Summary
Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir.
Abstract
Selüloz alçaltıcı enzimler arasında, selülazlar, araştırma ve hem de sanayi ilgi hedeflerdir. Bu tür hifler-yapı mantar ve anaerobik bakteriler gibi zor-organizmaların kültür, bu enzimlerin üstünlüğü, bu alanda yeniden birleştirici teknolojilerin kullanımı hızlandırdı. Bitki ifade yöntemleri enzimler ve diğer endüstriyel olarak kullanışlı proteinlerin büyük ölçekli üretimi için arzu edilen bir sistemi vardır. Burada, Nicotiana tabacum bir mantar endoglukanazın, Trichoderma reesei Cel5A arasında geçici ekspresyonu için yöntemler gösterilmektedir. Başarılı bir protein sentezleme mCherry-enzim füzyon proteini kullanılarak floresan ile gözlenmiş gösterilmiştir. Buna ek olarak, temel testler bir dizi geçici ifade T. aktivitesini incelemek için kullanılır SDS-PAGE, Western blotting, zimografi, hem de ve floresan boya bazlı alt-tabaka bozulması deneyleri de dahil olmak üzere reesei Cel5A. Burada anlatılan sistem etkin bir hücre üretmek için kullanılabilirKısa bir süre içinde ulase, kurucu ya da uyarılabilir sentezleme sistemleri ile bitkilerde daha fazla üretim potansiyelini değerlendirmek üzere.
Introduction
Lignoselülozik biyokütle ve sıvı yakıt dönüştürülmesine Bozulması fosil yakıtlara bağımlılığı azaltmak için bir yöntem olarak tasavvur edilmiştir. Ekonomik açıdan biyokütle işleme sistemleri kurulmasında önemli bir engel selüloz ve hemiselüloz 1 enzimatik bozunma bulunmaktadır. Bitki ekspresyon sistemleri, bir endüstriyel ölçekte enzimlerin üretimi için büyük bir potansiyel göstermektedir. Onlar binlerce yıldır olduğu gibi hasat bitkilerin ekonomik ve hacim için Tarımsal sistemler zaten kurulmuş. Bitkilerdeki selülaz üretimi nedeniyle autohydrolysis 2'nin kolaylığı ve bitki hücre duvarlarının 1 sindirilebilirliğini arttırarak düşük enzim seviyeleri kullanımını maksimize etmek için potansiyeli gibi faktörler arzu edilir. Son olarak, bitki sistemleri, bitki hücrelerinin belirli alanlarda rekombinant proteinlerin hedefleme izin ve posttranslationally gereklidir 3 enzimleri değiştirmek edebiliyoruz.
"ve_content>Nicotiana tabacum (tütün), çok yaygın olarak nedeniyle hızlı büyüme ve biyokütle birikiminin özelliklerine 4, bitkilerde heterolog protein ifade araştırmaları için bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Rekombinant proteinlerin geçici ifadesi lokalizasyonuna olarak esnekliği ve böylece seçilen proteinler örneğin, selülazlar posttranslasyonel modifikasyonlar da, kısa zaman dilimleri 5 protein üretimini sağlayan bir tekniktir. Aynı zamanda, bitkilerde de sentezleme stratejileri için zemin ise bu, temel analiz için selülaz (ler) üretilmesini sağlar. Böyle bir strateji kullanarak geçici ifade, ev sahibi fungal Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) türetilen bir glikozil hidrolaz ailesi 5, Cel5A, 6 bir endoglukanaz (bundan sonra TrCel5A olarak anılacaktır) üretilir. TrCel5A doğal glikosile bir 42 kDa proteini olan ve hyd olarak oldukça aktiftirselüloz zincirler 7 roylzing.
Burada anlatılan teknik, geçici ifade, bitki Agrobacteria uygun bir ekspresyon vektörü içinde, ilgi konusu geni taşıyan ile yaprakların süzülmesiyle, nispeten yaygın olarak kullanılan sistemine dayanır. Planta ifade başarılı hızlı analizi için izin vermek için, TrCel5A da mCherry, orjinal Discosoma sp türetilmiş bir monomerik floresan proteini ile bir füzyon proteini olarak ifade edilebilir. Protein birleşik bir ek altı Histidin artığı (His-tag) ile, 8, DsRed C-terminali (TrCel5A mCherry). Heterolog füzyon proteini, TrCel5A-mCherry, böylece sentezlenmesi MCherry dağılımı incelemek için yeşil ışık kullanarak büyüyen bitki içinde izlenebilir. Eğer arzu edilirse, bitki malzemesinin ince kesitler proteinin belirli bir yeri oluşturmak için mikroskobik olarak yeşil ışık altında incelenebilir. Bu çalışma, sinyal ve tran içinoturmak peptidler, endoplazmik retikulum 9, heterolog protein ihracat yerleştirmek üzere, yapı içinde yer almıştır.
