Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

DNA-affinitetsrenade Chip (DAP-chip) metod för att bestämma genen mål för bakteriell Två komponent regelsystem

Published: July 21, 2014 doi: 10.3791/51715
Automatic Translation
1, 1, 1
1Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

Summary

Denna video artikeln beskriver en microarray baserad in vitro-metod för att bestämma genen mål och bindningsställen för två komponentregulatorer systemets svars.

Abstract

In vivo-metoder såsom chip-chip är väl etablerade tekniker som används för att fastställa det övergripande gen mål för transkriptionsfaktorer. De är dock av begränsad nytta för att utforska bakteriella två komponent regelsystem med uncharacterized aktiveringsvillkor. Sådana system endast reglerar transkriptionen när den aktiveras i närvaro av unika signaler. Eftersom dessa signaler är ofta okänd, kan det in vitro-mikromatrisbaserad metod som beskrivs i denna video artikeln användas för att bestämma genen mål och bindningsställen för responsregulatorer. Denna DNA-affinitetsrenade-chip metoden kan användas för alla renade regulatorn i organismen med en sekvens genom. Protokollet involverar att låta den renade märkta proteinet att binda till skjuvade genomiskt DNA och därefter affinitetsrenande erhållna proteinbundna DNA: t, följt av fluorescensmärkning av DNA: t och hybridisering till en anpassad tiling array. Föregående stegen, som kan användas för att optimera analysen för specific tillsynsmyndigheter beskrivs också. Topparna som genereras genom analys av array-data används för att förutsäga bindningsställemotiv, vilka sedan experimentellt validerade. De motiv förutsägelser kan användas vidare för att bestämma genen mål av ortologa regulatorer svar på närbesläktade arter. Vi visar att tillämpningen av denna metod genom att bestämma genen mål och bindande site motiv och därmed förutsäga funktionen för en sigma54 beroende respons regulator DVU3023 i miljö bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Introduction

Förmågan hos bakterier att överleva och frodas är kritiskt beroende på hur väl de kan uppfatta och reagera på störningar i sina miljöer, och detta i sin tur är beroende av sina signalöverföringssystem. Antalet signalsystem en bakterie Kodar har kallat sin "mikrobiell IQ" och kan vara en indikation på såväl variationen i dess miljö och dess förmåga att känna flera signaler och finjustera sitt svar 1. Två komponentsignalöverföringssystem (TCS) är de vanligaste signalsystem som används av bakterier, och de består av en histidin kinas (HK) som känner av den externa signalen och sänder via fosforylering till en effektor svar regulator (RR) 2. RR kan ha en mängd olika utgångs domäner och därmed olika effektor lägen, men det vanligaste svaret är transkriptionsreglering via en DNA-bindande domän 1. De signaler, som avkänns och de motsvarande funktionerna hos vast majoriteten av TV-kamerasystem är fortfarande okända.

Även in vivo-metoder såsom chip-chip används rutinmässigt för bestämning av genomiska bindningsställen för transkriptionsfaktorer 3, kan de endast användas för bakteriella tvåkomponentsystem RR om aktiverande villkor eller signaler är kända. Ofta de miljömässiga signaler som aktiverar en TCS är svårare att avgöra än sina genen mål. Den in vitro-mikroarray-baserad analys som beskrivs här kan användas för att effektivt och snabbt bestämma genmål och förutse funktioner TV-kamerasystem. Denna analys tar fördel av det faktum att RR kan fosforyleras och sålunda aktiveras in vitro med användning av små molekyler givare som acetylfosfat 4.

I denna metod, benämnd DAP-chip för DNA-affinitetsrenat-chip (figur 1), är RR intressanta genen klonas med en His-tag i E. coli och renas därefter taggade proteinet tillåts bind att skjuvas genom-DNA. Den proteinbundna DNA sedan berikas av affinitetsrening, är det anrikade och input-DNA förstärks, fluorescerande, sammanförs och hybridiseras till en kakel array som anpassade görs till organismen av intresse (Figur 1). Microarray experiment är föremål för artefakter och därmed ytterligare steg används för att optimera analysen. Ett sådant steg är att försöka bestämma ett mål för RR som studeras med hjälp av elektro mobilitet förskjutningsanalyser (EMSA) (se arbetsflödet i Figur 2). Sedan, efter bindning till genomiskt DNA och DAP steg, är proteinbundet och input-DNA undersöktes genom qPCR för att se om den positiva målet anrikas i den proteinbundna fraktionen i förhållande till den ingående fraktionen, vilket bekräftar optimala bindningsbetingelser för RR (Figur 2). Efter array hybridisering, är de data som analyseras för att hitta toppar av högre intensitet signal som indikerar genomisk lokus där proteinet had bunden. Funktioner kan förutsägas för RR baserad på genen mål som uppnåtts. De målinriktade genomic loci används för att förutsäga bindningsställemotiv, vilka sedan experimentellt validerade använder EMSAs (Figur 2). De funktionella förutsägelser och gen mål för RR kan sedan utvidgas till att nära besläktade arter som kodar ortologa RR genom att skanna dessa genomen för liknande bindande motiv (Figur 2). DAP-chip-metoden kan ge en mängd information för en TCS där tidigare det fanns ingen. Metoden kan också användas för någon transkriptionsregulator om proteinet kan renas och DNA-bindningsförhållanden kan bestämmas, och för en organism av intresse med en genomsekvens som finns tillgänglig.

