Summary
タバコ植物を、一過性発現系を介して、真菌セルラーゼ、TrCel5Aを作製した。発現は、蛍光融合タンパク質を用いてモニターすることができ、タンパク質活性を発現後に特徴付けた。
Abstract
セルロース分解酵素、セルラーゼは、研究と産業の利益の両方の標的である。このような菌糸構築真菌および嫌気性細菌などの難培養する生物におけるこれらの酵素の優勢は、この分野における組換え技術の使用を早めました。植物発現法は、酵素および他の工業的に有用なタンパク質の大規模生産のための望ましいシステムである。ここで、 ニコチアナ·タバカムにおける真菌エンドグルカナーゼ、 トリコデルマ·CEL5Aの一過性発現のための方法は、実証される。成功したタンパク質発現はmCherry-酵素融合タンパク質を用いて蛍光によってモニターし、示されている。さらに、基本的な一連のテストは、一過性に発現T.の活性を調べるために使用されているSDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、ザイモだけでなく、蛍光染料ベースの基質分解アッセイを含むデルマレー CEL5A、。ここで説明するシステムは、アクティブセルを製造するために使用することができる短時間でulase、構成的または誘導性発現系を介して植物におけるさらなる生産の可能性を評価するようになっている。
Introduction
リグノセルロース系バイオマスを液体燃料への変換の劣化が化石燃料への依存を低減する方法として想定されている。経済的に実現可能なバイオマス処理システムを確立する上での一つの重要なハードルは、セルロースとヘミセルロース1の酵素分解である。植物発現系は、工業的規模での酵素の産生のための大きな可能性を示している。彼らは何千年もの間あったように収穫植物経済的にもボリューム内の農業システムは、すでに確立されています。植物におけるセルラーゼの生産は、2自己加水分解の容易さ、および植物細胞壁1の消化率を増加させることによって、より低い酵素レベルの使用を最大にするための電位のような要因に望ましい。最後に、植物系は、植物細胞の特定の領域への組換えタンパク質の標的化を可能にし、翻訳後3を必要な酵素を変更することができる。
"ve_content>ニコチアナ·タバコ （タバコ）は非常に一般的に、その急速な成長とバイオマス蓄積機能4に、植物における異種タンパク質発現の研究のためのモデル生物として使用されます。組換えタンパク質の一過性発現が局在化および選択されたタンパク質の翻訳後修飾、したがって、 即ちセルラーゼのような柔軟性を維持しつつ、短時間5におけるタンパク質産生を可能にする技術である。また、植物における発現のさらなる戦略のための基礎を敷設しながら、基本的な分析のためのセルラーゼ（単数または複数）の産生を可能にする。このような一過性発現戦略を用いて、真菌宿主トリコデルマ·リーゼイ （ ハイポクレアジェコリーナ ）由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー5、CEL5A、6からエンドグルカナーゼ（以下TrCel5Aと呼ぶ）が生成される。 TrCel5Aはネイティブにグリコシル化されている42 kDaのタンパク質であり、HYDに高活性であるセルロース鎖7を roylzing。
ここで説明する一過性発現技術は、植物はアグロバクテリウムは 、適切な発現ベクターに目的の遺伝子を保有する葉浸潤、比較的一般的に使用されるシステムに基づいている。 インプランタ発現の成功の迅速な分析を可能にするために、TrCel5AもmCherry、本来ディスコソマ（Discosoma）種に由来する単量体の蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。タンパク質DsRedは8、さらに6ヒスチジン残基（Hisタグ）は、に融合してC末端（TrCel5A-mCherry）。異種融合タンパク質、TrCel5A-mCherryの発現は、このようにmCherryの分散を調べるために緑色光を用いて成長した植物内で監視することができる。所望であれば、植物材料の薄い部分は、タンパク質の特異的な局在を確立するために顕微鏡的に緑色光下で検査することができる。この作品、信号TRANのため座るペプチドは、小胞体から9異種タンパク質輸送をローカライズするために、構築物に組み込まれた。