Selülaz aktivite testleri bir dizi çalıştırılabilir TrCel5A içeren bitki ifade selulazlann, etkinliğini analiz etmek. Toplam çözünür bitki proteinlerinin ekstre etmeden sonra, TrCel5A kısmen bir ısıda inkübasyon teknikle saflaştırılabilir. Protein boyutu Western blotting ile ve ardından SDS-PAGE ile kurulur. Çözünürlük 10: (CMC karboksimetil selüloz hale getirmek) Zymography alt-tabakalar, karboksi-metile edilmiş, örneğin selüloz karşı aktivitesini analiz etmek için kullanılabilir. Selülaz ve glukosidaz aktivitesi (4-MUC birleştirilmiş) β-D-sellobiyosid ilişkili fluorofor 4-metilumbelliferil-(4-MU) kullanılarak izlenebilir. Endoglukanaz etkinliğini değerlendirmek için başka bir yöntem, bir azo-d ile ilişkilendirilmiştir CMC spektrometrik analiz gerektirirye (Remazolbrilliant Mavi R) 11. Buna ek olarak, endoglukanaz ve selülazların bir dizi hem de protein aktivitesi, p-hidroksi benzoik asit hidrazid (PAHBAH) deneyi 12 gibi bir şeker analizi testinin kullanımı ile kontrol edilebilir. Bu teknikler ilgi ifade selülaz aktivitesini aydınlatmak ve ölçmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vahşi tipli N. tabacum Bitkiler 1. Büyüme
- N. büyümek tabacum'un L. cv. Toprak Petit Havana SR1 bitkiler, çimlenme için, normal saksı toprağı ile doldurulmuş uygun saksılara tütün tohumları yerleştirin. 2 hafta sonra, ayrı saksılara fidan aktarın. Sabit 22 ° C (karanlık dönemi) ya da 25 ° C (ışık periyodu) ile bir sera içinde bitkiler ve% 70 nispi hava nemi inkübe edin. 16/8 saat aydınlık / karanlık döngüsü aydınlatma sağlamak (örneğin Philips IP65 400 W lamba, 180 ľmol · sn -1 · m -2; λ = 400-700 nm) günlük ve su.
TrCel5A ve TrCel5A mCherry Proteinlerin 2. Geçici İfade
- , Steril koşullar altında, Agarobacterium tumefaciens'in tek koloniler (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RIFR) pTRAkc-ER-ya da TrCel5A pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry ve 10 ml maya özütü ihtiva eden bir Erlenmeyer şişesine transfer birini içeren almakseçimi için suyu (YEB, üretici talimatları uyarınca elde edilmiş) orta ve kanamisin (50 mg / ml), rifampisin (50 mg / ml) ve karbenisilin (100 mg / ml). 26 ° C'de 36-40 saat ve 180 rpm'de inkübe edin. Not: protein ifadesi için uygun yapılarının tasarımı, bu çalışmanın kapsamı dışında olduğu, ama rehberlik için, Maclean ve ark 13 ve Munro ve Pellham 14 yöntemleri yapı tasarımı için takip edilebilir..
- Yukarıda belirtilen antibiyotik konsantrasyonları ile 20 ml YEB aşılamak ve daha önce olduğu gibi aynı koşullar altında kuluçkalanması, her kültür, 200 ul al.
- 36-40 saat sonra, 2 ul asetosiringon (200 uM son konsantrasyon), 100 ul% 40 (ağ / hac) glikoz çözeltisi ve 1 M MES tamponu, pH 5.6, 200 ul. Ekleyerek kültürleri preinduce Gecede inkübe.
- 2x infiltrasyon tamponu (100 g / L sükroz, 3.6 g / L glukoz, 8,6 g / L Murashige ve Skoog bazal tuzlar, 100 ml hazırlanması,) Potasyum hidroksit kullanılarak pH 5.6 'ya ayarlanır.
- Bir 5-6 OD 600 ulaşıncaya kadar 1:05 seyreltmeleri ile kültürlerin OD 600 ölçün. OD 600 30 ml sızma ortamı için gerekli kültür hacmini hesaplayın. 2x tamponu infiltrasyonu 15 ml ilave edilir, daha sonra 30 ml kadar tampon için deiyonize H2O ekleyin.
- Sera bitkileri alın ve sızma kolaylaştırmak için üstten 5 inci yaprak nick 3 rd abaxial tarafını bir pipet kullanın.
- Sızmasını kolaylaştırmak için nick yaprakların abaxial tarafını bir pipet kullanın.
- Infiltrasyon orta ile bir şırınga doldurun ve önceden yapılmış rumuz birinde (iğne olmadan) koydu. Adaksiyel yaprak tarafında bir parmak ile şırınga destekleyin. Aralarının yaprak bölgelerinin doku içine dikkatle orta basın. Not: infiltrasyonu sonra, yukarıda tarif edildiği gibi aynı koşullar altında bir sera içinde bitkiler yetiştirmek. Ayrıca, untr eşit oranda korumakSüzülmüş bitkilerin ile aynı koşullar altında kontrol olarak eated olmayan geçici ifade bitkileri (NTEPs).
