comunemente usato come organismo modello per studi di espressione di proteine ​​eterologhe in piante, a causa della sua crescita e biomassa rapidi caratteristiche di accumulo 4. Espressione transiente di proteine ​​ricombinanti è una tecnica che permette la produzione di proteine ​​in brevi periodi di tempo 5, pur mantenendo la flessibilità nella localizzazione e quindi modificazioni post-traduzionali delle proteine ​​selezionate, cioè cellulasi. Ciò consente la produzione di cellulasi (s) per analisi di base, ponendo contemporaneamente le basi per ulteriori strategie di espressione in piante. Utilizzando tale strategia espressione transitoria, un'endoglucanasi da glicosil idrolasi famiglia 5, Cel5A, derivato dal ospitante fungina Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 è prodotta (di seguito denominato TrCel5A). TrCel5A è una proteina di kDa 42 che è nativo glicosilata ed è molto attivo in HYDroylzing catene di cellulosa 7.

La tecnica espressione transiente qui descritto è basato su un sistema relativamente comunemente usato, infiltrando la pianta lascia con Agrobacteria porta il gene di interesse in un vettore di espressione appropriato. Per consentire una rapida analisi di successo nell'espressione planta, TrCel5A può anche essere espresso come proteina di fusione con mCherry, una proteina fluorescente monomerica originariamente derivato da Discosoma sp. Proteine ​​DsRed 8, con l'aggiunta di sei residui di istidina (His-tag) fusi a il C-terminale (TrCel5A-mCherry). L'espressione della proteina di fusione eterologa, TrCel5A-mCherry, può quindi essere monitorato all'interno della pianta che cresce utilizzando luce verde per esaminare mCherry dispersione. Se lo si desidera, sezioni sottili di materiale vegetale può essere esaminato sotto luce verde al microscopio per stabilire la localizzazione specifica della proteina. Per questo lavoro, segnale e transit peptidi sono stati incorporati nel costrutto, di localizzare la proteina eterologa esportazione verso il reticolo endoplasmatico 9.

Per analizzare l'attività di cellulasi vegetali espresse, compreso TrCel5A, una serie di prove di attività cellulasi può essere eseguito. Dopo l'estrazione del totale delle proteine ​​vegetali solubili, TrCel5A può essere parzialmente purificato utilizzando una tecnica di incubazione termica. Dimensione proteina viene stabilita tramite SDS-PAGE seguita da Western blotting. Zimografia può essere utilizzato per analizzare l'attività contro substrati, ad esempio cellulosa che è stato carbossi-metilato (rendendo carbossimetil cellulosa: CMC) per solubilità 10. Attività cellulasi e glucosidasi può essere monitorato utilizzando il fluoroforo 4-metilumbelliferil (4-MU) associata a β-D-cellobioside (combinato: 4-MUC). Un altro metodo per valutare l'attività di endoglucanasi prevede l'analisi spettrometrica di CMC che è stata associata con un azo-dye (Remazolbrilliant Blu R) 11. Inoltre, l'attività della proteina di entrambi endoglucanasi e una gamma di cellulasi può essere monitorato mediante l'uso di un test di analisi zucchero, come l'idrazide p-idrossi benzoico (PAHBAH) saggio 12. Queste tecniche possono essere utilizzate per chiarire e quantificare l'attività della cellulasi espressa di interesse.

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Protocol

1. Crescita di Wild Type N. tabacum Piante

  1. Per crescere N. tabacum L. cv. Piante Petit Havana SR1 sul suolo, luogo semi del tabacco su pentole adeguate riempiti con normale terriccio per la germinazione. Dopo 2 settimane, il trasferimento piantine ai singoli vasi. Incubare le piante in una serra con costante di 22 ° C (periodo buio) o 25 ° C (periodo di luce) e 70% di umidità relativa dell'aria. Fornire illuminazione in un 16/8 ore di luce / buio ciclo (ad esempio Philips IP65 400 lampade W; 180 micromol · sec -1 · m -2; λ = 400-700 nm) e di acqua al giorno.