TrCel5Aを含む植物発現セルラーゼの活性を分析するために、セルラーゼ活性試験の数を実行することができる。全可溶性植物タンパク質を抽出した後、TrCel5Aは、部分的に熱インキュベーション法を用いて精製することができる。タンパク質サイズは、ウェスタンブロッティング、続いてSDS-PAGEを使用して確立される。溶解度10：ザイモグラフィーはカルボキシメチル化（CMCカルボキシメチルセルロースの製造）されたセルロース、例えば 、基質に対する活性を分析するために使用することができる。セルラーゼとグルコシダーゼ活性は、（4-MUC合わせた）β-D-セロビオシドに関連付けられたフルオロフォア4 - メチルウンベリフェリル（4-MU）を使用してモニターすることができる。エンドグルカナーゼ活性を評価するための別の方法は、アゾdで関連付けられているCMCの分析を含むあなたがた（RemazolbrilliantブルーR）11。また、エンドグルカナーゼ及びセルラーゼの範囲の両方のタンパク質の活性は、p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（PAHBAH）アッセイ12などの糖分析試験の使用によりモニターすることができる。これらの技術は、目的の発現セルラーゼの活性を解明し、定量することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
野生型のN.タバコ植物の 1。成長
- Nを成長させるタバコ L. CV。土壌へのプチハバナSR1植物は、発芽のための通常のポッティング土壌を充填適切なポットにタバコ種子を置く。 2週間後、個々のポットに苗を移す。定数22℃（暗期）または25℃（明期）および70％の相対湿度で温室で植物を培養する。 8分の16時間明/暗サイクルで照明を提供（ 例えばフィリップスIP65 400Wのランプ、180マイクロモル·秒-1·メートル-2;λ= 400〜700 nm）で毎日水。
TrCel5AとTrCel5A-mCherryタンパク質の2。一過性発現
- 無菌条件下で、pTRAkc-ER-TrCel5AまたはpTRAkc-ER-TrCel5A-mCherryのいずれかを含むAgarobacterium tumefaciensの単一のコロニー（GV3101 :: pMP90RK GMR、KMR、RifR）をピックアップし、10ミリリットルの酵母抽出物を含有する三角フラスコに移すブロス（YEB、製造業者の仕様書に従って調製）培地およびカナマイシン（50 mg / ml）を、リファンピシン（50 mg / ml）を、および選択のためのカルベニシリン（100 mg / mlで）。 26℃、180rpmで36〜40時間インキュベートする。注意：タンパク質発現のための適切な構築体のデザインは、本稿の範囲外ですが、指導のため、マクリーンら 13とマンローとPellham 14の方法には、構造物の設計のために続けることができます。
- 上記の抗生物質濃度をYEBの20ミリリットルを接種し、前と同じ条件でインキュベートする各培養液200μlを取る。
- 36-40時間後、2μlのアセトシリンゴン（200μM最終濃度）、100μLの40％（w / v）のグルコース溶液と1 M MES緩衝液（pH5.6）を200μl。を添加することによって培養物をpreinduce一晩インキュベートする。
- 2×浸潤緩衝液（100 g / Lのスクロース、3.6グラム/ Lのグルコース、8.6グラム/ Lムラシゲ·スクーグ基本塩を100mlを調製、）、水酸化カリウムを使用して5.6にpHを調整する。
- それは、OD 5-6の600に到達するまで1時05希釈液との文化のOD 600を測定します。 OD 600で30ミリリットル浸潤培地に必要な培養液量を計算します。 2X浸潤バッファの15ミリリットルを追加し、30ミリリットルまでのバッファを作るために、脱イオンH 2 Oを加える。
- 温室から植物を取り出し、浸透を容易にするために、上から5 番目の葉に、ニックに3 回目の背軸側をピペットチップを使用しています。
- 侵入を容易にするために、ニックに葉の背軸側をピペットチップを使用してください。