Figur 1
Figur 1. DNA-affinitetsrenat-chip (DAP-chip) strategi 7. RR-genen från organismen av intresse klonas med en karboxi-terminal His-tag i en E. coli-expressionsstammen. Purified His-märkta proteinet aktiveras genom fosforylering med acetylfosfat, och blandas med skjuvade genomiskt DNA. En alikvot av bindningsreaktionen sparas som input-DNA, medan resten utsattes för affinitetsrening med användning av Ni-NTA-harts. Ingången och RR bundna DNA är hela genom förstärkt, och märkta med Cy3 och Cy5, respektive. Det märkta DNA poolas tillsammans och hybridiserades till en plattsättning array, som sedan analyseras för att fastställa genmål. Figur modifierad och omtryckt genom att använda Creative Commons-licens från 7.

Figur 2
Figur 2. Sammanfattning av arbetsflöde. För varje renad taggade protein, börja med att bestämma ett mål med hjälp av Europeiska sjösäkerhetsbyrån. Låt protein för att binda iskt DNA och DNA-affinitetsrena (DAP) och hela genomet förstärker (WGA) den berikade och input-DNA. Om en gen som målet är känt använder qPCR för att säkerställa att det kända målet anrikas i den proteinbundna fraktionen. Om inget mål kunde bestämmas, gå direkt till DNA-märkning och array hybridisering. Om anrikning av qPCR inte kunde observeras, sedan upprepa protein gDNA bindande och DAP-WGA steg med hjälp av olika protein belopp. Använd array analys för att hitta toppar och mappa dem till mål gener. Använd de uppströms regionerna av målgener för att förutsäga bindningsställe motiv. Validera motiven experimentellt med EMSAs. Använd motivet att skanna genom av besläktade arter som kodar ortologer av RR som studeras, och förutsäga gener inriktade på dessa arter. Baserat på genen mål som uppnåtts, kan den fysiologiska funktionen av RR och dess ortologer förutsägas. Figur modifierad och omtryckt genom att använda den kreativa commons licens från 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Protokollet nedan är anpassad för bestämning av genen mål i RR DVU3023 från bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Den kan anpassas till varje annan transkriptionsregulator av intresse.

1. Clone och rena RR

  1. Klona RR genen, speciellt DVU3023, från D. vulgaris Hildenborough in i en Escherichia coli-uttrycksvektor så att den gen som är C-terminalt His-märkt och expression är under kontroll av en T7-promotor.
    Anmärkning: Flera kloningsmetoder kan användas och bestäms av forskaren. Alternativa affinitets taggar kan också användas.
  2. Förvandla uttrycket konstruera till E. coli BL21 (DE3) uttrycksstam.
  3. Väx upp 1 L av BL21 uttrycks stammen vid 37 ° C. Vid mitten log fas, lägga IPTG till 0,5 mM för att inducera proteinuttryck. Fortsätt tillväxt vid rumstemperatur under 24 timmar.
  4. Centrifugera cellerna vid 5000 xg under 10 miln vid 4 ° C. Återsuspendera cellerna i lysbuffert (20 mM natriumfosfat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM imidazol, 1 mg / ml lysozym, 1x bensonas nukleas). Lyse celler med användning av en fransk press vid 4 ° C.
  5. Centrifugera lysatet vid 15.000 x g under 30 min vid 4 ° C. Filtrera genom ett 0,45 fim sprutfilter.
  6. Tvätta en 1 ml Ni-Sepharose-kolonn på ett FPLC-instrument med användning av 10 ml av tvättbuffert (20 mM natriumfosfat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM imidazol).
  7. Load lysatet på kolonnen. Tvätta kolonnen med 20 ml tvättbuffert.
  8. Eluera DVU3023 användning av en gradient av från 0 till 100% elueringsbuffert (20 mM natriumfosfat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol).
  9. Load eluerade fraktionerna på en avsaltningskolonn, och tvätta med en avsaltningsbuffert (20 mM natriumfosfat pH 7,4, 100 mM NaCl).
  10. Centrifugera proteinprov i en hög viktgräns centrifugfilter molekylär att koncentrera proteinet. Lägg DTT till 0,1 mM och glycerol till 50% och lagra proteinet vid -20 ° C.
    Anm: Reningsmetoder måste optimeras individuellt för varje protein som studeras.