2. Espressione transiente di TrCel5A e TrCel5A-mCherry Proteine

  1. In condizioni sterili, scegliere singole colonie di Agrobacterium Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) contenenti sia pTRAkc-ER-TrCel5A o pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry e trasferimento in una beuta contenente 10 ml di estratto di lievitobrodo (YEB, preparato come da specifiche del costruttore) medio e kanamicina (50 mg / ml), rifampicina (50 mg / ml), e carbenicillina (100 mg / ml) per la selezione. Incubare per 36-40 ore a 26 ° C e 180 rpm. Nota: Il disegno di costrutti adeguati per l'espressione della proteina è al di fuori del campo di applicazione del presente documento, ma per l'orientamento, i metodi di Maclean et al 13, e Munro e Pellham 14 può essere seguito per la progettazione di costrutto..
  2. Prendere 200 ml di ciascuna coltura per inoculare 20 ml di YEB con le concentrazioni antibiotiche menzionati sopra e incubare alle stesse condizioni di prima.
  3. Dopo 36-40 ore, preinduce culture aggiungendo 2 microlitri acetosyringon (200 mM concentrazione finale), 100 ml 40% (w / v) di glucosio e 200 ml di 1 M MES tampone pH 5.6. Incubare per una notte.
  4. Preparare 100 ml di un tampone infiltrazione 2x (100 g / L di saccarosio, 3,6 g / L di glucosio, 8,6 g / L Murashige e Skoog sali basali, Aggiustare il pH a 5,6 con idrossido di potassio).
  5. Misurare OD 600 delle culture con diluizioni 1:5 fino a raggiungere un diametro esterno 600 di 5-6. Calcolare il volume cultura necessaria per 30 ml di mezzo infiltrazione OD a 600. Aggiungere 15 ml di tampone di infiltrazione 2x, quindi aggiungere H 2 O deionizzata per rendere il buffer fino a 30 ml.
  6. Prendere le piante da serra e utilizzare una punta della pipetta al nick il lato abaxial del 3 ° a 5 ° foglia dalla parte superiore per facilitare l'infiltrazione.
  7. Utilizzare un puntale al nick il lato abaxial delle foglie per facilitare l'infiltrazione.
  8. Riempire una siringa con mezzo infiltrazione e metterlo (senza ago) su una delle tacche precedenza. Sostenere siringa con un dito sul lato foglia adaxial. Premere con cautela il mezzo nel tessuto delle zone foglia interveinal. Nota: Dopo l'infiltrazione, coltivare piante in una serra nelle stesse condizioni sopra descritte. Inoltre, mantenere una quota uguale di untreated, piante non transitori di espressione (NTEPs) come controlli, alle stesse condizioni previste per gli impianti infiltrati.

3. Valutazione della TrCel5A-mCherry Expression in fogli vegetali

  1. Dopo 4-6 giorni, prendere le piante infiltrati con A. tumefaciens contenenti pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry dalla serra e metterli in una stanza buia per analisi di fluorescenza.
  2. Per visualizzare la fluorescenza nelle sezioni foglia esprimono TrCel5A-mCherry, impianti luce utilizzando una sorgente di luce portatile che emette luce verde a 515 nm con un filtro rosso (620-750 nm). Nota: In profondità Caratterizzazione dell'espressione proteica nelle foglie delle piante può essere ottenuto da foglie sottili-sezionamento con vibratome e esame sotto luce e microscopia a fluorescenza. Per questo attenersi alla seguente procedura:
    1. Tagliare piccole sezioni di circa 5 x 5 mm formato da una foglia infiltrato ed integrarli nel 4% agarosio disciolto in tampone fosfato 50 mM (pH 5,7).
    2. CutSezione di 80-90 micron dimensioni da foglie embedded utilizzando un vibratome. Sistemarle su un vetrino da microscopio, coprire con tampone o un coprioggetto ed esaminare utilizzando un microscopio a ingrandimento 10X con un rivelatore a fluorescenza, utilizzando la stessa lunghezza d'onda e filtro sopraindicato.