- 浸透培地で注射器を記入し、以前に作らニックの1に（針なしで）それを置く。向軸、葉側の指で注射器をサポートしています。 interveinal葉ゾーンの組織の中に慎重に培地を押してください。注意：浸透後、上記と同様の条件で、温室内の植物を栽培しています。また、untrの同じ割合を維持浸透させた植物と同じ条件下で、コントロールとしてeated、非一過性発現植物（NTEPs）。
植物の葉におけるTrCel5A-mCherry発現の3。評価
- 4-6日後、Aに浸透させた植物を取る温室からpTRAkc-ER-TrCel5A-mCherryを含有し、蛍光分析のために、暗い部屋の中に置いツメファシエンス 。
- 赤色フィルター（620から750ナノメートル）と515 nmの緑色の光を発する携帯用光源を用いTrCel5A-mCherry、光の植物を表す葉の切片の蛍光を可視化した。注：深さは、植物の葉におけるタンパク質発現の特徴付けは、光及び蛍光顕微鏡下で検査し、ビブラトームで薄切片の葉によって達成することができる。このために、以下の手順に従います。
- 浸潤葉から約5×5mmの大きさの小さな部分をカットし、アガロース50 mMリン酸緩衝液（pH 5.7）に溶解し、4％に埋め込む。
- カットビブラトームを使用して埋め込まれた葉から、80〜90ミクロンの大きさの部分。バッファまたはカバースリップで覆い、上述と同じ波長フィルタを用いて、蛍光検出器を用いて10倍の倍率で顕微鏡を使用して調べ、顕微鏡スライド上に置きます。
タバコ葉から4。TrCel5A抽出
- A.に感染した植物から1グラムのおおよそのウェイトにタバコの葉から作品をカット液体窒素で予冷し乳鉢でpTRAkc-ER-TrCel5Aと場所を含むツメファシエンス 。サンプルに液体窒素を適量入れる。グラインドは予備冷却乳棒を使用して粉末に残します。
- 接地葉印刷物に1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）2 mlを加え、葉状物質の大部分が懸濁液中になるまで混合する。 4℃で20分間15,000 xgで遠心抽出物およびタンパク質を含む上清を取る。
- セントリフーガ4℃で20分間15,000×gでの抽出物とは、ペレットを破壊しないように注意しながら、タンパク質を含む上清を取る。ペレットを捨てます。
- 部分的に10分間55℃でタンパク質含有上清をインキュベートすることによってTrCel5Aを精製する。 RTで10分間15,000 xgで遠心分離し、次いで、さらに10分間室温で休息できるようにする。対照サンプルを得るために、非浸潤植物のための部分的な精製プロセスを繰り返します。以下のすべての実験のために、これらのサンプルを使用してください。注：タンパク質溶液は、1週間まで、または最大3ヶ月間、-20℃で、4℃で保存することができる。
- 対照サンプルを得るために、非浸潤植物のための部分的な精製プロセスを繰り返します。以下のすべての実験のために、これらのサンプルを使用してください。注：タンパク質溶液は、1週間まで、または最大3ヶ月間、-20℃で、4℃で保存することができる。
5。、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、およびTrCel5A-mCherry <アゾ-CMCザイモ/ pの>
- 購入または確立された方法15に従って（w / v）のSDS-PAGEゲル12％を準備。
- 1.5％（w / v）の溶液を得、水にCMCを溶解する。 CMC-SDS-PAGEゲルを作るために、0.1％（w / v）のCMC + 12％（重量/体積をもたらすを10mlのSDS-PAGEゲル混合液に1mlの水1.5％CMC 1mlの置き換え）SDS-PAGEゲルミックス。通常のゲルを注ぐ。注意：元の溶液中のCMCが完全に40℃（前ゲル溶液を調製する直接繰り返す）に攪拌および加熱の組み合わせにより溶解していることを確認してください。
- 確立された方法12に従って、SDSの存在下で沸騰させることにより、サンプルを変性させる。陽性対照として、T.から市販のセルラーゼ混合物の1:500希釈を使用このようなTとしてデルマレー 、 デルマレー ATCC 26921。ネガティブコントロールとして非浸潤葉（NTEPs）から同様に調製したタンパク質溶液を使用しています。
- 通常のプロトコル15に従って電気泳動を行って、例えば色素の先端がゲルの底に達すると停止し、電気泳動で〜50分間、200Vを使用しています。