2. Bestäm Gene Mål för RR Använda Elektro Mobility Shift Assay (EMSA)

  1. PCR-amplifiering av 400 bp-regionen uppströms av målgenen kandidat DVU3025, med användning av D. vulgaris Hildenborough genomiskt DNA som mall, och en främre omärkt primer och en omvänd 5'-biotin-märkt primer.
    OBS: Tips för att välja en kandidat målgen: Ofta RR binder uppströms regionerna i sin egen gen / operon, eller de kan reglera proximalt kodade gener. Om RR har ortologer i andra arter, leta efter gener som är bevarade i grannskapet. Alternativa metoder inkluderar att välja kandidatgener baserade på regulon förutsägelser (t.ex. RegPrecise 5), eller att förutsäga sigma54-beroende promotorer 6 för RR, som själva sigma54-beroende.
  2. Kör PCR-produkten på en 1% agarosgel, skär ut den 400 bp stora produkt, och rena DNA med hjälp av en gel extraktion städa kit.
  3. Blanda DVU3023 protein (0,5 pmol) med 100 fmol av biotinylerat DNA-substrat i 10 mM Tris HCl, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25% glycerol och 1 | ig / ml poly dI.dC (icke specifika konkurrerande DNA) i en total volym av 20 | il. Också inrätta en reaktion utan något protein som en kontroll. Inkubera reaktioner vid rumstemperatur på bänken för 20 min.
  4. OBS: Detta är standardförhållanden som anges och andra reaktionskomponenter kan tillsättas beroende på RR av intresse. Om aktivering önskas, tillsätt 50 mM acetyl fosfat till reaktionen (ofta RR binder DNA in vitro utan aktivering).
  5. Pre-kör en prefabricerad mini 6% polyakrylamid-0,5 x TBE-gel i 0,5 x TBE-buffert vid 100 V under 30 min. Lägg 5 ^ 5x laddningsbuffert (0,1% bromfenolblått, 0,1% xylencyanol, 30% glycerol i 1x TBE) för bindningsreaktioner och belastnings 18 l av reaktionerna på den gel. Kör vid 100 V under 2 timmar.
    Notera: För att undvika överhettning, vilket kan leda till dissociation av protein-DNA-komplex, fylla den yttre buffertkammaren i elektroforessystem med rinnande buffert, så att huvuddelen av gelén är isolerad genom bufferten. Alternativt kan gelén kördes vid 4 ° C.
  6. Skär ett laddat nylonmembran till storleken på gelen och dränk den i 0,5 x TBE i minst tio minuter. Ta bort gelen från kassetten. Skär några kanter utanför gelén och sandwich gelén och membranet mellan två tjocka filterpapper indränkt i 0,5 x TBE, och placera i en halvtorr blottingapparat och kördes vid 20 V under 30 min.
  7. Placera membranet i en kommersiell UV-ljus tvärbindnings instrument och ställa in tiden till 3 min.
    Anm: Membranet kan nu lagras torrt vid rumstemperatur i flera dagar innan man går vidare till nästa steg.
  8. Använd en kommersiellt tillgänglig kemiluminiscent upptäckt kit som använder en streptavidin-pepparrot peroxidase-konjugat att framkalla blotten enligt tillverkarens instruktioner.
  9. Bild på blot med hjälp av en dator ansluten till en CCD-utrustad kamera och leta efter en förändring i DNA-substratet rörlighet i närvaro av RR, vilket tyder på att RR binder DNA-testas.
    OBS: Specificiteten för protein-DNA-shift kan testas genom att i reaktionen ett överskott av omärkt konkurrerande DNA, vilket bör eliminera eller minska skift sett.