4. TrCel5A Estrazione di Foglie di tabacco

  1. Tagliare pezzi di foglie di tabacco per un peso di circa 1 g da piante infettate con A. tumefaciens contenenti pTRAkc-ER-TrCel5A e posto in un mortaio preraffreddato con azoto liquido. Aggiungere una quantità appropriata di azoto liquido per i campioni. Grind foglie in polvere con un pestello preraffreddato.
  2. Aggiungere 2 ml di tampone fosfato (PBS) contenente fluoro phenylmethylsulfonyl 1 mM alla materia foglia terreno e mescolare fino a quando la maggior parte della materia foglia è in sospensione. Estratto centrifugare a 15.000 xg per 20 min a 4 ° C e prendere proteici supernatante.
  3. Centrifuge l'estratto a 15.000 xg per 20 min a 4 ° C e rimessa proteici surnatante facendo attenzione a non disturbare il pellet. Eliminare il pellet.
  4. Parzialmente purificare TrCel5A incubando il supernatante contenente proteine ​​a 55 ° C per 10 min. Lasciar riposare a temperatura ambiente per altri 10 minuti, quindi si centrifuga a 15.000 xg per 10 minuti a RT. Ripetere parziale processo di purificazione per gli impianti non infiltrate per ottenere campioni di controllo. Utilizzare questi esempi per tutti i seguenti esperimenti. Nota: Le soluzioni proteiche possono essere conservati a 4 ° C fino a 1 settimana oa -20 ° C per 3 mesi.
  5. Ripetere il processo di purificazione parziale per gli impianti non infiltrate per ottenere campioni di controllo. Utilizzare questi esempi per tutti i seguenti esperimenti. Nota: Le soluzioni proteiche possono essere conservati a 4 ° C fino a 1 settimana oa -20 ° C per 3 mesi.

5. SDS-PAGE, Western Blotting, e Azo-CMC zimografia di TrCel5A-mCherry </ P>

  1. Acquistare o preparare il 12% (p / v) gel SDS-PAGE come da metodi stabiliti 15.
  2. Sciogliere CMC in acqua fino a (w / v) di 1,5%. Per rendere CMC-gel SDS-PAGE, sostituire 1 ml di 1,5% CMC per 1 ml di acqua in una soluzione di 10 ml di SDS-PAGE mix gel, risultando in un 0,1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) SDS-PAGE mix gel. Versare il gel normalmente. Nota: Assicurarsi che la CMC nella soluzione originale è completamente sciolto dalla combinazione di agitazione e riscaldamento a 40 ° C (ripetere direttamente prima della preparazione della soluzione di gel).
  3. Denaturare campioni per ebollizione in presenza di SDS, secondo metodi stabiliti 12. Come controllo positivo, utilizzare una diluizione 1:500 di una cellulasi miscela disponibile commercialmente da T. reesei, come T. reesei ATCC 26921. Come controllo negativo utilizzare una soluzione proteica simile preparati da foglie non infiltrate (NTEPs).
  4. Eseguire l'elettroforesi secondo normali protocolli 15,ad esempio uso 200 V per ~ 50 min con elettroforesi arrestato una volta che il fronte del colorante raggiunto il fondo del gel.
  5. Macchiare un gel SDS-PAGE usando 0,1% (w / v) blu brillante Coomassie e Destain utilizzando una miscela di acido glaciale metanolo / acetico. Nota: Rapid colorazione e decolorazione possono essere eseguite con blando riscaldamento la colorazione e decolorazione soluzioni, cioè usando un forno a microonde per ~ 15 sec per scaldare (ma non bollire) prima della colorazione e poi le soluzioni decolorante, cambiando la soluzione decolorante dopo 10 min , o una volta raffreddato, e ripetere con la nuova soluzione decolorante.
  6. Eseguire Western blotting di un gel SDS-PAGE utilizzando protocolli stabiliti 16,17. Utilizzare i seguenti anticorpi: un anticorpo policlonale di coniglio contro un anticorpo anti-coniglio regione His-tag (primario) e una capra policlonale Fc che è stato coniugato con fosfatasi alcalina (secondario). Nota: anticorpi secondari dovrebbero essere selezionati per consentire la visualizzazione utilizzando nitroblu tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-indolyphosphate sale p-toluidina (NBT / BCIP), come descritto 18.
  7. Eseguire in-gel proteico ripiegatura sul 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE gel incubando il gel in 1.5% (w / v) β-ciclodestrina, tampone fosfato-citrato 20 mM, pH 6,5, a temperatura ambiente con agitando delicatamente per 15 minuti 19.
  8. Eliminare la soluzione di β-ciclodestrina e lavare rapidamente il gel con H 2 O. Incubare a temperatura ambiente in 50 mM tampone acetato di sodio (pH 4,8) per altri 15 min. Eseguire CMC zimografia usando l'ripiegata 0,15% CMC SDS-PAGE gel incubando il gel in 30 mM acetato di sodio a pH 4,8 per 20 minuti a 50 ° C.
  9. Eseguire CMC zimografia usando l'ripiegata 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE gel incubando il gel in 30 mM tampone sodio acetato (pH 4,8) per 20 min a 50 ° C.
  10. Macchiare il gel per 10 minuti utilizzando un 0,1% w / v soluzione di rosso Congo e Destain per 30 minuti o fino a bande chiare sono osservati usando 1 M NaCl. Lavare il gel con 0,3% (v / v) di acido acetico per l'imaging più chiara.