Bitki Leaves TrCel5A mCherry İfade 3. Değerlendirilmesi
- 4-6 gün sonra, A ile infiltre bitkileri almak seradan pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry içeren ve floresan analizi için karanlık bir odaya koyun tumafaciens.
- Kırmızı bir filtre (620-750 nm) ile 515 nm yeşil ışık yayan, taşınabilir bir ışık kaynağı kullanılarak TrCel5A-mCherry, ışık bitkileri ifade yaprak bölümlerinde floresan görselleştirmek için. Not: Derinlemesine bitki yapraklarda protein ifade karakterizasyonu ışık ve floresan mikroskobu altında bir vibratome ve muayene ile ince kesit yaprakları ile elde edilebilir. Bunun için aşağıdaki adımları izleyin:
- Bir infiltre yapraktan yaklaşık 5 x 5 mm büyüklükteki, küçük bölümler kesin ve agaroz 50 mM fosfat tampon maddesi (pH 5.7) içinde çözülmüş% 4 onları gömmek.
- KesimBir Vibratome kullanarak gömülü yaprakları 80-90 mikron boyutunda bölüm. Geçici bellek ya da bir kapak kayma ile kapatın ve yukarıda belirtilen aynı dalga boyu ve filtre kullanılarak, floresans dedektörü ile 10X büyütmede mikroskop kullanarak incelemek, bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin.
Tütün yapraklarından 4.. TrCel5A Ekstraksiyon
- A ile enfekte bitkilerden, 1 g yaklaşık bir ağırlık tütün yaprakları parçalar keserek pTRAkc-ER-TrCel5A ve sıvı azot ile soğutulmuş bir havan içinde yer ihtiva tumefaciens. Örnekler, sıvı azot, uygun bir miktarda ekleyin. Taşlama bir soğutulmuş havan tokmağı kullanılarak toz halinde bırakır.
- Zemin yaprak konuyla 1 mM fenilmetilsülfonil florür ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde bir 2 ml ilave edilir ve yaprak maddenin büyük çoğunluğu süspansiyon haline gelinceye kadar karıştırın. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 15,000 x g ve protein içeren süpernatant alır santrifüj ekstresi.
- Centrifuge 4 ° C'de 20 dakika boyunca 15,000 xg'de özü ve pelet bozmak için dikkatli olmak protein içeren süpernatant alır. Pelet atın.
- Kısmen, 10 dakika boyunca 55 ° C'de protein içeren süpernatant ile inkübe TrCel5A arıtın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 15,000 xg'de santrifüj, sonra ilave bir 10 dakika boyunca oda sıcaklığında dinlenmeye bırakın. Kontrol örnekleri elde olmayan infiltre bitkiler için kısmi saflaştırma işlemi tekrarlayın. Tüm deneyler için, bu, aşağıdaki örnekleri kullanarak. Not: Protein çözeltiler 3 aya kadar için en fazla 1 hafta ya da -20 ° C 'de 4 ° C' de muhafaza edilebilir.
- Kontrol örnekleri elde olmayan infiltre bitkiler için kısmi saflaştırma işlemi tekrarlayın. Tüm deneyler için, bu, aşağıdaki örnekleri kullanarak. Not: Protein çözeltiler 3 aya kadar için en fazla 1 hafta ya da -20 ° C 'de 4 ° C' de muhafaza edilebilir.
5. SDS-PAGE, Western Blot ve TrCel5A-mCherry <of Azo-CMC Zymography/ P>
- Satın alma veya kurulmuş yöntemleri başına 15 (w / v) SDS-PAGE jelleri% 12 hazırlar.
- % 1.5 (ağırlık / hacim) çözelti elde etmek için su içinde CMC çözülür. CMC-SDS-PAGE jelleri yapmak için, (a / h) CMC +% 12 (w / v% 0.1 'de elde edilen, 10 ml SDS-PAGE jel karışım çözeltisi içinde su, 1 ml% 1.5 CMC 1 ml yerine ) SDS-PAGE jeli karışımı. Normalde jel dökün. Not: (doğrudan önce jel çözeltisinin hazırlanması için tekrar) orijinal çözelti içinde CMC tam olarak 40 ° C'ye kadar karıştırma ve ısıtma kombinasyonu ile çözülür emin olun.
- 12 bilinen yöntemlere uygun olarak, SDS varlığında kaynatılarak örnekleri denatüre. Bir pozitif kontrol olarak, T., bir ticari olarak temin edilebilir selülaz karışımı bir 1:500 seyreltme kullanın örneğin T. reesei gibi, reesei ATCC 26921. Negatif kontrol olarak non-infiltre yaprak (NTEPs) için, benzer şekilde hazırlanmış bir protein solüsyonu kullanın.
- Normal protokoller başına 15 olarak elektroforezi yürütmek,boya cephesinin, jel tabanına erişmesine bir kez, örneğin durduruldu elektroforez ile ~ 50 dakika için 200 V kullanır.