- 0.1％を用いたものSDS-PAGEゲルを染色（w / v）のクーマシーブリリアントブルー、メタノール/氷酢酸混合物を用いて脱色。注：ラピッド染色及び脱色を穏やかな染色を加熱し、10分後、脱色液を変え、温め（ただし沸騰）第染色をした後、脱色溶液で15秒〜マイクロ波を用いて、すなわち溶液を脱色することにより行うことができるとき、または冷却し、新たな脱色液を繰り返します。
- 確立されたプロトコル16,17を使用して1 SDS-PAGEゲルのウェスタンブロッティングを行う。 （二）アルカリホスファターゼに結合されたHisタグ（プライマリ）とポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体Fc領域に対するポリクローナルウサギ抗体：以下の抗体を使用してください。注：二次抗体は、ニトロブルーテトラゾールを用いて可視化を可能にするために選択されるべきであるイウムchloride/5-bromo-4-chloro-3 ' - indolyphosphateのp-トルイジン塩（NBT / BCIP）、18に記載されているよう。
- 1.5％ゲルをインキュベートすることによって0.15％（w / v）のCMC SDS-PAGEゲル上でリフォールディングゲル内のタンパク質を用いて室温でβ-シクロデキストリン、20mMのリン酸 - クエン酸緩衝液、pH 6.5（w / v）の実行穏やかな15分19振とう。
- β-シクロデキストリンのソリューションを捨て、簡単に、H 2 Oでゲルを洗うさらに15分間50mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.8）中で、室温でインキュベートする。 50℃で20分間、30 mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.8の中でゲルをインキュベートすることによってリフォールディング0.15％CMC SDS-PAGEゲルを用いてCMCザイモグラフィーを行う
- 50℃で20分間、30 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.8）中でゲルをインキュベートすることによってリフォールディングし、0.15％（w / v）のCMC SDS-PAGEゲルを用いてCMCザイモグラフィーを行う
- 30分間、またはクリアバンドが1 MのNaを使用して観察されるまで、0.1％w / vコンゴーレッド溶液及び脱染を用いて10分間ゲルを染色CL。明確に画像化のための0.3％（v / v）の酢酸でゲルを洗浄する。
TrCel5Aの6。4-MUC活性アッセイ
- 50％（v / v）メタノール中の10mM 4-MUCのストック溶液を調製し、RTで暗所に保管して
- アッセイの直前に、1 mMの4-MUCさ60mm酢酸ナトリウム、pH 4.8で構成される4-MUC 2X作業溶液を、準備します。
- （誘導的に発現の有無TrCel5Aなし）葉タンパク質100μlを、Tから100μlの市販のセルラーゼ混合物を含む試料に、このテストを実行するレセイ 1:1,000、および純粋なH 2 Oであった。三重に各サンプルを実行します。
- ピペット96ウェルプレートの各ウェルに4-MUC作業溶液100μlを、各試料100μlを加える。
- 360nmの励起波長および465 nmの発光波長を用いて、蛍光分光法によって4-MU蛍光の0分の時点を決定します。
- 20プレートをインキュベート50℃分間、蒸発を防ぐために接着剤の蓋で覆った。凍結（またはμlの0.15 Mグリシン、pHは10.0と、別々のプレートの試料100μlを100とを組み合わせることにより）により反応を停止します。
- 360nmの励起波長および465 nmの発光波長を用いて、蛍光分光法によって4-MU蛍光のエンドポイントを決定します。蛍光値の変化を得るために、エンドポイント（20分）の時点から0分を差し引く。
TrCel5Aの7。アゾキシメチルセルロース活性アッセイ
- 0.5 M、RTで保存する1.5％のストック（w / v）のアゾ-CMC、および18mMの酢酸亜鉛を含有する沈殿溶液を調製酢酸ナトリウム、pH 5〜80％エタノール（v / v）で、室温で保存温度。
- アッセイの直前に、1％（H 2 O中）（w / v）のアゾ-CMCおよび60mMの酢酸ナトリウム、pH 4.8からなるアゾ-CMC倍ワーキング溶液を調製。