6. 4 MUC Activity Assay di TrCel5A

  1. Preparare una soluzione stock di 10 mm 4-MUC nel 50% (v / v) di metanolo, e conservarla al buio a temperatura ambiente
  2. Immediatamente prima del test, preparare una soluzione di lavoro 4-MUC 2x, composto da 1 mM a 4 MUC e 60 mM acetato di sodio, pH 4,8.
  3. Eseguire il test su campioni contenenti 100 ml di proteina foglia (con o senza TrCel5A inducibile espressa), 100 microlitri di una miscela di cellulasi disponibile in commercio da T. 1:1.000 reesei, e pure H 2 O, rispettivamente. Eseguire ogni campione in triplicato.
  4. Dispensare 100 ml di soluzione di lavoro di 4 MUC in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti, quindi aggiungere 100 ml di ciascun campione.
  5. Determinare 0 min timepoint di 4-MU fluorescenza mediante spettroscopia a fluorescenza, utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 360 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm.
  6. Incubare le piastre per 20min a 50 ° C, coperto con coperchi adesivi per evitare l'evaporazione. Arrestare la reazione mediante congelamento (o combinando 100 ml 0,15 M glicina, pH 10,0, e 100 ml di campione in un piatto a parte).
  7. Determinare il punto finale di 4-MU fluorescenza mediante spettroscopia a fluorescenza, utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 360 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm. Sottrarre 0 min da endpoint (20 min) timepoint avere la variazione nei valori di fluorescenza.

7. Azo-carbossimetilcellulosa Activity Assay di TrCel5A

  1. Preparare uno stock di 1,5% (w / v) Azo-CMC che è conservato a RT, e una soluzione di precipitazione contenente 18 mM acetato di zinco, 0,5 M di acetato di sodio, pH 5 e 80% di etanolo (v / v), conservare a camera temperatura.
  2. Immediatamente prima del saggio, preparare una soluzione Azo-CMC 2x lavoro composto da 1% (w / v) Azo-CMC (in H 2 O) e 60 mM acetato di sodio, pH 4,8.
  3. Unire 50 ml di campione e 50 ml di lavoroing soluzione in provette da 1,5 ml.
  4. I campioni di prova contenenti 50 ml di proteina foglia (con o senza TrCel5A transitoriamente espressa); 100 ml di una cellulasi miscela disponibile commercialmente da T. reesei diluita 1:1000; e puro H 2 O. Eseguire i campioni e gli standard in triplice copia.
  5. Incubare campioni per 20 min a 50 ° C. Arrestare la reazione aggiungendo 250 ml di soluzione di precipitazione. Vortex ogni campione vigorosamente per 10 sec a garantire soluzioni sono state completamente combinati.
  6. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min e poi di nuovo vortice. Centrifugare i campioni a 1.000 xg per 10 min. Prelevare 200 ml di ogni campione di surnatante ad una piastra a 96 pozzetti, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
  7. Dosaggio con spettroscopia assorbanza alla lunghezza d'onda di 590 nm.