- % 0.1 kullanarak bir SDS-PAGE jel leke (ağ / hac) Coomassie parlak mavi ve bir metanol / buzlu asetik asit karışımını kullanarak destain. Not: Rapid boyama ve lekeleme destaining yavaşça ısıtılarak ve 10 dakika sonra çözelti destaining değiştirme, sıcak (ama kaynamaya) ilk olarak boyama ve daha sonra destaining çözeltiler için ~ 15 saniye boyunca bir mikrodalga kullanarak, yani solüsyonlar, lekenin tarafından yapılabilir veya soğutulmuş ve yeni destaining çözeltisi ile tekrar ne zaman.
- Tespit edilmiş protokollerin 16,17 kullanılarak bir SDS-PAGE jel Western blotting yapın. (Ikincil) bir alkalin fosfataz konjuge edilmiş bir His-tag (birincil) ve bir poliklonal keçi anti-tavşan antikoru Fc bölgesine karşı bir poliklonal tavşan antikoru: Aşağıdaki antikorlar kullanın. Not: ikincil antikorlar nitroblue tetrazol kullanarak görselleştirme izin seçilmelidiryum chloride/5-bromo-4-chloro-3 'indolyphosphate-p-toluidin tuzu (NBT / BCIP), 18, tarif edildiği gibi.
- % 0.15 'in üzerinde tekrar katlama jel protein (w / v), oda sıcaklığında, β-siklodekstrin, 20 mM fosfat sitrat tamponu, pH 6.5, 1.5%' si olarak jel inkübe edilerek (w / v) SDS-PAGE CMC jeli gerçekleştirme yumuşak, 15 dakika çalkalanarak 19.
- Β-siklodekstrin çözeltisi ve kısa bir süre atın H2O ile jel yıkayın Ilave bir 15 dakika boyunca 50 mM sodyum asetat tamponu (pH 4.8) içinde oda sıcaklığında inkübe edin. 50 ° C'de 20 dakika boyunca 30 mM sodyum asetat tamponu pH 4.8 'de inkübe jel ile katlanmış% 0.15 CMC SDS-PAGE jeli kullanılarak CMC zimografi gerçekleştirme
- (W / v) SDS-PAGE CMC jeli, 50 ° C'de 20 dakika boyunca 30 mM sodyum asetat tampon maddesi (pH 4.8) 'de jel inkübe edilerek yeniden katlanmış% 0.15' i kullanılarak CMC zimografi gerçekleştirme
- Bir% 0.1 ile 10 dakika boyunca jel leke w / 30 dakika boyunca Congo kırmızı çözeltisi ve destain v ya da açık bantları 1 M Na kullanılarak gözlenmiştir kadarCl. Net görüntüleme için% 0.3 (v / v) asetik asit ile jel yıkayın.
TrCel5A 6. 4-MUC Aktivite Deneyi
- % 50 içinde 10 mM 4-MUC (v / v) metanol içinde bir stok çözelti hazırlayın, ve oda sıcaklığında karanlıkta depolamak
- Hemen önce tahlil için, bir 4-MUC 2x çalışan 1 mM 4-MUC oluşan solüsyonu ve 60 mM sodyum asetat, pH 4.8 hazırlanır.
- (Endüklenen ifade edilen veya TrCel5A olmadan) yaprak protein 100 ul, T. 100 ul, bir ticari olarak temin edilebilir selüloz karışımı içeren bir numune üzerinde bu testi reesei 1:1,000 ve saf 2 H, O, sırasıyla. Üç nüsha olarak her örnek çalıştırın.
- 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına ayrı 4-MUC çalışma çözeltisi Pipet 100 ul, daha sonra her bir numune 100 ul ilave edin.
- 360 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanılarak, flüoresan spektroskopisi 4-MU floresan 0 dakika zaman noktası belirler.
- 20 plakaları inkübe50 ° C'de min, buharlaşmayı önlemek için yapışkan kapak ile kaplıdır. Dondurma (veya ul 0.15 M glisin, pH 10.0, ve ayrı bir tabak içinde, örneğin her 100 ul 100 birleştirerek) ile reaksiyonu durdurun.
- 360 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanılarak, flüoresan spektroskopisi 4-MU floresan uç noktasını belirler. Floresans değerlerindeki değişikliği elde etmek için uç (20 dakika) 0 dakika zaman noktasında çıkarın.
TrCel5A 7. Azo-karboksimetil selüloz Aktivite Deneyi
- % 1,5 'lik bir stok hazırlanması (a / h), oda sıcaklığında muhafaza edilir ve Azo-CMC 18 mM çinko asetat, 0.5 M sodyum asetat, pH 5 ve% 80 etanol (v / v), oda deposu ihtiva eden bir çözelti, çökeltme sıcaklığı.
- Hemen önce tahlil için,% 1 oluşan bir Azo-CMC 2x çalışma çözeltisi (w / v) Azo-CMC (H 2 O) ve 60 mM sodyum asetat, pH 4.8 hazırlanır.
