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Expresión recombinante de celulasa de Cel5A Published: June 13, 2014 doi: 10.3791/51711
Automatic Translation
1, *1, *1, 2, 1
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology
* These authors contributed equally

Summary

Las plantas de tabaco se usaron para producir una celulasa fúngica, TrCel5A, a través de un sistema de expresión transitorio. La expresión podría ser monitoreado usando una proteína de fusión fluorescente, y la actividad de la proteína se caracterizó después de la expresión.

Abstract

Enzimas degradantes de celulosa, celulasas, son objeto de la investigación y los intereses industriales. La preponderancia de estas enzimas en los organismos difíciles-a la cultura, como los hongos de fomento de hifas y bacterias anaerobias, ha acelerado el uso de tecnologías recombinantes en este campo. Métodos de expresión vegetales son un sistema conveniente para la producción a gran escala de enzimas y otras proteínas industrialmente útiles. En la presente memoria, se demuestran los métodos para la expresión transitoria de una endoglucanasa fúngica, Trichoderma reesei Cel5A, en Nicotiana tabacum. El éxito de expresión de la proteína se muestra, supervisado por fluorescencia utilizando una proteína de fusión mCherry-enzima. Además, una serie de pruebas básicas se utilizan para examinar la actividad de T. transitoriamente expresó reesei Cel5A, incluyendo SDS-PAGE, transferencia Western, zimografía, así como la fluorescencia y ensayos de degradación del sustrato con base de tinte. El sistema aquí descrito se puede utilizar para producir una célula activaULASE en un corto período de tiempo, a fin de evaluar el potencial de la producción en plantas a través de sistemas de expresión constitutivos o inducibles.

Introduction

La degradación de la biomasa lignocelulósica y su conversión en combustible líquido ha sido concebido como un método para reducir la dependencia de los combustibles fósiles. Un obstáculo importante en el establecimiento de sistemas de procesamiento de biomasa económicamente viables es en la degradación enzimática de la celulosa y la hemicelulosa 1. Sistemas de expresión de la planta muestran un gran potencial para la producción de enzimas a escala industrial. Los sistemas agrícolas a las plantas de cosecha económica y en el volumen ya están establecidos, como lo han sido durante miles de años. La producción de celulasas en las plantas es deseable debido a factores como la facilidad de autohidrólisis 2, y el potencial para maximizar el uso de niveles más bajos de la enzima mediante el aumento de la digestibilidad de paredes celulares de las plantas 1. Finalmente, los sistemas de la planta permiten la focalización de proteínas recombinantes a áreas específicas de las células vegetales y son capaces de modificar posttranslationally enzimas cuando sea necesario 3.

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Nicotiana tabacum (tabaco) es muy utilizado como organismo modelo para estudios de expresión de proteínas heterólogas en las plantas, debido a sus características de crecimiento y biomasa rápida acumulación 4. La expresión transitoria de las proteínas recombinantes es una técnica que permite la producción de proteínas en períodos de tiempo cortos 5, manteniendo al mismo tiempo la flexibilidad en cuanto a la localización y por lo tanto las modificaciones postraduccionales de las proteínas seleccionadas, es decir, celulasas. Esto permite la producción de la celulasa (s) para el análisis básico, y al mismo tiempo sentar las bases de nuevas estrategias de expresión en plantas. Usando una estrategia de expresión transitoria tal, una endoglucanasa de la familia de glicosil hidrolasa 5, Cel5A, derivado de la fúngica huésped de Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 se produce (en lo sucesivo referido como TrCel5A). TrCel5A es una proteína de 42 kDa que está glicosilado de forma nativa y es altamente activo en HYDroylzing cadenas de celulosa 7.

La técnica de la expresión transitoria descrito aquí se basa en un sistema relativamente utilizado comúnmente, infiltrándose en las hojas de plantas con Agrobacteria lleva el gen de interés en un vector de expresión apropiado. Para permitir un análisis rápido de éxito la expresión in planta, TrCel5A también se puede expresar como una proteína de fusión con mCherry, una proteína fluorescente monomérico derivado originalmente de Discosoma sp. Proteína DsRed 8, con un adicional de seis residuos de histidina (His-tag) fusionado a el C-terminal (TrCel5A-mCherry). La expresión de la proteína de fusión heteróloga, TrCel5A-mCherry, por tanto, se puede controlar en el cultivo de plantas mediante el uso de la luz verde para examinar mCherry dispersión. Si se desea, las secciones delgadas de material de la planta pueden ser examinados bajo luz verde al microscopio para determinar la localización específica de la proteína. Para este trabajo, la señal y la transentarse péptidos fueron incorporados en la construcción, para localizar la exportación de proteínas heterólogas a la retículo endoplásmico 9.