8. PAHBAH Tenore di TrCel5A

  1. Utilizzare un buco pugno di tagliare un cerchio (~ 5,5 millimetri di diametro), della carta da filtro. Aggiungere 100 microlitri NaAc 60 mM, pH 4,8, 1 e00 ml di campioni, sia contenenti proteine ​​foglia (con o senza TrCel5A inducibile espressa) o T. commerciali miscela cellulasi reesei, diluito 1:1000, e incubare con filtro cerchi di carta per 20 ore a 50 ° C con 300 rpm agitazione. Per ogni campione incubato con carta da filtro, incubare anche una soluzione duplicato senza carta filtro per singoli sample-controlli.
  2. Preparare una 330 mM p-idrossi idrazide dell'acido benzoico (PAHBAH) Una soluzione sciogliendo PAHBAH in H 2 O con l'aggiunta di 5 ml di HCl conc per un totale di 100 ml di soluzione, e conservare a RT. Nota: I migliori risultati si ottengono aggiungendo l'HCl in un volume più piccolo di PAHBAH slurry, cioè 30 ml, che viene agitata sotto della temperatura per la dissoluzione prima di effettuare il volume a 100 ml con H 2 O.
  3. Preparare PAHBAH soluzione B, contenente citrato di sodio 50 mM, 10 mM cloruro di calcio, e NaOH 500 mM e conservare a temperatura ambiente.
  4. Immediately prima del test, preparare una soluzione di lavoro 1.5x di 1 ml PAHBAH reattivo a 9 ml di soluzione tampone, negozio in ghiaccio fino al momento dell'uso (da utilizzare entro 4 ore).
  5. Preparare i campioni in termostabili 0,2 o 0,5 ml provette. Combinare 5 ml di ciascuna soluzione incubati con carta da filtro (passo 8.1) 45 ml di H 2 O e 100 ml di soluzione di lavoro PAHBAH. Controlli a campione (campioni incubati senza filtro di carta) devono essere eseguiti con le stesse concentrazioni (5 microlitri del campione, 45 ml di H 2 O, soluzione di lavoro 100 microlitri PAHBAH). Testare e 5 standard (5 mL) contenenti tra 0 e 0,2 g / L di glucosio, e puro H 2 O. Eseguire i campioni e gli standard in triplice copia.
  6. Incubare i campioni esattamente per 10 min a 100 ° C, poi raffreddare a temperatura ambiente per esattamente 10 min. Le soluzioni pipetta in una piastra da 96 pozzetti e dosaggio spettroscopiche ad una lunghezza d'onda di 410 nm. Sottrarre i singoli campioni-controlli (incubate senza filtro di carta) da campioni per ottenere finalevalori.

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Representative Results

TrCel5A e TrCel5A-mCherry sono stati espressi con successo in piante di tabacco usando il sistema di espressione transiente (Figure 1A e 1B). L'esame del modello di espressione della proteina di fusione TrCel5A-mCherry rivelato foglie sane (Figura 1C), che ha mostrato un'ampia espressione proteica sotto luce verde (Figura 1D).

Estrazione delle proteine ​​solubili totali è stata eseguita su piante di tabacco che avevano foglie che contenevano la proteina espressa transitoriamente TrCel5A e SDS-PAGE ha mostrato una grande varietà di proteine ​​presenti (Figura 2A, corsia 1). Il campione proteina solubile totale da TrCel5A esprimere piante e un campione di proteina solubile totale risultante da NTEPs, sono state incubate per 10 min a 55 ° C. TrCel5A rimane stabile ed attivo a 55 ° C, mentre molte altre tabacco (nativo) proteine ​​non sono stabili a questa temperatura. Così, molti non-essentiproteine ​​AL sono stati precipitati da questo trattamento, lasciando un campione parzialmente purificata di TrCel5A. Dopo questo passo termico-precipitazione, una forte banda di proteina è stata osservata a ~ 40 kDa (Figura 2A, corsia 1). Questo è probabilmente il dominio catalitico (CD) della TrCel5A, che è stato indicato in precedenza per eseguire al formato quando espresso in piante 4. Il negativo e positivo (Figura 2A, corsie 3 e 4, rispettivamente) campioni di controllo ha mostrato basse concentrazioni di proteine ​​rimanenti tabacco termo-tolerant dal NTEPs (controllo negativo, Figura 2A, corsia 3) e più bande che indica una miscela di T. proteine ​​reesei (controllo positivo, Figura 2A, corsia 4).

La dimensione del TrCel5A stata confermata mediante colorazione anticorpo diretto al His-6tag incorporato nel TrCel5A C-terminale, che è stato visto essere assente per entrambi i controlli (Figura 2B). La TrCel5A ha dimostrato dimantenere l'attività di endoglucanasi da CMC zimografia (figura 2c, corsie 1 e 2), dove la proteina ripiegata creata una forte zona libera, indicando CMC degradazione, alla stessa altezza come nel Coomassie tinto gel SDS-PAGE e Western blot. Nessuna attività è stata osservata per le miscele di proteine ​​non-cellulasi da NTEPs (Figura 2C, corsia 3), e la miscela di T. proteine ​​reesei eseguire come controllo positivo hanno mostrato attività di endoglucanasi da più componenti (Figura 2C, corsia 4).

Per quantificare l'attività cellulolitica di TrCel5A stati usati tre saggi. In primo luogo, la degradazione del 4-MUC stato analizzato osservando la maggiore emissione di fluorescenza a 465 nm (eccitato a 360 nm) dei rilasciati 4-MU. TrCel5A ha dimostrato di degradare 4MUC, come fece una diluizione 1:1000 di una miscela commercialmente disponibile di T. cellulasi reesei (Figura 3a).