3. Verifiera Target Berikning efter Iskt DNA-proteinbindning

  1. Genomiskt DNA-protein-bindningsreaktion
    1. Skjuvning genomiskt DNA till en genomsnittlig storlek på 500 bp genom sonikering 100 ul genomisk DNA (vid koncentrationer från 100 till 200 ng / | il) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med hjälp av en mikrospets med 9 med låg amplitud pulser av 1 sekund, med 2 sek gap däremellan vardera.
      OBS: Om DNA splatters till sidorna av röret, spinn ner innehållet efter varje 3 pulser. De exakta betingelser som användeskommer att variera med sonikator instrument som används. De klippta DNA-fragmenten kan variera från 100-1000 bp, men den genomsnittliga storleken skall vara inom 400 till 600 bp. För mycket klippning kan resultera i färre intakta bindningsställen, och antingen för mycket eller för lite klippning kommer att påverka biblioteks förberedelser under de efterföljande hela genomet amplifieringsstegen.
    2. Blanda 2-3 pg av klippt genomiskt DNA med RR-protein (0,5 pmol DVU3023) i 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 25% glycerol och 50 mM acetylfosfat. Inkubera reaktioner vid 25 ° C under 30 min. Överför 10 ul av denna reaktion i ett 1,5 ml rör och etikett som input DNA.
      Anm: Acetyl fosfat tillsättes för att aktivera proteinet genom in vitro fosforylering. Fosforylering stimulerar DNA-bindande, men många RR binder också DNA in vitro utan aktivering 7. Mängden protein som sattes till reaktions kommer att bero på aktiviteten hos proteinet prep. Europeiska sjösäkerhetsbyrån kan användas för att väljaimize detta belopp.
  2. Affinity rena proteinet bundna DNA
    1. Tillsätt 30 pl av Ni-NTA-agaros-harts till ett 0,6 ml mikrofugrör. Centrifugera vid 100 x g under 1 min för att samla upp hartset i botten, och avlägsna supernatanten. Addera 100 pl av tvättbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 25% glycerol), flick röret för att blanda och centrifugera vid 100 x g under 2 min. Avlägsna supernatanten.
    2. Tillsätt resten av 90 | il av bindningsreaktionen till tvättades Ni-NTA-harts och inkubera i en roterande skakanordning under 30 min.
    3. Centrifugera vid 100 x g under 2 min och avlägsna supernatanten (obundet DNA). Addera 100 pl av tvättbuffert, flick röret för att blanda innehållet och centrifugera vid 100 x g under 2 min. Avlägsna supernatanten. Upprepa tvättningen ytterligare två gånger.
    4. Lägg 35 ul av elueringsbuffert (20 mM natriumfosfatbuffert pH 8, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol) till hartset och blanda genom att vortexa. Inkubera på bänken vid RT i 5 min. Centrifugera vid 100 x g under 2 min. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör och etikett som proteinbundet DNA-fraktionen.
    5. Lägg även till 35 | il av elueringsbufferten till ingången DNA.
    6. Rena den ingångs-och proteinbundna DNA-fraktioner med användning av ett PCR-reningskit.
  3. Hela genomet förstärka in-och proteinbundna DNA-prover.
    1. Tillsätt 10 | il av den ingående och proteinbundet DNA för att separera PCR-rör. Tillsätt 1 l av 10 x Fragmentering buffert, 2 pl Library Förberedelser buffert, och 1 l av Bibliotek Stabiliserings lösning till varje prov. Blanda väl genom skakning. Värm i en termocykler vid 95 ° C under 2 min, och kyla på is.
      Obs: Den utgångspunkt för DNA bör vara minst 10 ng för att undvika att införa förstärkning partiskhet.
    2. Lägg till en fil av biblioteks Framställning Enzyme, blanda genom att pipettera och inkubera i termocykler vid 16 ° C/20 min, 24 ° C/20 min, 37 ° C under 20 min, 75 ° C / 5 min, Och håll vid 4 ° C.
    3. Till varje rör, tillsätt 47,5 | il vatten, 7,5 | il av 10x amplifiering huvudblandning och 5 | il av polymeraset. Blanda väl och värm vid 95 ° C / 3 min, följt av 20 cykler av 94 ° C/15 sek, 65 ° C / 5 min. Håll reaktioner vid 4 ° C.
    4. Rena den amplifierade DNA-prover med användning av ett PCR-reningskit och mäter DNA-koncentration spektrofotometriskt.
  4. Verifiera mål anrikning i proteinbundna DNA med qPCR
    1. Design qPCR primers att förstärka 200 bp av uppströms regionen av EMSA-verifierade målgen (DVU3025) använder någon fritt tillgänglig primer design mjukvara.
    2. Ställ in trefaldiga qPCR reaktioner för varje DNA-mall med varje primer set. Förbered en Master Mix för varje primer set. 1x Master Mix innehåller 10 pl 2x SYBR Green qPCR mix, 0,5 ^ M av varje primer och vatten till totalt 18 pl. Alikvotera 18 | il av huvudblandning per brunn i en 96-brunnars PCR-platta.
    3. Dilute den amplifierade och renade ingång och proteinbundna DNA-prov till 5 ng / ^ il med vatten och användas som DNA-mall. Lägg 2 pl av DNA-mall till brunnarna.
    4. Täta plattan med en extremt tydlig qPCR tätningsfilm, spinn ner plattan i en centrifug vid 200 xg / 1 min. Placera plattan i en realtid qPCR maskin. Cykla på följande sätt med hjälp av tillhörande qPCR programvaran: 95 ° C / 1 min och 40 cykler av 95 ° C/10 sek, 59 ° C/15 sek, och 70 ° C/35 sek.
    5. Också inrätta trefaldiga qPCR reaktioner med primrar för att amplifiera uppströms regioner av en orelaterad gen (negativ kontroll).
    6. Beräkna ΔC T genom att subtrahera C T-värde av proteinbundet DNA från den hos den ingående DNA. Beräkna faldig anrikning av mål-genen i proteinbundna DNA som 2 ΔC T.
      OBS: Om målet uppströms regionen anrikas i proteinbundna DNA vs ingångs DNA, betyder det att de bindande reaktioner och affinitetsrening var successful. Gå vidare till steg 4. Om anrikning av målet uppströms regionen inte iakttogs, upprepa bindningsreaktioner (steg 3.1) med olika mängd protein.