- 50μlのサンプルと仕事の50μLを組み合わせる1.5ミリリットルのチューブでソリューションをING。
- （一時的に発現したかTrCel5Aなし）葉タンパク質の50μLを含有する試験サンプル; T.から市販のセルラーゼ混合物100μl デルマレーは 1:1,000に希釈した。そして、純粋なH 2 O三重でサンプルおよび標準を実行します。
- 50℃で20分間、サンプルをインキュベート沈殿溶液を250μlを添加して反応を停止させます。溶液が完全に混合したことを確認するために10秒間激しくボルテックス各サンプルを。
- 室温で10分間サンプルをインキュベートし、再度ボルテックスする。 10分間1,000×gでの遠心分離のサンプル。ペレットを破壊しないように注意しながら、96ウェルプレートに各サンプルの上清を200μlを削除します。
- 590nmの波長で吸光度分光法を用いてアッセイ。
TrCel5Aの8。PAHBAHアッセイ
- ろ紙円（〜5.5ミリメートル径）をカットして穴パンチを使用してください。 100μlの60 mMののNaAc、pHは4.8、および1を追加サンプル（誘導的に発現の有無TrCel5Aなしで）の葉のタンパク質を含むいずれか、または商業Tの00μL リーゼイのセルラーゼ混合物は、1:1,000に希釈し、300rpmで振盪しながら50℃で20時間濾紙丸でインキュベートする。濾紙とインキュベートし、各試料について、個々のサンプルを対照として濾紙なし重複溶液をインキュベートする。
- RTで5 100mlの溶液を、合計濃HCl溶液、およびストアを添加してH 2 Oに溶解することによってPAHBAH 330 mMのパラヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（PAHBAH）溶液Aを調製。注：最良の結果は、H 2 Oで100mlとする量を加える前に、溶解を助けるために温度下で撹拌PAHBAHスラリー、 すなわち 30ミリリットル、より小さな体積にHClを添加することによって達成される
- RTでの50 mMクエン酸ナトリウム、10mMの塩化カルシウム、および500mM NaOHおよびストアを含む、PAHBAH溶液Bを調製する。
- IMMEDiatelyアッセイの前に、使用するまで（4時間以内に使用する）氷上9ミリリットルの緩衝溶液、ストアに1ミリリットルのPAHBAH試薬の1.5倍の作業溶液を調製する。
- 耐熱性0.2または0.5 mlチューブ内のサンプルを準備します。フィルターペーパー（ステップ8.1）、H 2 Oを45μLとPAHBAH作業溶液100μlとインキュベートし、各溶液5μlを兼ね備えています。サンプルコントロール（フィルターペーパーなしでインキュベートしたサンプル）は、同じ濃度（5μlのサンプル、45μlのH 2 O、100μlのPAHBAH使用液）の下で実行する必要があります。また、0〜0.2gのグルコース/ Lを含有する5規格（5μl）を、純H 2 Oをテストする三重でサンプルおよび標準を実行します。
- 正確に10分間RTで冷却し、次いで、100℃で正確に10分間、サンプルをインキュベートする。波長410nmで96ウェルプレートおよびアッセイ分光ピペットソリューションを提供しています。最終的な取得するためのサンプルから（フィルターペーパーなしでインキュベート）個々のサンプル·コントロールを引く値。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TrCel5AとTrCel5A-mCherryを、一過性発現系（ 図1Aおよび1B）を用いてタバコ植物において首尾よく発現された。 TrCel5A-mCherry融合タンパク質の発現パターンの検査は、健康な葉の緑色光（ 図1D）の下で広範なタンパク質の発現を示した（ 図1C）を 、明らかにした。