- Örnek 50 ul ve 50 ul çalışma birleştirin1.5 ml tüpler içinde çözelti ing.
- (Geçici olarak ifade veya TrCel5A olmadan) yaprak protein 50 ul içeren test numuneleri; T. bir ticari olarak temin edilebilir selüloz karışımından 100 ul reesei 1:1,000 seyreltilmiş; ve saf 2 H O. Üç kopya halinde çalıştırmak numuneleri ve standartları.
- 50 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin Çökeltme çözeltisinin 250 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun. Vortex hızlı bir şekilde 10 saniye için her bir örnek çözümler tamamen birleştirildi sağlamak.
- Tekrar 10 dakika ve daha sonra girdaplı oda sıcaklığında inkübe edin. 10 dakika boyunca 1.000 xg'de Santrifüj örnekleri. Pelet bozmaya dikkat ederek, 96 oyuklu bir plakaya her bir numune 200 ul süpernatan çıkarın.
- 590 nm bir dalga boyunda emme spektroskopisi kullanılarak Deneyi.
TrCel5A 8. PAHBAH Assay
- Filtre kağıdı bir daire (~ 5.5 mm çap) kesmek için bir delik yumruk kullanın. 100 ul 60 mM NaAc, pH 4.8, ve 1 ile eklemeÖrnekler, (endüklenen ifade edilen veya TrCel5A olmadan) yaprak ya da protein ihtiva eden bir ticari T. 00 ul reesei selülaz karışımı, 1:1000 seyreltilmiş ve 300 rpm çalkalanarak 50 ° C'de 20 saat boyunca filtre kağıdı daireler ile inkübe edin. Filtre kağıdı ile kuluçkalanmıştır Her bir örnek için, aynı zamanda ayrı ayrı numune kontrol olarak filtre kağıdı olmadan yinelenen bir çözelti inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 5 100 mi çözeltisi toplam HCl ml konsantre edildi, ve mağaza ilavesi ile, H2O içinde PahBah çözülmesiyle bir 330 mM p-hidroksi benzoik asit hidrazid (PAHBAH) çözeltisi A hazırlayın. Not: En iyi sonuçlar, H2O ile 100 ml hacim yapmadan önce çözülmesini için sıcaklık altında karıştırılır PAHBAH bulamacın örneğin, 30 ml, daha küçük bir hacme kadar HCI ekleyerek elde edilir
- Oda sıcaklığında 50 mM sodyum sitrat, 10 mM kalsiyum klorür ve 500 mM NaOH ve mağaza içeren PAHBAH çözelti B hazırlayın.
- Immedgeçirmeden önce tahlile, kullanılana kadar (4 saat içinde kullanılmalıdır) buz üzerinde 9 ml tampon çözelti, saklamak için 1 mi PAHBAH reaktifi bir 1.5x çalışma çözeltisi hazırlayın.
- Isı ayarlı 0.2 veya 0.5 ml tüpler içinde örnekleri hazırlayın. Filtre kağıdı (adım 8.1), H2O içinde 45 ul ve PAHBAH çalışma çözeltisi 100 ul ile inkübe her bir çözeltinin 5 ul birleştirin. Numune kontrolleri (filtre kağıdı olmadan kuluçkaya örnekleri) aynı konsantrasyonlarda (5 ul örnek, 45 ul H 2 O, 100 ul PAHBAH çalışma çözeltisi) altında çalıştırmak gerekir. Ayrıca, 0 ve glukoz 0.2 g / L ihtiva eden 5 standartlarına (5 ul) ve saf 2 H O. testi Üç kopya halinde çalıştırmak numuneleri ve standartları.
- 100 ° C'de tam olarak 10 dakika süreyle inkübe edin, daha sonra tam olarak 10 dakika için oda sıcaklığında soğumaya. 410 nm bir dalga boyunda, 96 oyuklu bir plaka ve spektroskopik tahlil pipetleyin çözümler. Nihai elde numunelerden (filtre kağıdı olmadan kuluçkaya) bireysel örnek-kontrolleri çıkarmadeğerleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TrCel5A ve TrCel5A mCherry geçici ekspresyon sistemi (Şekil 1A ve 1B) kullanılarak başarılı bir şekilde tütün bitkilerinde ifade edildi. TrCel5A mCherry füzyon proteininin ifade deseninin incelenmesi sağlıklı yaprakları yeşil ışık (Şekil 1D) altında yaygın bir protein ekspresyonu gösterdi (Şekil 1 C) ortaya çıkardı.