4. DNA-märkning och Array hybridisering

  1. Label Input DNA med Cy3 och Berikad DNA med Cy5
    Anm: Cy3 och Cy5 färgämnen är ljuskänsliga och försiktighet bör iakttas för att hålla ljus exponering till ett minimum.
    1. Blanda 1 mikrogram DNA med 40 pl Cy3/Cy5-labeled 9-merer och justera volymen till 80 pl med vatten.
    2. Värme denaturera vid 98 ° C under 10 minuter i mörker (i en termocykler). Snabb kyla på is under 2 min.
    3. Lägg 2 | il Klenow-polymeras (3'-5'-exo -, 50000 U / ml), 5 mM dNTP och 8 | il vatten till varje reaktion, blanda väl och inkubera vid 37 ° C under 2 h i mörker (under en termocykler).
    4. Lägg EDTA till 50 mM för att stoppa reaktionen och NaCl-lösning till 0,5 M.
    5. Överför proverna till 1,5 ml rör fortsaining 0,9 volym isopropanol, inkubera i mörker under 10 min, och centrifugera vid 12.000 x g under 10 min. Den pellets ska vara rosa för Cy3-märkt DNA och blå för Cy5-märkt DNA.
    6. Tvätta pelleten med 80% etanol (500 | il) och centrifugera vid 12.000 xg under 2 min. Lufttorka pellets för 5-10 min i mörker.
      Anm: Pellets kan förvaras vid -20 ° C.
    7. Resuspendera pelleten i 25 pl vatten. Mät DNA-koncentrationen spektrofotometriskt.
    8. Pool tillsammans 6 ug vardera av Cy3-och Cy5-märkta DNA i ett 1,5 ml rör och vakuumtorka i en centrifug på låg värme i mörker (täcka centrifugen luckan om den är genomskinlig).
      Anm: Pellets kan förvaras vid -20 ° C tills redo för hybridisering.
  2. Microarray-hybridisering
    1. Slå på hybridisering systemet på 3-4 timmar före användning och ställ in temperaturen på 42 ° C.
    2. Bered en hybridisering lösning Master Mix sådan att 1x lösning innehåller 11,8 pl 2x HybridÎnisation buffert, 4,7 l hybridisering Komponent A, och 0,5 pl anpassning oligo.
    3. Resuspendera pelleten i 5 jil vatten. Lägg till 13 l av denna blandning till provet. Vortexa i 15 sekunder, inkubera vid 95 ° C i ett torrt bad under 5 min. Förvara proverna vid 42 ° C i hybridisering systemet tills klart för lastning.
    4. Förbered microarray slide-blandare aggregatet, enligt tillverkarens protokoll.
    5. Placera blandaren-skensatsen i hybridisering systemet. Belastning 16 ul av provet i påfyllningsöppningen, försegla portar med en limfilm, sväng blandning på i systemet, och att hybridisera under 16-20 timmar vid 42 ° C.
    6. Bered 1x tvättbuffertar I (250 ml), II (50 ml) och III (50 ml) genom att späda 10x kommersiellt tillgängliga buffertar i vatten, och till var och lägga DTT till 1 mM. Varm buffert I till 42 ° C.
    7. Skjut mixer-glida in i en demonteringsverktyg, och plats i en skål med varm Buffer I. Peel blandaren bort, medan kraftigt shid en samlad bedömning demonteringsverktyget för hand.
    8. Placera objektglaset i en behållare med 50 ml tvättbuffert I och skaka kraftigt i 2 minuter för hand.
    9. Överför glida in i en andra behållare med 50 ml tvättbuffert II och skaka kraftigt under 1 minut för hand.
    10. Överför glida in i en tredje behållare med 50 ml tvättbuffert III, och skaka kraftigt i 15 sekunder för hand.