Para analizar la actividad de celulasas expresadas de plantas, incluyendo TrCel5A, una serie de pruebas de actividad de celulasa se puede ejecutar. Después de la extracción de las proteínas solubles totales de la planta, TrCel5A puede purificarse parcialmente usando una técnica de incubación térmica. El tamaño de la proteína se estableció utilizando SDS-PAGE seguido por transferencia Western. La zimografía puede ser utilizado para analizar la actividad contra los sustratos, por ejemplo, de celulosa que ha sido carboxi-metilado (haciendo carboximetilcelulosa: CMC) para la solubilidad 10. Actividad de la celulasa y glucosidasa se puede controlar utilizando el fluoróforo 4-metilumbeliferil (4-MU) asociado con β-D-celobiósido (combinado: 4-MUC). Otro método para evaluar la actividad endoglucanasa implica el análisis de espectrometría de CMC que se ha asociado con un azo-dye (Remazolbrilliant Blue R) 11. Además, la actividad de proteína de ambos endoglucanasas y una gama de celulasas se puede controlar por el uso de una prueba de análisis de azúcares, tales como la hidrazida p-hidroxi benzoico (PAHBAH) de ensayo 12. Estas técnicas se pueden utilizar para elucidar y cuantificar la actividad de la celulasa de interés expresada.

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Protocol

1. Crecimiento de tipo salvaje de N. tabacum plantas

  1. Para crecer N. tabacum L. cv. Plantas Petit Havana SR1 en suelo, coloque las semillas de tabaco en macetas llenas de tierra apropiadas para macetas normales para la germinación. Después de 2 semanas, la transferencia de las plantas de semillero a macetas individuales. Incubar las plantas en un invernadero con constante de 22 ° C (periodo de oscuridad) o 25 ° C (punto de luz) y 70% de humedad relativa del aire. Proporcionar iluminación en un 16/8 horas de luz / oscuridad ciclo (por ejemplo, Philips IP65 400 W lámparas; 180 mmol · s-1 · m-2; λ = 400-700 nm) y agua todos los días.

2. Expresión transitoria de TrCel5A y TrCel5A-mCherry Proteínas

  1. En condiciones estériles, recoger colonias individuales de Agrobacterium Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RIFR) que contenían pTRAkc-ER-TrCel5A o pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry y traslado a un matraz Erlenmeyer que contiene 10 ml de extracto de levaduracaldo (YEB, preparado según las especificaciones del fabricante) medio y kanamicina (50 mg / ml), rifampicina (50 mg / ml), y carbenicilina (100 mg / ml) para la selección. Incubar durante 36-40 horas a 26 ° C y 180 rpm. Nota: El diseño de las construcciones apropiadas para la expresión de la proteína se encuentra fuera del alcance de este documento, pero para la orientación, los métodos de Maclean et al 13 y Munro y Pellham 14 se puede seguir para el diseño de construcción..
  2. Tomar 200 l de cada cultivo para inocular 20 ml de YEB con las concentraciones de antibióticos mencionados anteriormente e incubar en las mismas condiciones que antes.
  3. Después de 36-40 horas, preinduce las culturas mediante la adición de 2 l acetosyringon (200 mM concentración final), 100 l 40% (w / v) de solución de glucosa y 200 l de 1 M de tampón MES pH 5,6. Incubar toda la noche.
  4. Preparar 100 ml de un tampón de infiltración 2x ​​(sales basales 100 g / L de sacarosa, 3,6 g / L de glucosa, 8,6 g / l de Murashige y Skoog, Ajustar el pH a 5,6 utilizando hidróxido de potasio).
  5. Mida OD 600 de las culturas con diluciones 1:5 hasta alcanzar una DO600 de 5-6. Cálculo de volumen de cultivo necesario para 30 ml de medio de infiltración a una DO de 600. Añadir 15 ml de tampón de infiltración 2x, a continuación, añadir H2O desionizada para hacer el buffer hasta 30 ml.
  6. Tome las plantas de invernadero y utilizar una punta de pipeta de nick el lado abaxial de la 3 ª a la 5 ª hoja de la parte superior para facilitar la infiltración.
  7. Utilice una punta de pipeta para nick el lado abaxial de las hojas para facilitar la infiltración.
  8. Llene una jeringa con medio de infiltración y ponerlo (sin aguja) en una de las muescas hechas previamente. Apoyar jeringa con un dedo en el lado adaxial de la hoja. Presione el medio con cuidado en el tejido de las zonas de la hoja intervenales. Nota: Después de la infiltración, cultivar plantas en un invernadero bajo las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Además, mantener una proporción igual de untreated, las plantas no transitoria de expresión (NTEPs) como controles, en las mismas condiciones que las plantas se infiltró.