Un'analisi quantificabiledell'attività di TrCel5A contro CMC è stato fatto misurando il rilascio di un Azo-colorante a 590 nm da Azo-CMC. TrCel5A attività in queste condizioni, era equivalente in un'attività ad una diluizione 1:1000 della miscela di cellulasi cui sopra (Figura 3B).

La capacità di TrCel5A di degradare carta da filtro è stato anche analizzato. Per questo test, è stato eseguito un saggio saccarificazione iniziale (cioè con la soluzione TrCel5A degradare la carta da filtro) e poi il surnatante è stato analizzato con il test PAHBAH per accertare il quantitativo di zuccheri riducenti chiarificati (Figura 3B).

Figura 1
Cassette di espressione Figura 1. Pianta per costrutti TrCel5A ed espressione eterologa di TrCel5A-mCherry in abacco lascia visualizzati mediante fluorescenza sotto luce verde. rappresentazioni schematiche della cassetta di espressione pianta usata per TrCel5A (A) e TrCel5A-mCherry (B) sono mostrati. Dopo espressione transiente TrCel5A-MC, foglie di tabacco sono stati esaminati in condizioni normali (C) o di luce verde (D). Per i pannelli (A) e (B) il promotore CaMV (P35SS) e il segnale di terminazione (pA35S) sono indicate in azzurro. 5'-UTR di calcone sintasi (CHS), e la sequenza codificante His6 (His6) è indicata in blu. Il codone ottimizzato peptide leader pianta (LPH) derivata dalla catena pesante della murino mAb24 è rappresentato in verde. LPH raggiunge la secrezione della proteina ricombinante per nell'apoplasto, dopo che un segnale KDEL C-terminale, indicata in rosso, ritarda la proteina alla ER. Frecce etichettano il sito di legame per primer per amplificare la cassetta di espressione CaMV 35SS. Per pannelli (C) e (D) la luce verde aveva una eccitazione 515 nm.Le immagini sono state scattate senza ingrandimento.

Figura 2
. Figura 2 Dimensioni e attività di TrCel5A dimostrato mediante SDS-PAGE, Western blotting, e CMC zimografia Separazione delle proteine ​​solubili totali:. Dalle piante di tabacco in cui è stato espresso transitoriamente TrCel5A prima (1) e dopo (2) purificazione precipitazione termica; da piante di tabacco in cui TrCel5A non era presente, anche dopo precipitazione termica (3); o di una miscela commercialmente disponibile di T. cellulasi reesei (4). Proteine ​​separate SDS-PAGE sono visualizzate con Coomassie blu colorazione (A), Western blotting contro la regione His-tag di TrCel5A (B), e l'attività di cellulasi dimostrato da zimografia utilizzando CMC visualizzati con Rosso Congo (C). PageRuler più(Fermentas) è stato utilizzato come marcatore di peso molecolare (M).

Figura 3
Figura 3. Enzyme attività quantificazione di TrCel5A. TrCel5A stata incubata con 4-MUC (A), Azo-CMC (B), e carta da filtro (C) e la degradazione del substrato misurata dal rilascio del fluoroforo 4-MU (A), un Azo-colorante (B), o quantificando zuccheri riduttori dal cambiamento di colore PAHBAH (C). Ogni saggio mostra i risultati di tre repliche. Le barre di errore indicano la deviazione standard. In tutti e tre i test i campioni analizzati sono tampone da solo, TrCel5A dopo purificazione precipitazione termica, NTEP (WT Nt) dopo purificazione precipitazione termica, e una miscela commercialmente disponibile di T. cellulasi reesei.

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Discussion

Espressione ricombinante di cellulasi è un campo di grande interesse, a causa del desiderio di più efficienti sistemi di produzione di biocarburanti 1. Le piante offrono molte possibilità per la produzione di cellulasi successo, con caratteristiche come le tecniche di raccolta economica e metodi autohydrolysis essendo proprietà molto desiderabili per la produzione di biocarburanti su larga scala. Inoltre, l'uso di diverse localizzazioni per la produzione di proteine ​​consentire, se necessario, modifiche post-traduzionali 20. Alterare piante per consentire l'espressione costitutiva di cellulasi, offrendo evidenti vantaggi, è un metodo di tempo che possono o non possono avere successo. Tecniche come sequestro delle proteine ​​espresse e meccanismi di espressione inducibili aumentano la probabilità di produzione di cellulasi successo nelle piante, tuttavia questi ancora molti mesi per stabilire. Qui, metodi di espressione transiente siano dimostrate per illustrare il potenziale per una cellulasi specificoessere prodotta attraverso sistemi vegetali nel giro di pochi giorni.