    11. Snabbt blot kanterna av bilden på en pappershandduk, och placera i en bild rack. Centrifugera vid 200 x g under 2 min för att torka bilden. Placera inom slide fall, slå in den med folie och förvara i en torkapparat.
  3. Skanna Array
    1. Placera bilden i microarray skannern enligt instrumentets instruktioner.
    2. Använd skannerprogrammet för att ställa de våglängder som 532 nm = Cy3 och 635 nm = Cy5, och de initiala fotomultiplikatorn vinster mellan 350 och 400.
    3. Förhandsgranska bilden för att lokalisera arrayen på bilden. Välj arrayen region för skanning. Skanna arrayen och justera fotomultiplikatorn inställningarna så att matrisfunktioner är mestadels gula. Histogrammet ska visa de röda och gröna kurvorna överlagrade eller så nära varandra som möjligt. Kurvorna ska sluta ovanför de 10 -5 normaliserade räknas på mättnad.
    4. Spara både 532 och 635 nm bilder separat.
  4. Array dataanalys
    1. Importera bilder till en array analysprogram. Med hjälp av programvaran, skapa två par rapporter (. Par) för varje array (för Cy3 och Cy5 bilder). Skapa skalade log 2 ratio filer med par filer. Använd log 2 ratio filer för att söka efter toppar med hjälp av ett skjutfönster på 500 bp. Karta toppen loci till uppströms regionerna av genen mål.
    2. Kontrollera om det positiva målet (bestämd med hjälp av Europeiska sjösäkerhetsbyrån och bekräftats av qPCR, DVU3025 i detta exempel) visas i de bästa topparna.
      OBS: Om det positiva målet är inte bland de bästa hits, är det möjligt att RR i consiUPPHÄVA RANSONERINGEN AV har flera genmål och replikera DAP-chips kan utföras och toppar är gemensamma för alla replikat kan användas för att generera en mållistan.

5. Binding Site Motif Prediction och validering

  1. Hämta sekvenser för uppströms regioner (400 bp) för de bästa genen mål som genereras av DAP-chip analys. Applicera MEME på dessa sekvenser genom Mikrober Online (meme.nbcr.net) för att förutsäga motiv.
    Anm: Enhancer-bindande proteiner såsom sigma54-beroende regulatorer kan binda flera hundra baspar uppströms om startstället. För andra transkriptionsregulatorer, en kortare region såsom 200 bp uppströms kommer att vara tillräcklig.
  2. Design topp-och bottensträng DNA-oligomerer som innehåller den förutsagda bindningsställe motiv flankerad av 10 baser på varje ände. Beställ den översta strängen 5 'biotinylerad.
  3. Blanda de övre och undre sträng oligos i 1:1,5-förhållande i 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA och 50 mM NaCl ien total reaktionsvolym av 20 | il i PCR-rör. Värm till 95 ° C under 5 min i en termocykler följt av långsam kylning till 25 ° C. Späd tio gånger och använda som vildtyp dsDNA substrat för EMSA.
  4. Förbered modifierade substrat med samma steg som ovan, men konstruktions oligomerer att bära 4-6 byten i de bevarade grunderna för den bindande motiv.
  5. Ställ in bindningsreaktioner med RR och vildtypen eller modifierade substrat och undersöka med hjälp av Europeiska sjösäkerhetsbyrån som beskrivs i steg 2.
  6. Obs: Den förutspådda motiv valideras om RR binder vildtyp substrat men inte den modifierade ett.