3. Evaluación de TrCel5A-mCherry Expresión en las hojas de las plantas

  1. Después de 4-6 días, tome las plantas se infiltró con A. tumefaciens que contienen pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry del invernadero y colocarlos en un cuarto oscuro para el análisis de fluorescencia.
  2. Para visualizar la fluorescencia en secciones de hojas que expresan TrCel5A-mCherry, plantas de luz utilizando una fuente de luz portátil que emite luz verde a 515 nm con un filtro rojo (620-750 nm). Nota: En profundidad caracterización de expresión de la proteína en las hojas de las plantas se puede lograr por las hojas delgadas de seccionamiento con un vibrátomo y el examen bajo luz y microscopía de fluorescencia. Para ello siga los siguientes pasos:
    1. Cortar secciones pequeñas de aproximadamente 5 x 5 mm de tamaño de una hoja de infiltrado e incrustarlos en 4% de agarosa disuelta en 50 mM de tampón de fosfato (pH 5,7).
    2. Cortadasección de 80-90 micras de tamaño de las hojas integrados utilizando un vibratomo. Colóquelos en un portaobjetos, cubra con un tampón o una hoja de cubierta y examinarlas con un microscopio a 10 aumentos con un detector de fluorescencia, usando la misma longitud de onda y el filtro se ha dicho.

4. TrCel5A extracción de hojas de tabaco

  1. Corte los pedazos de hojas de tabaco para un peso aproximado de 1 g de plantas infectadas con A. tumefaciens que contienen pTRAkc-ER-TrCel5A y colocar en un mortero previamente enfriado con nitrógeno líquido. Añadir una cantidad apropiada de nitrógeno líquido para las muestras. Grind deja a polvo usando un mortero enfriado previamente.
  2. Añadir 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM a la cuestión de la hoja del suelo y mezclar hasta que la mayoría de la materia de la hoja está en suspensión. Extracto de centrifugar a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C y tomar sobrenadante que contiene proteína.
  3. CentriFuge el extracto a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C y tomar sobrenadante que contiene proteína-teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Deseche el sedimento.
  4. Purificar parcialmente TrCel5A incubando el sobrenadante que contiene proteína a 55 º C durante 10 min. Dejar reposar a temperatura ambiente durante otros 10 min, a continuación se centrifuga a 15.000 xg durante 10 min a TA. Repita el proceso de purificación parcial para las plantas no infiltradas para obtener muestras de control. Utilice estas muestras para todos los siguientes experimentos. Nota: Las soluciones de proteínas pueden ser almacenadas a 4 ° C durante un máximo de 1 semana o a -20 ° C durante un máximo de 3 meses.
  5. Repita el proceso de purificación parcial para las plantas no infiltradas para obtener muestras de control. Utilice estas muestras para todos los siguientes experimentos. Nota: Las soluciones de proteínas pueden ser almacenadas a 4 ° C durante un máximo de 1 semana o a -20 ° C durante un máximo de 3 meses.