Una fusione con la proteina fluorescente mCherry stato usato qui per dimostrare il successo dei metodi di espressione proteica transitori. TrCel5A-mCherry era chiaramente distribuito tra la maggior parte delle foglie che erano state infiltrate con il vettore contenente Agrobacteria. Localizzazione al reticolo endoplasmatico consente modifiche post-traduzionali della proteina espressa. La capacità di un sistema di espressione per consentire ad esempio glicosilazione è particolarmente importante per quei cellulasi che sono originariamente derivati ​​da organismi fungini, come T. reesei 21. Sistemi di espressione di lievito, che sono sempre più popolari per l'espressione cellulase eterologa, spesso provocano iper-glicosilazione degli enzimi, di cui si discute ad essere un potenziale ostacolo alla piena attività cellulasi 22. Glicosilazione pianta meccanismi dire senza lo svantaggio di iper-glicosilazione. Inoltre, l'espressione nelle piante permette per la localizzazione di zone che consentono o non consentono modifiche post-traduzionali, permettendo così sartoria alla fonte della proteina. Il sistema mostrato qui può essere utilizzato anche, per l'applicazione di diverse sequenze segnale 14, per la localizzazione di nell'apoplasto, cloroplasti, citosol o Golgi vescicole. L'uso di fusioni di proteine ​​fluorescenti, come TrCel5A-mCherry, può dimostrare il successo di espressione proteica e la localizzazione della proteina. Tuttavia, tali coniugati non sono necessarie ulteriori prove di attività. Inoltre, si raccomanda che un costrutto non mCherry TrCel5A essere utilizzato per tutte le successive prove, come dimostrato qui, per ottenere dati più precisi di attività della cellulasi espresso. Per quanto riguarda i controlli per ulteriori esperimenti, campioni provenienti da piante non transitoriamente infiltrati sono comunemente visti come controlli adeguati.

5. Analisi zimografia di attività contro CMC indicato che il peptide rimanente era attivo come un'endoglucanasi. Mentre SDS-PAGE e Western blotting sono saggi estremamente comuni, CMC zimografia è un test molto più specifico per cellulasi (e in particolare endoglucanasi) attività. Alcuni fattori importanti da tenere a mente per i risultati zimografia di successo sono: a) che il substrato (in questo caso CMC) deve essere completamente solubilizzata e diffondere uniformemente in tutto il gel; b) che la proteina deve essere ripiegato con successo, preferibilmente in un breve periodo di limitare la quantità di proteina diffusione attraverso il gel; ec) cheil saggio di attività dovrebbe essere alla temperatura ottimale per l'enzima viene saggiato (per TrCel5A tra 50 e 60 ° C) e dovrebbe essere breve per permettere bande nitide di degradazione.