Toplam çözünür proteinlerin çıkarımı ihtiva yaprağı vardı tütün bitkileri üzerinde gerçekleştirilmiştir geçici TrCel5A proteinini ifade eden ve SDS-PAGE mevcut olan (Şekil 2A, şerit 1) olan proteinlerin büyük bir çeşitlilik gösterdi. Bitki ve NTEPs türetilmiş bir toplam çözünür protein örneği ifade TrCel5A gelen toplam çözünür protein örneği, 55 ° C'de 10 dakika inkübe edildi Diğer birçok (yerli tütün) proteinleri bu sıcaklıkta kararlı değildir TrCel5A ise 55 ° C 'de, kararlı ve etkin kalır. Böylece, birçok non-essential proteinler TrCel5A bir kısmen arıtılmış, örnek bırakarak, bu muamele ile çökeltildi. Bu termik çökeltme aşamasından sonra, kuvvetli bir protein bandı ~ 40 kDa (Şekil 2A, şerit 1) gözlenmiştir. Bu bitkilerin 4 olarak ifade edilmiştir, bu ebat çalıştırmak için daha önce gösterilmiştir TrCel5A katalitik alan (CD) olması muhtemeldir. Negatif ve pozitif kontrol numuneleri (Şekil 2A, sırası ile, kulvarlar 3 ve 4) NTEPs (negatif kontrol, Şekil 2A, şerit 3) ve çok sayıda gruplardan T. bir karışımı gösteren kalan termo dayanıklı tütün proteinlerin düşük konsantrasyonlarda gösterdi reesei proteinleri (pozitif kontrol, Şekil 2A, şerit 4).
TrCel5A büyüklüğü her iki kontrol (Şekil 2B) için mevcut olduğu görülmüştür TrCel5A C-terminalinde, dahil His-6tag yönelik antikor lekelemesi ile teyit edilmiştir. TrCel5A olduğu gösterilmiştirCMC zimografi ile endoglukanaz etkinliğini muhafaza eden (Şekil 2C, kulvarlar 1 ve 2) SDS-PAGE jeli ve Western blot lekeli Coomassie olarak, ki burada tekrar katlanmış protein aynı yükseklikte, CMC bozulmasını gösteren, güçlü bir temizlenmiş alanı oluşturulur. Resim aktivitesi NTEPs (Şekil 2C, şerit 3) arasındaki olmayan selülaz protein karışımlar için gözlemlenen edildi ve karışım, T. Bir pozitif kontrol olarak reesei proteinler, birden çok bileşeni (Şekil 2C, şerit 4) için bir endoglukanaz aktivitesi göstermiştir.
Üç deneyleri kullanılmıştır TrCel5A en selülolitik aktivite ölçmek için. İlk olarak, 4-MUC bozunmasının serbest 4-MU (360 nm'de uyarıldığında) 465 nm'de artmış emisyon flüoresan gözlem ile analiz edilmiştir. T. bir ticari olarak temin edilebilir bir karışımın 1:1000 seyreltme olduğu gibi TrCel5A, 4MUC indirgeme gösterildi reesei selülazlar (Şekil 3A).
Bir niceliksel analiziCMC karşı TrCel5A aktivitesinin Azo-CMC 590 nm'de bir azo-boya salınımını ölçülmesiyle yapıldı. Bu koşullar altında TrCel5A aktivitesi (Şekil 3B), yukarıda adı geçen selülaz karışımı bir 1:1000 seyreltme aktiviteye eşdeğerdir.
Filtre kağıdı indirgeme TrCel5A kabiliyeti de analiz edilmiştir. Bu tahlil için, bir başlangıç sakarifikasyon deneyi (örneğin, filtre kağıdı bozundurucu TrCel5A çözeltisi ile) yapıldı ve ardından süpernatan (Şekil 3B) serbest indirgeyici şekerlerin miktarını tespit etmek için PAHBAH analizi ile analiz edilmiştir.
Için TrCel5A konstruktları ve TrCel5A-mCherry heterolog ekspresyonu için Şekil 1. Bitki ekspresyon kasetleribacco yeşil ışık altında floresan ile görünür bırakır. TrCel5A (A) ve TrCel5A-mCherry (B) için kullanılan bitki ekspresyon kasetinin şematik temsilleri gösterilir. Geçici TrCel5A-mC ifadeden sonra, tütün yaprakları (C) ya da yeşil ışık (D) Normal altında incelenmiştir. Paneller için (A) ve (B) CaMV promoteri (P35SS) ve sonlandırıcı sinyal (pA35S) açık mavi renkte gösterilir. Kalkon sentaz (CHS) ve His6 kodlama sekansı (His6) 5'-UTR mavi ile gösterilir. Murin mAb24 ağır zincirinden türetilen bitki kodon-optimize bir lider peptidi (LPH), yeşil tasvir edilmiştir. LPH kırmızı gösterilen bir C-terminal sinyal KDEL, ER proteini geciktiren sonra, apoplast için rekombinant proteinin salgılanmasını sağlar. Oklar CaMV 35SS ekspresyon kaseti yükseltmek için primer için bağlama sitesini etiket. Paneller (C) ve (D) için yeşil ışık bir uyarım 515 nm vardı.Görüntüleri büyütme olmadan alınmıştır.