5. SDS-PAGE, Western Blot, y azo-CMC Zymography de TrCel5A-mCherry </ P>

  1. Compra o preparar un 12% (p / v) SDS-PAGE geles como por los métodos establecidos 15.
  2. Disolver CMC en agua para obtener una (w / v) solución de 1,5%. Para hacer geles de CMC-SDS-PAGE, sustituir 1 ml de 1,5% de CMC de 1 ml de agua en una solución de 10 ml de mezcla de gel de SDS-PAGE, lo que resulta en un 0,1% (w / v) de CMC + 12% (w / v ) de la mezcla en gel de SDS-PAGE. Verter en gel normalmente. Nota: Asegúrese de que la CMC en la solución original se haya disuelto completamente por una combinación de agitación y calentamiento a 40 ° C (repetir directamente antes de preparar la solución de gel).
  3. Desnaturalizar muestras por ebullición en presencia de SDS, según métodos establecidos 12. Como control positivo, utilizar una dilución 1:500 de una mezcla de celulasa disponibles comercialmente a partir de T. reesei, tales como T. reesei ATCC 26921. Como control negativo utilizar una solución de proteína preparada de manera similar a partir de hojas no infiltrados (NTEPs).
  4. Llevar a cabo la electroforesis según los protocolos normales de 15,por ejemplo, uso 200 V durante ~ 50 min con la electroforesis se detuvo una vez que el frente de colorante alcanzó el fondo del gel.
  5. Teñir uno en gel de SDS-PAGE utilizando 0,1% (w / v) azul brillante de Coomassie y destain utilizando una mezcla de ácido acético metanol / glacial. Nota: Tinción rápida y decoloración se puede realizar calentando suavemente la tinción y la decoloración se deben soluciones, es decir, mediante el uso de un horno de microondas durante ~ 15 segundos para calentar (pero no hervir) primero la tinción y luego las soluciones destaining, cambiando la solución de decoloración después de 10 min , o cuando se enfría, y repita con la nueva solución decolorante.
  6. Realizar la transferencia Western de uno en gel de SDS-PAGE utilizando protocolos establecidos 16,17. Utilice los siguientes anticuerpos: un anticuerpo policlonal de conejo contra un anticuerpo anti-conejo región Fc etiqueta de His (primaria) y una cabra policlonal que ha sido conjugado con una fosfatasa alcalina (secundaria). Nota: anticuerpos secundarios se deben seleccionar para permitir la visualización utilizando nitroazul de tetrazolio chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-indolyphosphate sal p-toluidina (NBT / BCIP), tal como se describe 18.
  7. Realizar la proteína en gel de replegamiento en el 0,15% (w / v) en gel de SDS-PAGE CMC incubando el gel en 1,5% (w / v) de β-ciclodextrina, tampón citrato-fosfato 20 mM, pH 6,5, a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 min 19.
  8. Deseche la solución de β-ciclodextrina y lavar brevemente el gel con H 2 O. Incubar a temperatura ambiente en 50 mM de tampón de acetato de sodio (pH 4,8) durante 15 min. Realizar CMC zimografía usando el 0,15% de CMC en gel de SDS-PAGE replegada incubando el gel en acetato de sodio 30 mM de tampón de pH 4,8 durante 20 min a 50 ° C.
  9. Realizar CMC zimografía usando el replegada 0,15% (w / v) en gel de SDS-PAGE CMC incubando el gel en 30 mM de tampón de acetato de sodio (pH 4,8) durante 20 min a 50 ° C.
  10. Teñir el gel durante 10 min utilizando un 0,1% w / v de solución de rojo Congo y destain durante 30 min o hasta que las bandas claras se observaron utilizando 1 M de NaCl. Se lava el gel con 0,3% (v / v) de ácido acético para obtener imágenes más clara.

6. 4-MUC Ensayo de actividad de TrCel5A

  1. Preparar una solución madre de 10 mM de 4 MUC en 50% (v / v) de metanol, y almacenarlo en la oscuridad a temperatura ambiente
  2. Inmediatamente antes del ensayo, preparar una solución de trabajo 4-MUC 2x, compuesto de 1 mM de 4-MUC y 60 mM de acetato de sodio, pH 4,8.
  3. Realice esta prueba sobre muestras que contienen 100 l de proteína de la hoja (con o sin TrCel5A inducible expresado), 100 l de una mezcla de celulasa disponibles comercialmente a partir de T. 1:1.000 reesei y H 2 O puro, respectivamente. Ejecutar cada muestra por triplicado.
  4. Pipetear 100 l de la solución de trabajo 4-MUC en pocillos separados de una placa de 96 pocillos, a continuación, añadir 100 l de cada muestra.
  5. Determinar 0 min punto de tiempo de 4-MU de fluorescencia a través de la espectroscopia de fluorescencia, usando una longitud de onda de excitación de 360 ​​nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.
  6. Incubar las placas durante 20min a 50 ° C, cubierto con tapas adhesivas para evitar la evaporación. Detenga la reacción de congelación (o mediante la combinación de 100 l 0,15 M de glicina, pH 10,0, y 100 l de muestra en una placa separada).
  7. Determinar el punto final de 4-MU de fluorescencia a través de la espectroscopia de fluorescencia, usando una longitud de onda de excitación de 360 ​​nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm. Reste 0 min del final del estudio (20 min) punto de tiempo para obtener el cambio en los valores de fluorescencia.

7. Azo-carboximetil celulosa Ensayo de actividad de TrCel5A

  1. Preparar un stock de 1,5% (w / v) azo-CMC que se almacena a temperatura ambiente, y una solución de precipitación que contiene acetato 18 mM de zinc, 0,5 M de acetato de sodio, pH 5 y etanol 80% (v / v), en la sala de la tienda temperatura.
  2. Inmediatamente antes del ensayo, preparar una solución de azo-CMC 2x de trabajo, compuesta de 1% (w / v) azo-CMC (en H2O) y 60 mM de acetato de sodio, pH 4,8.
  3. Combine 50 l de muestra y 50 l de la obraing solución en tubos de 1,5 ml.
  4. Las muestras de ensayo que contienen 50 l de proteína de la hoja (con o sin TrCel5A expresado transitoriamente); 100 l de una mezcla de celulasa disponibles comercialmente a partir de T. reesei diluido 1:1.000; y pura H 2 O. Muestras y los estándares manejados por triplicado.
  5. Incubar las muestras durante 20 min a 50 ° C. Detener la reacción añadiendo 250 l de solución de precipitación. Vortex cada muestra vigorosamente durante 10 segundos para asegurar soluciones fueron completamente combinados.
  6. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 min y luego vórtice de nuevo. Centrifugar las muestras a 1000 xg durante 10 min. Tomar 200 l de cada sobrenadante de la muestra a una placa de 96 pocillos, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.
  7. Ensayo usando espectroscopia de absorbancia a una longitud de onda de 590 nm.