L'analisi quantitativa dell'attività di cellulasi espresso TrCel5A dimostrato che l'enzima era attivo contro una vasta gamma di substrati, compresi 4-MUC, CMC e carta da filtro. Ognuno dei substrati è stata esaminata usando una analisi spettroscopica diverso, sia tramite un fluoroforo (4-MU) o mediante analisi diffusione luminosa di una reazione colorimetrica (Azo-dye o PAHBAH). Tutti e tre i substrati e saggi sono ampiamente utilizzati per la valutazione delle attività cellulasi, e sono saggi in avanti relativamente semplice. 4-MUC viene utilizzato come substrato di base per determinare l'attività glicosil idrolasi, come una grande varietà di questi enzimi (endoglucanasi, exoglucanases e β-glucosidasi) sono attivi contro di essa. La velocità del dosaggio, numero limitato di requisiti, alta sensibilitàe la capacità di molti cellulasi per fendere il substrato, rende questo un test utile per lo screening generale per cellulasi, o per sondare il successo di una corsa espressione. Un punto da tenere a mente quando si utilizza 4-MUC è che questo substrato è particolarmente adatto per l'attività di β-glucosidasi, rendendo l'attività di endoglucanasi (come TrCel5A) o exoglucanases appare debole rispetto al β-glucosidasi o miscele enzimatiche che contengono β-glucosidasi. Quando si esegue un saggio 4 MUC con basse concentrazioni di proteine ​​o bassi livelli di attività altrimenti si raccomanda di utilizzare l'aggiunta di glicina (pH 10) come soluzione di arresto, come l'alterazione del pH aumenta la fluorescenza di 4-MU. CMC è un substrato più specifico per l'enzima espresso qui, come viene degradata solo endoglucanasi. Il saggio Azo-CMC è più complicata di quella per MUC-4, a causa della necessità per la precipitazione della cellulosa (e metanolo) di zinco. Il vantaggio principale di questo substrato, e quindi saggio, È che è specifico per l'attività di endoglucanasi, il che rende molto utile per stabilire la natura della cellulasi prodotta. Filtro degrado della carta è un altro test comune per stabilire l'attività cellulasi. La quantità di degradazione osservata varia significativamente dipendente dalle proprietà della cellulasi in corso di valutazione, ed è un substrato preferito per l'esame delle attività di miscele enzimatiche. Il saggio PAHBAH, qui utilizzato per esaminare filtro di carta degradazione, riconosce la quantità di zuccheri rilasciati dopo saccarificazione e così è applicabile ad una vasta gamma di substrati modello non dimostrato qui, tra CMC, lichenan, β-glucano, α-cellulosa, AVICEL anche , xilano e xyloglucan. Per questo test, occorre prestare attenzione per includere norme sulla stessa piastra (o nella stessa seduta) come campioni stati valutati come variazione nei tempi di incubazione può portare a differenze nei risultati. È quindi anche importante ripetere il dosaggio per assicurare la precisione. Inoltre,, Un controllo campione deve sempre essere eseguito, dove il campione viene incubato senza il substrato cellulosico, per controllare eventuali zuccheri riducenti naturalmente presenti nei campioni che possono essere identificate dal PAHBAH, e dia altrimenti risultati falsi positivi.

In conclusione, i metodi per l'espressione transiente e caratterizzazione di una cellulasi ricombinante sono chiaramente dimostrati. Queste tecniche forniscono un modo semplice per generare una quantità sufficiente di proteine ​​per ulteriore esame di uno o più cellulasi, utilizzando test di attività come quelle dimostrate qui. In particolare, questi metodi forniscono un modo rapido per esaminare il potenziale di cellulasi designati per la produzione in planta.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse" e il Cluster di eccellenza "Combustibili su misura da biomassa", che è finanziato attraverso l'iniziativa di eccellenza da parte dei governi federali e statali tedesche per promuovere la scienza e di ricerca presso università tedesche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside SIGMA-ALDRICH M6018
Acetic acid ROTH 3738
Acetosyringon (concentrated) ROTH 6003
Antibiotic - kanamycin ROTH T832
Antibiotic - rifampicin ROTH 4163
Antibiotic - carbenicillin ROTH 6344
Antibody - rabbit anti His(6) pAb ROCKLAND 600-401-382
Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb DIANOVA 111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose MEGAZYME S-ACMC
β-cyclodextrin SIGMA-ALDRICH C4805
Calcium chloride dihydrate SIGMA-ALDRICH C5080
Carboxymethyl cellulose ROTH 3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 SIGMA-ALDRICH C2730
Congo red SIGMA-ALDRICH 75768
Coomasie brilliant blue G 250 ROTH 9598.2
D(+)-glucose ROTH 8337
Ethanol ROTH K928
Filter paper - Rotilabo blotting paper ROTH CL67
NBT/BCIP SIGMA-ALDRICH 72091
MES buffer ROTH 4256
Methanol ROTH 8388
Sodium citrate ROTH 3580
Sodium dodecylsulfate SERVA 20765
Sodium hydroxide ROTH 6771
Soil, Einheitserde classic  PATZER GMBH
Spectrometer - Infinite M200 TECAN
Sucrose SIGMA-ALDRICH S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  SIGMA-ALDRICH H9882
Phosphate buffered saline ROTH 1058
UV light source - BLAK RAY UVP
Vibratome - VT1000S Leica

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References

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Scienze Ambientali espressione eterologa reticolo endoplasmatico endoglucanasi cellulosa glicosil-idrolasi fluorescenza cellulasi, piante di tabacco
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Garvey, M., Klinger, J., Klose, H., Fischer, R., Commandeur, U. Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants. J. Vis. Exp. (88), e51711, doi:10.3791/51711 (2014).

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