総可溶性タンパク質の抽出を一過TrCel5Aタンパク質を発現させ、SDS-PAGEは、タンパク質の多種多様を示した葉を含有していたタバコ植物で行った本であった（ 図2A、レーン1）。植物およびNTEPsに由来する全可溶性タンパク質サンプルを発現TrCel5Aからの全可溶性タンパク質サンプルを、55℃で10分間インキュベートした。他の多くの（ネイティブタバコ）タンパク質は、この温度で安定していないながらTrCel5Aは55℃で安定しており、アクティブな状態を維持します。このように、多くの非essentiアルタンパク質はTrCel5Aの部分的に精製されたサンプルを残して、この処理によって沈殿させた。この熱沈殿工程の後、強力なタンパク質バンドは〜40kDaの（ 図2A、レーン1）に観察された。これは、植物4で発現された場合、このサイズで動作するように以前に示されているTrCel5A、触媒ドメイン（CD）である可能性が高い。陰性および陽性対照試料（それぞれ、 図2A、レーン3および4は、）T.の混合物を示すNTEPs（陰性対照、 図2A、レーン3）および複数のバンドからの残りの熱耐性タバコタンパク質の低濃度を示したリーゼイタンパク質（陽性対照、 図2A、レーン4）。
TrCel5Aの大きさは、両方のコントロール（ 図2B）が存在しないことがわかったTrCel5A C末端に組み込まれたHis-6tagに向けられた抗体染色により確認した。 TrCel5Aをすることが実証されましたリフォールディングされたタンパク質はSDS-PAGEゲルおよびウエスタンブロットをクマシー染色したと同様の高さで、CMCの劣化を示す、強力な消去領域を作成したCMCザイモグラフィー（ 図2C、レーン1および2）、エンドグルカナーゼにより活性を保持する。まだ活性がNTEPs（ 図2C、レーン3）からの非セルラーゼタンパク質混合物、およびT.の混合物について観察されなかった陽性対照として実行リーゼイタンパク質は、複数のコンポーネント（ 図2C、レーン4）からのエンドグルカナーゼ活性を示した。
TrCel5Aのセルロース分解活性を定量化するために3つのアッセイを使用した。まず、4 - MUCの劣化が解除4-MUの（360 nmで励起した）465 nmでの増加した蛍光発光を観察することによって分析した。 Tの市販の混合物の1:1,000希釈がしたようにTrCel5Aは、4MUCを分解することが示されたデルマレーセルラーゼ（ 図3A）。
定量化分析CMCに対するTrCel5Aの活性のアゾ-CMCから590nmにおけるアゾ染料の放出を測定することにより行った。これらの条件下でTrCel5A活動は、（ 図3B）上記のセルラーゼ混合物の1:1,000希釈の活性は同等であった。
濾紙を分解するTrCel5Aの能力も分析した。このアッセイのために、最初の糖化アッセイを実施した（ すなわち、濾紙を劣化TrCel5A溶液で）、次いで上清を（ 図3B）放出還元糖の量を確認するためにPAHBAHアッセイによって分析した。
の中TrCel5A構築物およびTrCel5A-mCherryの異種発現のための図1。植物発現カセットたばこは、緑色光下で蛍光により可視化残す。TrCel5A（A）及びTrCel5A-mCherry（B）に用いられる植物発現カセットの概略的表現が示されている。過渡TrCel5A-MC式の後、タバコの葉は、通常の（C）または緑色光（D）下で調べた。パネル（A）及び（B）についてはCaMVプロモーター（P35SS）及びターミネーターシグナル（pA35S）は水色で示されている。カルコンシンターゼ（CHS）、およびのHis6コード配列（のHis6）の5'-UTRは青色で表示されています。 mAb24が緑色で描かれたマウスの重鎖に由来する植物コドン最適化リーダーペプチド（LPH）。 LPHは、赤色で示さC末端KDEL信号は、ERへのタンパク質を遅らせた後、アポプラストへの組換えタンパク質の分泌を達成する。矢印は、CaMVの35SS発現カセットを増幅するためのプライマーのための結合部位を標識する。パネル（C）と（D）のために緑色の光は、励起515 nmのを持っていた。画像は拡大せずに撮影された。
。図2のサイズ及びSDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、およびCMCザイモグラフィーにより示さTrCel5Aの活性総可溶性タンパク質の分離：TrCel5A一過前に発現させたタバコ植物から（1）、（2）熱沈殿精製後; TrCel5Aはまた、熱沈殿させた後、存在しなかったタバコ植物から（3）;またはTの市販の混合物のレセイセルラーゼ（4）。 SDS-PAGE分離されたタンパク質は、クーマシーブルー染色（A）、TrCel5A（B）のHisタグ領域に対するウェスタンブロッティング、およびCMCを用いた酵素電気泳動により示されるセルラーゼ活性を可視化するコンゴレッド（C） を用いて可視化した。 PageRulerプラス（Fermentas社）は分子量マーカー（M）として使用した。