8. Ensayo PAHBAH de TrCel5A

  1. Use una perforadora para cortar un círculo (~ 5,5 mm de diámetro) de papel de filtro. Añadir 100 l de NaAc 60 mM, pH 4,8, y 100 l de muestras, o bien que contienen proteína de la hoja (con o sin TrCel5A inducible expresado) o un T. comercial mezcla de celulasa reesei, diluido 1:1.000, y se incuba con círculos de papel de filtro durante 20 horas a 50 ° C con 300 rpm de temblar. Para cada muestra se incuba con papel de filtro, también se incuba una solución duplicado sin papel de filtro como se muestra-controles individuales.
  2. Preparar un 330 mM p-hidroxi benzoico hidrazida (PAHBAH) Una solución disolviendo PAHBAH en H 2 O con la adición de 5 ml de HCl concentrado para un total de 100 ml de solución, y almacenarlos a temperatura ambiente. Nota: Los mejores resultados se consiguen mediante la adición de HCl a un volumen más pequeño de suspensión PAHBAH, es decir, 30 ml, que se agita bajo condiciones de temperatura para ayudar a la disolución antes de hacer el volumen a 100 ml con H 2 O.
  3. Preparar PAHBAH solución B, que contiene citrato de sodio 50 mM, cloruro de calcio 10 mM y NaOH 500 mM y se almacena a temperatura ambiente.
  4. Immediately antes del ensayo, preparar una solución de trabajo de 1,5 x de reactivo PAHBAH 1 ml a 9 ml de solución tampón, almacenar en hielo hasta su uso (para ser utilizado dentro de 4 horas).
  5. Preparar muestras en termoestables 0,2 o 0,5 ml tubos. Combine 5 l de cada solución incubadas con papel de filtro (paso 8.1) 45 l de H 2 O y 100 l de solución de trabajo PAHBAH. Controles de muestra (muestras incubadas sin papel de filtro) deben utilizarse en las mismas concentraciones (5 l de la muestra, 45 2 O, la solución de trabajo 100 l PAHBAH l H). También prueba 5 normas (5 l) que contienen entre 0 y 0,2 g / l de glucosa, y H pura 2 O. Muestras y los estándares manejados por triplicado.
  6. Incubar las muestras durante exactamente 10 min a 100 ° C, a continuación, enfriar a temperatura ambiente durante exactamente 10 min. Soluciones de la pipeta en una placa de 96 pocillos y ensayo espectroscópicamente a una longitud de onda de 410 nm. Reste la muestra-controles individuales (incubadas sin papel de filtro) a partir de muestras para obtener definitivavalores.

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Representative Results

TrCel5A y TrCel5A-mCherry se expresaron con éxito en plantas de tabaco usando el sistema de expresión transitoria (Figuras 1A y 1B). El examen del patrón de expresión de la proteína de fusión TrCel5A-mCherry reveló hojas sanas (Figura 1C), que mostró que la expresión de proteínas generalizada con luz verde (Figura 1D).

La extracción de las proteínas solubles totales se realizó en plantas de tabaco que tenían hojas que contenían la proteína expresada transitoriamente TrCel5A y SDS-PAGE mostró una gran variedad de proteínas estaban presentes (Figura 2A, carril 1). La muestra de proteína soluble total de TrCel5A plantas que expresan y una muestra de proteína soluble total derivado de NTEPs, se incubaron durante 10 min a 55 ° C. TrCel5A se mantiene estable y activo a 55 ° C, mientras que muchos otros (tabaco nativas), las proteínas no son estables a esta temperatura. Por lo tanto, muchos no essentiAL proteínas se precipitaron por este tratamiento, dejando una muestra parcialmente purificada de TrCel5A. Después de este paso térmico-precipitación, una banda de proteína fuerte se observó a ~ 40 kDa (Figura 2A, carril 1). Esto es probable que sea el dominio catalítico (CD) de la TrCel5A, que se ha demostrado previamente para funcionar en este tamaño cuando se expresa en plantas 4. El negativo y positivo las muestras de control (Figura 2A, carriles 3 y 4, respectivamente) mostraron bajas concentraciones de proteínas de tabaco termotolerantes restantes de NTEPs (control negativo, la Figura 2A, carril 3) y múltiples bandas que indica una mezcla de T. proteínas reesei (control positivo, la Figura 2A, carril 4).