6. Bevarande av motiv i andra relaterade bakteriearter

  1. Välj genom av intresse som innehåller ortologer av DVU3023. Skaffa sekvens och anteckningsfiler för genomen från NCBI webbplatsen.
  2. Använd ett programmeringsspråk såsom Perl för att skriva skript som kommer att använda den motivsekvenserna från DAP-chip mål för att bygga en posUtgåva vägt matris och använda matrisen för att göra mål liknande motiv som finns i andra sekvenserade genom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoden ovan tillämpades för att fastställa de globala genmål av RRS i modellen sulfatreducerande bakterie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Denna organism har ett stort antal TV-kamerasystem som representeras av över 70 RR, anger många möjliga signaler som den känner och reagerar på. In vivo-analyser på funktionerna i dessa signalsystem är svåra att utföra eftersom deras signaler och därmed deras aktiverande villkor är okända. Här DAP-chip metod användes för att bestämma genen mål och på så sätt förutse möjliga funktioner för en representativ RR DVU3023.

DVU3023 är en sigma-54-beroende RR kodad i ett operon med dess besläktade HK (Figur 3A). Den C-terminala His-märkt-genen klonades in och renades från E. coli. För första mål beslutsamhet, var det renade RR testas för bindning till sin nedströms operon som är en tio gen-operon (DVU3025-3035) consisting av laktat-upptagnings-och oxidations-gener. RR DVU3023 skiftas uppströmsregionen av DVU3025 (figur 3B). Nästa RR DVU3023 tilläts binda till skjuvade D. vulgaris Hildenborough genomiskt DNA. Fastän fosforyleringen inte krävdes för att binda till promotorregionen hos DVU3025 ades acetyl fosfat sattes till reaktions i fall det var nödvändigt för bindning till andra promotorer. Efter affinitetsrening av proteinbundet DNA-fraktionen var qPCR används för att visa att det uppströms belägna området av DVU3025 berikas (8,45-faldigt) i proteinbundna fraktionen (C T = 6,9) i förhållande till den ingående DNA (C t = 9,98 ) (figur 3C), vilket sålunda indikerar att bindningsbetingelserna som användes var lämpliga för RR DVU3023. Brist på anrikning av promotorregionen av en slumpmässigt vald gen (DVU0013) användes som en negativ kontroll.

De proteinbundna och input-DNA-prover märktes sedan fluorescent och hybridiseras tilla D. vulgaris Hildenborough kakel array som hade en hög sondtäthet i de intergena regioner. De översta fyra toppar valdes som den mest sannolika målen för DVU3023 (Figur 3D). Dessa fyra toppar följdes av flera andra, som också identifierades i DAP-chip analyser för flera andra RR och således verkar vara klibbig DNA (tabell 1). Figur 3E är en schematisk representation av de gener som regleras av DVU3023. Den positiva mål DVU3025 var den första toppen som erhålls med den högsta poängen. Två genen mål är två andra var för sig kodade laktat permeaser (DVU2451 och DVU3284). Den fjärde gen målet ligger inte i en uppströms region, men i intergenregionen mellan två konvergent transkriberade gener / operon (DVU0652 och DVU0653). Detta är en stor intergenregion, och dessutom också kodar för en förutsagd sigma54-beroende promotor. Det är möjligt att det finns en oupptäckt Srna kodas i denna region som är reglenas av RR DVU3023.

Med hjälp av de uppströms regionerna av de mål som erhållits genom DAP-chip var MEME användas för att förutsäga ett bindningsställe-motivet (figur 3F, tabell 2). EMSA-substrat som bär den specifika motiv uppströms DVU3025 var utformade för att bekräfta att RR DVU3023 känner igen och binder den predikterade motiv. Motivet var valideras ytterligare genom att göra byten i de bevarade baser i motivet som eliminerat bindande shift (figur 3G). Denna validerade motiv användes sedan i Perl-genererade skript för att skanna genom ordnar av andra närbesläktade sulfat reducerande bakterier som hade ortologer för DVU3023. Loci valdes som möjliga genmål när motivet fanns i uppströms regioner av öppna läsramar (tabell 3). Använda motivsekvenser förutspådda för ortologa RR, var en konsensusbindningsställe motiv genereras (Fig. 3F) som liknade one erhållits för D. vulgaris Hildenborough ensam.