図3 TrCel5A。TrCel5Aの酵素活性の定量は 、4 - MUC（A）、アゾ- CMC（B）、および濾紙（C）及びフルオロフォア4-MU（A）の放出によって測定される基質分解とインキュベートしたアゾ色素（B）、又はPAHBAH（C）の色の変化を監視することによって還元糖を定量化することによって。各アッセイは3回の反復の結果を示す。エラーバーは標準偏差を示す。すべての3つのアッセイで分析した試料は、一人でTrCel5Aバッファた熱沈降精製した後、NTEP（WT NT）熱沈殿精製し、Tの市販の混合した後レセイセルラーゼ。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
セルラーゼの組換え発現は、より効率的なバイオ燃料生産システム1のための欲求に、大きな関心の分野である。植物は、このような経済的な収穫技術や、大規模なバイオ燃料生産のための非常に望ましい特性であること自己加水分解法などの機能により、成功したセルラーゼの生産のための多くの可能性を提供します。また、タンパク質を産生するための別のローカリゼーションを使用することは、必要であれば、翻訳後修飾を可能にする20。明らかな利点を提供しながら、セルラーゼの構成的発現を可能にするために、植物を変更するか、成功しない可能性があり、時間がかかる方法である。このような発現されたタンパク質や誘導性発現メカニズムの隔離のような技術は、植物に成功したセルラーゼの生産の可能性を高めるが、これらはまだ確立に何カ月もかかる。ここでは、一過性発現法は、特定のセルラーゼの可能性を例示するために、実証される数日のうち以内に植物系を経て製造される。
蛍光タンパク質mCherryとの融合は、一過性のタンパク質発現法の成功を示すために、ここで使用された。 TrCel5A-mCherryは明らかにベクター含有アグロバクテリウムを浸潤された葉の大部分が全体に分散した。小胞体への局在化は、発現されたタンパク質の翻訳後修飾を可能にします。 例えば、グリコシル化を可能にするために発現系の能力は、T.等、本来の真菌生物に由来するものとセルラーゼ、特に重要であるデルマレー 21。異種セルラーゼ発現のためにますます普及している酵母発現システムは、頻繁に完全なセルラーゼ活性22への潜在的な障害であると議論されている酵素の超グリコシル化につながる。植物グリコシル化機構Aハイパーグリコシル化の欠点なしに再。さらに、植物系における発現は、このようにタンパク質のソースに仕立て可能許可または翻訳後修飾を認めていない地域へのローカライズが可能になります。ここで示すシステムはまた、アポプラスト、葉緑体、細胞質ゾルまたはゴルジ小胞への局在化のために、異なるシグナル配列14の適用によって、使用することができる。例えばTrCel5A-mCherryなどの蛍光タンパク質融合、の使用は、タンパク質発現の成功ならびにタンパク質の局在化を示すことができる。しかしながら、このような結合体はさらに活性試験のために必要とされない。このためには、ここに示されたように、非mCherry TrCel5A構成体が発現セルラーゼのより正確な活動量データを取得するために、すべてのさらなる試験のために使用することをお勧めします。さらなる実験のための対照に関しては、試料からの非一過性浸潤植物は、一般に、適切なコントロールであると見なされる。
発現TrCel5Aのセルラーゼ活性の定量分析は、酵素が4-MUC、CMCおよび濾紙を含む基質の範囲、に対して活性であることを示した。各基板は、フルオロフォア（4-MU）を介して、または呈色反応（アゾ染料又はPAHBAH）の光散乱分析のいずれかによって、異なった分光試験を用いて調べた。すべての3つの基質およびアッセイは広くセルラーゼ活性の評価のために使用され、比較的簡単であるアッセイされる。 4 - MUCこれらの酵素（エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼおよびβ-グルコシダーゼ）の多種多様としてに対して活性である、グリコシルヒドロラーゼ活性を決定するための基本的な基質として使用される。アッセイの速度、要件の数が限られ、高感度と、基板を切断するための多くのセルラーゼの能力は、このセルラーゼのための、または式の実行の成功をプロービングするための一般的なスクリーニングのための有用なアッセイます。 