El tamaño de la TrCel5A fue confirmada por tinción de anticuerpo dirigido a la Su-6tag incorporado en el TrCel5A C-terminal, que fue visto a estar ausente para ambos controles (Figura 2B). El TrCel5A se demostró queretener la actividad endoglucanasa por CMC zimografía (Figura 2C, carriles 1 y 2), en donde la proteína replegada creado un área despejada fuerte, lo que indica la degradación de CMC, a la misma altura como en el gel tintado con Coomassie de SDS-PAGE y la inmunotransferencia de tipo Western. No se observó actividad para la proteína no celulasa mezclas de NTEPs (Figura 2C, carril 3), y la mezcla de T. proteínas reesei se ejecutan como un control positivo mostraron actividad de endoglucanasa a partir de múltiples componentes (Figura 2C, carril 4).

Para cuantificar la actividad celulolítica de TrCel5A se utilizaron tres ensayos. En primer lugar, la degradación de 4-MUC se analizó mediante la observación del aumento de la emisión de fluorescencia a 465 nm (se excita a 360 nm) de la lanzado 4-MU. TrCel5A se muestra para degradar 4MUC, como lo hizo una dilución 1:1.000 de una mezcla disponible comercialmente de T. celulasas reesei (Figura 3A).

Un análisis cuantificablede la actividad de TrCel5A contra la CMC se hizo mediante la medición de la liberación de un azo-colorante a 590 nm a partir de azo-CMC. TrCel5A actividad bajo estas condiciones, fue equivalente en actividad a una dilución 1:1.000 de la mezcla de celulasa mencionada anteriormente (Figura 3B).

También se analizó la capacidad de TrCel5A para degradar papel de filtro. Para este ensayo, se realizó un ensayo inicial de sacarificación (es decir, con la solución TrCel5A degradar el papel de filtro) y a continuación, el sobrenadante se analizó por el ensayo de PAHBAH para determinar la cantidad de azúcares reductores liberados (Figura 3B).

Figura 1
Casetes Figura 1. Expresión vegetales para construcciones TrCel5A y expresión heteróloga de TrCel5A-mCherry en quetabaco deja visualizado por fluorescencia bajo luz verde. representaciones esquemáticas de la casete de expresión de la planta utilizada para TrCel5A (A) y TrCel5A-mCherry (B) se muestran. Después de la expresión transitoria TrCel5A-MC, las hojas de tabaco se examinaron bajo normal (C) o una luz verde (D). Para los paneles (A) y (B) el promotor CaMV (P35SS) y la señal de terminación (pA35S) se indican en azul claro. 5'-UTR de chalcona sintasa (CHS), y la secuencia de codificación de His6 (His6) se indican en azul. El péptido planta de codones optimizados líder (LPH) derivado de la cadena pesada de murino mAb24 se representa en verde. LPH logra la secreción de la proteína recombinante hacia el apoplasto, después de lo cual una señal KDEL C-terminal, se indica en rojo, retarda la proteína a la sala de emergencias. Flechas etiquetan el sitio de unión para el cebador para amplificar el casete de expresión CaMV 35SS. Para los paneles (C) y (D) la luz verde tenía una excitación 515 nm.Las imágenes fueron tomadas sin aumento.

Figura 2
. Figura 2 Tamaño y la actividad de TrCel5A se muestra por SDS-PAGE, transferencia Western, y CMC zimografía La separación de las proteínas solubles totales:. De plantas de tabaco en el que se expresa transitoriamente TrCel5A antes de (1) y después (2) purificación de la precipitación térmica; a partir de plantas de tabaco donde TrCel5A no estaba presente, también después de la precipitación térmica (3); o de una mezcla disponible comercialmente de T. celulasas reesei (4). Proteínas separadas de SDS-PAGE se visualizaron con tinción con azul de Coomassie (A), Western Blot contra la región His-tag de TrCel5A (B), y la actividad de celulasa se ​​muestra por zimografía usando CMC visualizaron utilizando Rojo Congo (C). PageRuler Plus(Fermentas) se utilizó como marcador de peso molecular (M).

Figura 3
Figura 3. La actividad enzimática cuantificación de TrCel5A. TrCel5A se incubó con 4-MUC (A), azo-CMC (B), y papel de filtro (C) y la degradación del sustrato medido por la liberación del fluoróforo 4-MU (A), un azo-colorante (B), o mediante la cuantificación de la reducción de azúcares por la monitorización del cambio de color de PAHBAH (C). Cada ensayo muestra los resultados para tres repeticiones. Las barras de error indican la desviación estándar. En los tres ensayos de las muestras analizadas eran tampón solo, TrCel5A después de la purificación precipitación térmica, NTEP (WT NT) después de la purificación precipitación térmica, y una mezcla comercialmente disponible de T. celulasas reesei.