. Şekil 2, büyüklüğü ve SDS-PAGE, Western blot ve CMC zimografi ile gösterilen TrCel5A aktivitesi toplam çözünür proteinlerin Ayrılması:. TrCel5A önce geçici olarak ifade edilmiştir tütün bitkilerinden (1) ve (2) termik çökeltme saflaştırma işleminden sonra; TrCel5A termal çökeltme işleminden sonra, mevcut olmayan tütün bitkilerinden (3); ya da T-şekilli bir ticari olarak temin edilebilir kanşımının reesei selülazlar (4). SDS-PAGE ile ayrılan proteinler Coomassie Blue lekelemesi (A), TrCel5A (B) ve His-tag bölgesine karşı Western lekeleme, ve CMC kullanılarak zimografi ile gösterilen selülaz aktivitesi ile görselleştirildiği Kongo Kırmızı (C) kullanılarak görselleştirilmiştir. PageRuler Artı(Fermentas) moleküler ağırlık işaretleyici (M) olarak kullanılmıştır.
Şekil 3,. TrCel5A. TrCel5A Enzim aktivitesi miktar tayini, 4-MUC (A), Azo-CMC (B) ve filtre kağıdı (C) ve 4-fluorofor MU (A) 'nın serbest bırakılması ile ölçülen alt-tabaka bozulması ile kuluçkalanmıştır bir azo-boya (B) ya da PahBah (C) renk değişimi izlenerek indirgeyici şekerlerin miktarının ile. Her deney üç kez tekrarlanmış için sonuçları göstermektedir. Hata çubukları standart sapmayı belirtir. Her üç deneylerde analiz numuneleri, tek başına tampon TrCel5A edildi termal saflaştırmadan sonra yağış, NTEP (WT Nt) termik çökelme saflaştırma ve T. bir ticari olarak temin edilebilir karışım sonra reesei selülazlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selülazlann Rekombinant ifadesi nedeniyle daha verimli biyoyakıt üretim sistemleri 1 için arzu, büyük ilgi alanıdır. Bitkiler, ekonomik hasat teknikleri ve büyük ölçekli biyoyakıt üretimi için çok cazip özellikleri olan autohydrolysis yöntemleri gibi özellikleri ile başarılı selülaz üretimi için pek çok olanak sunuyor. Ayrıca, proteinlerin üretilmesi için farklı lokalizasyonu kullanımı, gerekirse, translasyon sonrası modifikasyonlar 20 izin verir. Belirgin avantajlar sunarken, selülazlar esas ifadesini sağlamak için bitkiler değiştirilmesi, ya da başarılı olabilir ya da olmayabilir zaman alıcı bir yöntemdir. Tercih edilenler ifade edilen proteinlerin ve uyarılabilir sentezleme mekanizmaları sekestrasyon gibi teknikler bitkilerde başarılı bir selülaz üretimi olasılığını artırmak, ancak bu hala kurmak için birçok ay sürer. Burada, geçici sentezleme yöntemleri belirli bir selülaz için potansiyel göstermek için, gösterilmektedirbirkaç gün içinde bitki sistemleri ile üretilecek.
Floresan protein MCherry olan bir füzyon geçici protein ifadesi yöntemin başarısını göstermek üzere kullanılmıştır. TrCel5A mCherry açık bir vektör ihtiva eden Agrobacterium ile infiltre edilmiş yaprakların çoğunluğu boyunca dağıtıldı. Endoplazmik retikulum yerelleştirme ifade edilen proteinin öteleme sonrası modifikasyonları sağlar. Örneğin, glikozilasyon etkinleştirmek için bir ekspresyon sisteminin yeteneği T. gibi, ilk fungal organizmalardan elde edilir, bu selülazlar, için özellikle önemlidir reesei 21. Heterolog selülaz ifadesi için giderek daha popüler olan maya ekspresyon sistemleri, sıklıkla tam selülaz aktivitesi 22 için potansiyel bir engel olarak tartışılan enzimlerin, hiper-glikosil ile sonuçlanabilir. Plant glikosilasyon mekanizmalarhiper-glıkosılasyon dezavantajı olmadan yeniden. Buna ek olarak, bitki sistemlerinde ifade böylece protein kaynağına dikiş sağlayan, izin vermek veya translasyon sonrası değişiklik izin olmayan bölgelere lokalizasyonu sağlar. Burada gösterilen Sistem, aynı zamanda, apoplastı kloroplast, sitosol veya Golgi veziküller lokalizasyonu için farklı sinyal sekanslarına 14'ün uygulama tarafından kullanılabilir. Bu tür TrCel5A-mCherry floresan protein füzyonları, kullanımı, protein ifade başarısını hem de proteinin lokalizasyonu gösterebilir. Ancak, bu tür konjugatlar ayrıca etkinlik testleri için gerekli değildir. Bu nedenle, burada gösterildiği gibi bir non-mCherry TrCel5A yapısı ifade selülaz aktivitesi daha doğru veri elde etmek için, diğer tüm testler için kullanılması önerilir. Daha fazla deneyler için kontrolleri ile ilgili olmayan geçici sızmış bitkilerden örnekler genellikle yeterli kontroller olması görülüyor.