4-MUCを使用すると、この基板は、β-グルコシダーゼの活性に特に適していることであるとき（例えばTrCel5Aなど）エンドグルカナーゼまたはエキソグルカナーゼの活性を作り、心に留めておくべき一点または酵素混合-グルコシダーゼ、βと比較して弱い現れるβ-グルコシダーゼが含まれています。低タンパク質濃度の4-MUCアッセイまたは他の低活性レベルを実行する際には、pH変化が4-MUの蛍光を増強するように、停止液としてグリシン（pHが10）の添加を利用することが推奨される。それが唯一のエンドグルカナーゼにより分解されるようにCMCは、ここに発現された酵素のためのより具体的な基質である。アゾ-CMCアッセイは、亜鉛によるセルロース（およびメタノール）の沈殿の必要性のために4-MUCのための1、より複雑である。主なこの基質の利益、したがってアッセイ、それが製造されるセルラーゼの性質を確立することは非常に有用なもの、エンドグルカナーゼ活性に特異的であることである。ろ紙劣化はセルラーゼ活性を確立するためのもう一つの共通のテストです。観察された分解の量が評価されるセルラーゼの性質に大きく依存変化し、それが酵素混合物の活性を調べるための好ましい基質である。濾紙の劣化を検査するためにここで使用PAHBAHアッセイは、糖化後に放出糖の量を認識し、そのようにもCMC、リケナン、β-グルカン、α-セルロース、AVICEL含む、ここには示されていませんモデル基質の広い範囲に適用可能である、キシランとキシログルカン。インキュベーション時間の変化として、評価されているサンプルは、結果の違いにつながることができ、このアッセイのために、ケアは同じプレート上（あるいは同じ実行中の）基準を含むものと解釈されるべきである。これは、精度を確保するためのアッセイを繰り返すこともことが重要である。さらにサンプルはPAHBAHで識別される可能性があり、そうでなければ、偽陽性の結果を与えるサンプル中に自然に存在する任意の還元糖をコントロールするために、セルロース基材なしでインキュベートされる場合には、サンプルコントロールは常に、実行する必要があります。
結論として、組換えセルラーゼの一過性発現および特性評価のための方法が明確に証明されています。これらの技術は、ここに挙げたもののような活性試験を用いて、一つ以上のセルラーゼのさらなる検査のために十分な量のタンパク質を生成するための簡単な方法を提供する。特に、これらの方法は、 植物体産生のための指定されたセルラーゼの可能性を調べるための迅速な方法を提供する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、BMBF Forschungsinitiativeによってサポートされていました」BioEnergie 2021 - Forschung毛皮はNutzungフォンBiomasseダイ」と科学を推進するため、ドイツ連邦政府と州政府によってエクセレンス·イニシアチブを通じて資金を供給されている優秀「バイオマスからのオーダーメイド燃料」、のクラスターをとドイツの大学での研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic - kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic - rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic - carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody - rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper - Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer - Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source - BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome - VT1000S | Leica |
References
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