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Discussion

La expresión recombinante de celulasas es un campo de gran interés, debido al deseo de los sistemas de producción de biocombustibles más eficientes 1. Las plantas ofrecen muchas posibilidades para la producción de celulasas éxito, con características tales como las técnicas de aprovechamiento económico y métodos autohidrólisis son propiedades muy deseables para la producción de biocombustibles a gran escala. Además, el uso de diferentes localizaciones para la producción de proteínas permite, en caso necesario, las modificaciones posteriores a la traducción 20. La alteración de las plantas para permitir la expresión constitutiva de celulasas, al tiempo que ofrece beneficios evidentes, es un método consume tiempo que puede o no puede tener éxito. Técnicas tales como el secuestro de las proteínas expresadas y los mecanismos de expresión inducible aumentan la probabilidad de la producción de celulasas éxito en las plantas, sin embargo, estos todavía tienen muchos meses de establecer. Aquí, los métodos de expresión transitoria se demuestran, para ilustrar el potencial de una celulasa específicaa ser producido a través de sistemas de la planta en cuestión de días.

Una fusión con la proteína fluorescente mCherry se utiliza aquí para demostrar el éxito de los métodos de expresión de proteínas transitorios. TrCel5A-mCherry se distribuyó claramente a través de la mayoría de las hojas que había sido infiltrado con las Agrobacterias que contiene el vector. La localización en el retículo endoplásmico permite modificaciones postraduccionales de la proteína expresada. La capacidad de un sistema de expresión para permitir por ejemplo la glicosilación es particularmente importante para aquellas celulasas que están originalmente derivan de organismos fúngicos, tales como T. reesei 21. Los sistemas de expresión de levaduras, que son cada vez más popular para la expresión heteróloga de celulasas, con frecuencia dan lugar a hiper-glicosilación de las enzimas, que se debaten a ser un obstáculo potencial para la actividad celulasa completa 22. Glicosilación Planta mecanismos avolver sin el inconveniente de hiper-glicosilación. Además, la expresión en sistemas de plantas para la localización permite a las zonas que permiten o no permiten modificaciones postraduccionales, permitiendo así la adaptación a la fuente de la proteína. El sistema demostrado aquí también se puede utilizar, por la aplicación de diferentes secuencias de señal 14, para la localización hacia el apoplasto, cloroplasto, citosol o vesículas de Golgi. El uso de fusiones de proteínas fluorescentes, tales como TrCel5A-mCherry, puede demostrar el éxito de la expresión de proteínas, así como la localización de la proteína. Sin embargo, tales conjugados no son necesarios para otros ensayos de actividad. Por lo tanto se recomienda que una construcción no mCherry TrCel5A ser utilizado para todas las pruebas adicionales, como se muestra aquí, para obtener los datos de actividad más precisas de la celulasa expresado. En cuanto a los controles para otros experimentos, las muestras de las plantas no transitoriamente infiltrados son comúnmente vistos como los controles adecuados.

5. Análisis de zimografía de actividad frente a CMC indica que el péptido restante era activo como una endoglucanasa. Mientras SDS-PAGE y Western Blot son ensayos extremadamente comunes, CMC zimografía es una prueba mucho más específico para la celulasa (y, en particular endoglucanasa) la actividad. Algunos factores importantes a tener en cuenta para los resultados zymography exitosos son a) que el sustrato (en este caso CMC) debe estar completamente disuelta y se extendió uniformemente por todo el gel; b) que la proteína tiene que ser replegada con éxito, preferiblemente en un período corto para limitar la cantidad de difusión de la proteína a través del gel; y c) queel ensayo de actividad debe estar a la temperatura óptima para la enzima que se está ensayando (por TrCel5A entre 50 y 60 ° C) y debe ser breve para que las bandas más nítidas de la degradación.