Ifade TrCel5A bir selülaz aktivitesinin kantitatif analiz, enzim 4-MUC, CMC ve filtre kağıdı gibi metal yüzeylere, bir dizi karşı aktif olduğunu gösterdi. Alt-tabakalar ya da her biri, bir florofor (4-MU) üzerinden ya da bir renk reaksiyonu (azo-boya veya PAHBAH) ışık saçılma analizi ile, farklı bir spektroskopik testi ile incelenmiştir. Her üç alt-tabakalar ve deneyler, çok selülaz aktivitesinin değerlendirilmesi için kullanılan, ve nispeten düz ön deneyler vardır. 4-MUC bu enzimlerin (endoglukanazlar, ekzoglukanazlar ve β-glukosidazlar) geniş bir yelpazede olarak buna karşı aktif olan bir glikozil hidrolaz aktivitesinin belirlenmesi için temel bir alt-tabaka olarak kullanılmaktadır. Analizin hızı gereksinimleri sınırlı sayıda, yüksek hassasiyetve substratı yarmak için bir çok selülazlar yeteneği, bu selülazlar için, ya da bir ekspresyon çalıştırmak başarısını tarama için genel taraması için faydalı bir deney sağlar. 4-MUC kullanırken akılda tutulması gereken bir nokta, bu alt tabaka (örneğin TrCel5A gibi) endoglukanazlann aktivitesini yapma, β-glukozidaz aktivitesi için uygundur veya ekzoglukanazlar veya enzim karışımları-glukosidazlar β kıyasla zayıf görünür olduğu β-glukosidazlar içerir. Düşük protein konsantrasyonları ile 4-MUC tahlili ya da düşük aktivite seviyeleri gerçekleştirirken bu pH değişikliği 4-MU floresan artırır olarak, bir çözüm olarak, glisin (pH 10) ve buna ek olarak kullanmak tavsiye edilir. Sadece endoglukanaz tarafından bozundurulmakta gibi CMC, burada ifade edilen, enzim için daha özel bir alt-tabakadır. Azo-CMC deney dolayı çinko selüloz (metanol) çökeltilmesi için ihtiyaç, 4-MUC için olandan daha karmaşıktır. En büyük yararı, bu alt-tabakanın ve böylece deney, Bu, üretilen selülaz doğasını kurulması için çok faydalı bir hale getirir endoglukanaz etkinliği için spesifik olmasıdır. Filtre kağıdı bozulması selülaz aktivitesini kurulması için başka bir ortak bir testtir. Gözlenen bozunma miktarı değerlendirilmekte olan selülazın özelliklerine bağlı olarak değişir önemli ölçüde ve bu enzim karışımlarının taramak için tercih edilen bir alt-tabakadır. Filtre kağıdı bozulma incelemek için kullanılmıştır PAHBAH deney, sakarifikasyon sonra yayımlanan şekerlerin miktarı tanır ve böylece aynı zamanda CMC, lichenan, β-glukan, α-selüloz, AVICEL de dahil olmak üzere, burada gösterilemeyen modeli alt tabakaların geniş bir aralığına uygulanabilirdir , ksilan ve ksiloglukan. Numuneler değerlendirilen olarak inkübasyon zamanlarında varyasyon sonuçlarına farklılıklara yol açabilir Bu tahlil için, bakım, aynı plaka (veya aynı vadede) ile ilgili standartlar eklemek için alınmalıdır. Bu doğruluğunu sağlamak için tahlil tekrar da oldukça önemlidir. AyrıcaÖrnek PahBah tarafından tespit edilebilir örnekleri doğal olarak mevcut olan herhangi bir indirgeyici şeker kontrol etmek için, selüloz alt-tabaka olmadan inkübe edilir, aksi takdirde yanlış pozitif sonuç verecek yerde, bir kontrol numunesi, her zaman çalıştırılmalıdır.
Sonuç olarak, yeniden birleştirici selülaz geçici ifade ve karakterizasyon için yöntemler açık bir şekilde gösterilmiştir. Bu teknikler, burada gösterildiği gibi, bu aktivite testlerini kullanarak, bir ya da daha çok selülaz daha fazla inceleme için yeterli miktarda protein üretmek için basit bir yol sağlar. Özel olarak, bu yöntemler bitkilerde üretimi için belirlenen selülazlar potansiyelini incelemek için hızlı bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Bmbf Forschungsinitiative tarafından desteklenen "BioEnergie 2021 - Forschung für nutzung von BIOMASSE ölmek" ve bilimi teşvik etmek için Alman federal ve eyalet hükümetleri tarafından Mükemmellik Girişimi aracılığıyla finanse edilmektedir Mükemmellik "Biyokütle den Tailor-made Yakıtlar", bir küme ve Alman üniversitelerinde araştırma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic - kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic - rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic - carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody - rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper - Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer - Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source - BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome - VT1000S | Leica |
References
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