El análisis cuantitativo de la actividad de la celulasa de TrCel5A expresado demostró que la enzima era activo contra una amplia gama de sustratos, incluyendo 4-MUC, CMC y papel de filtro. Cada uno de los sustratos se examinó mediante una prueba espectroscópica diferente, ya sea a través de un fluoróforo (4-MU) o mediante análisis de dispersión de luz de una reacción de color (Azo-colorantes o PAHBAH). Todos los tres sustratos y ensayos son ampliamente utilizados para la evaluación de la actividad de la celulasa, y son ensayos relativamente sencillo. 4-MUC se utiliza como un sustrato de base para determinar la actividad glicosil hidrolasa, como una amplia variedad de estas enzimas (endoglucanasas, exoglucanasas y β-glucosidasas) son activos contra ella. La velocidad del ensayo, el número limitado de requisitos, alta sensibilidady la capacidad de muchas celulasas para escindir el sustrato, hace de este un ensayo útil para el cribado general para celulasas, o para sondar el éxito de una ejecución de expresión. Un punto a tener en cuenta al utilizar 4-MUC es que este sustrato es especialmente adecuado para la actividad de β-glucosidasas, por lo que la actividad de endoglucanasas (como TrCel5A) o exoglucanasas aparece débil en comparación con β-glucosidasas o mezclas de enzimas que contienen β-glucosidasas. Cuando se realiza un ensayo de 4-MUC con bajas concentraciones de proteína o niveles de actividad bajos de lo contrario, se recomienda utilizar la adición de glicina (pH 10) como una solución de parada, como la alteración del pH mejora la fluorescencia de 4-MU. CMC es un sustrato más específico para la enzima expresada aquí, ya que sólo se degrada por endoglucanasas. El ensayo de azo-CMC es más complicado que el de 4-MUC, debido a la necesidad para la precipitación de la celulosa (y metanol) por el zinc. El principal beneficio de este sustrato, y por lo tanto el ensayo, Es que es específico para la actividad endoglucanasa, lo que es muy útil para establecer la naturaleza de la celulasa que se produce. La degradación del papel de filtro es otra prueba común para establecer la actividad de celulasas. La cantidad de degradación observado varía depende significativamente de las propiedades de la celulasa que se está evaluando, y es un sustrato preferido para el examen de la actividad de mezclas de enzimas. El ensayo PAHBAH, utilizado aquí para examinar la degradación del papel de filtro, reconoce la cantidad de azúcares liberados después de la sacarificación y así es también aplicable a una amplia gama de sustratos modelo no demostrado aquí, incluyendo CMC, liquenano, β-glucano, α-celulosa, AVICEL , xilano y xiloglucano. Para este ensayo, se debe tener cuidado de incluir normas sobre el mismo plato (o en el mismo plazo) que las muestras están evaluando, como la variación en los tiempos de incubación puede dar lugar a diferencias en los resultados. Por lo tanto, es también importante repetir el ensayo para asegurar la exactitud. Además, Una muestra de control siempre se debe ejecutar, donde la muestra se incuba sin el sustrato de celulosa, para controlar por cualquier azúcares reductores presentes de forma natural en las muestras que podrían ser identificados por el PAHBAH, y de lo contrario dar resultados positivos falsos.

En conclusión, los métodos para la expresión transitoria y caracterización de una celulasa recombinante queda claramente demostrada. Estas técnicas proporcionan una manera sencilla para generar cantidades suficientes de proteína para su posterior examen de una o más celulasas, utilizando ensayos de actividad como los demostrados aquí. En particular, estos métodos proporcionan una manera rápida para examinar el potencial de celulasas designadas para la producción en planta.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse" y el Cluster de Excelencia "combustibles hechos a medida a partir de biomasa", que se financian a través de la Iniciativa de Excelencia por los gobiernos federal y estatales alemanas para promover la ciencia y la investigación en las universidades alemanas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside SIGMA-ALDRICH M6018
Acetic acid ROTH 3738
Acetosyringon (concentrated) ROTH 6003
Antibiotic - kanamycin ROTH T832
Antibiotic - rifampicin ROTH 4163
Antibiotic - carbenicillin ROTH 6344
Antibody - rabbit anti His(6) pAb ROCKLAND 600-401-382
Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb DIANOVA 111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose MEGAZYME S-ACMC
β-cyclodextrin SIGMA-ALDRICH C4805
Calcium chloride dihydrate SIGMA-ALDRICH C5080
Carboxymethyl cellulose ROTH 3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 SIGMA-ALDRICH C2730
Congo red SIGMA-ALDRICH 75768
Coomasie brilliant blue G 250 ROTH 9598.2
D(+)-glucose ROTH 8337
Ethanol ROTH K928
Filter paper - Rotilabo blotting paper ROTH CL67
NBT/BCIP SIGMA-ALDRICH 72091
MES buffer ROTH 4256
Methanol ROTH 8388
Sodium citrate ROTH 3580
Sodium dodecylsulfate SERVA 20765
Sodium hydroxide ROTH 6771
Soil, Einheitserde classic  PATZER GMBH
Spectrometer - Infinite M200 TECAN
Sucrose SIGMA-ALDRICH S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  SIGMA-ALDRICH H9882
Phosphate buffered saline ROTH 1058
UV light source - BLAK RAY UVP
Vibratome - VT1000S Leica

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References

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Ciencias Ambientales expresión heteróloga retículo endoplásmico endoglucanasa celulosa glicosil-hidrolasa fluorescencia celulasa, plantas de tabaco
Expresión recombinante de celulasa de Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; En plantas de tabaco
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Garvey, M., Klinger, J., Klose, H., Fischer, R., Commandeur, U. Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants. J. Vis. Exp. (88), e51711, doi:10.3791/51711 (2014).

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