Figur 3
Figur 3. Fastställande iska mål för D. vulgaris gensvar regulator DVU3023. A. DVU3023 kodas i ett operon med dess besläktade HK. Nedströms operonet har en sigma54-beroende promotorn (böjt svart pil) och användes som en målgen kandidat. B. Renad RR DVU3023 bunden och skiftade uppströmsregionen av DVU3025 7. C. Q-PCR av uppströmsregioner DVU3025 (positiv målet) och DVU0013 (valt som en negativ kontroll). E är proteinbundet berikad DNA-fraktion, är jag input DNA. D. Topp fyra toppar som erhållits efter DAP-chip analys. Start och End hänvisar till DNA-koordinater i början och slutet av peAKS; poäng hänvisar till loggen 2R förhållandet mellan den fjärde högsta sonden i topp; Fdr = false discovery takt; cutoff_p är cutoff procent när den topp identifierades. E. Schematisk representation av genen som mål för DVU3023 baserade på DAP-chip toppar. Siffrorna i rutorna anger det högsta antalet i D. HK-RR gener är i grönt, mål gener i blått och andra gener i grått. Svart böjda pilar är sigma54-beroende promotorer, är gröna fyllda cirklar förutspådde bindningsstället motiv. Gene namnen är som följer: por - pyruvat ferredoxin oxidoreduktas; llp - laktat permeas; GLCD-glykolat oxidas; GLPC-Fe-S kluster-bindande protein; PTA - phosphotransacetylase, ack-acetat kinas, lldE - laktatoxidas subenhet, lldF / G - laktatoxidas subenhet; MCP -. Metyl-acceptera kemotaxi protein F. Weblogo 8 bilder av predicted bindningsställe motiv. Top - härlett från DAP-chip mål; Botten - härrör från bindningsställen som finns i genomet med ortologer av DVU3023 7 G. Validering av förutspådde bindningsställe motiv med hjälp av EMSA.. DVU3023 skiftas vildtyp-motivet (vikt), men inte den modifierade motiv (m). Sekvenser som W-och M-motiv visas på höger 7. Figur modifierad och omtryckt genom att använda Creative Commons-licens från Rajeev et al 7.

Tabell 1
Tabell 1. Top 20 toppar från DAP-chip array analysen. Tabellen är uppdelad i tre avsnitt. Peak attribut visar detaljer i topparna som genereras av array analysprogram, där plats avser huruvida toppen hittades i genomet eller extrakromosomala plasmiden, börja och sluta hänvisa till stårta och slut loci för toppen, hänvisar Betyg på log 2 R förhållanden för den fjärde högsta sonden i topp, hänvisar Fdr till den falska upptäckten kurs värde, och cutoff_p är cutoff procentsats med vilken topp identifierades. De två andra delarna Starta samordna kartläggning och End samordna kartläggning kartan början och slutet loci, respektive, av toppen till genen. I dessa avsnitt Gene sträng refererar till strängen kodande genen, offset indikerar avståndet från början av genen (positiva värden anger lokus är uppströms från genen, medan negativa värden anger lokus är inom genen), är SANT Overlap genen värde om locus lappar en gen hänvisar DVU till DVU # av genen som koordinaterna karta till och Beskrivning indikerar genen anteckning. Tabell modifierad och omtryckt genom att använda Creative Commons licens från Rajeev et al 7. Klicka här för att visa alArger version av denna tabell.

Tabell 2
Tabell 2. Sekvenser används för att bygga konsensus DAP-chip målbaserad motiv i figur 3. Tabell modifierad och omtryckt genom att använda Creative Commons-licens från Rajeev et al 7.

Tabell 3
Tabell 3. Bindningsställe motiv för DVU3023 ortologer som finns i andra sekvense Desulfovibrio och närstående arter. För varje genomet skannas, är organismen namn anges, följt av locus-taggen för DVU3023 ortolog och dess procent identitet till DVU3023 inom parentes. Betyg anger värdet tilldelats av Perl-programmet bygger på likhet till ingången sekventielltCES. Beskrivning anger genen anteckningar för generna i målet operon. Tabell modifierad och omtryckt genom att använda Creative Commons-licens från Rajeev et al 7. Klicka här för att se en större version av den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DAP-chip-metod som beskrivs här har med framgång använts för att bestämma genen mål för flera RRs i Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 av vilka en visas här som ett representativt resultat. För RR DVU3023, välja en kandidat gen mål var enkelt. DVU3025 är belägen omedelbart nedströms om RR-genen och RR och målgener är konserverade i flera Desulfovibrio arter, och dessutom DVU3025 har en förutsagd sigma54-beroende promotor. EMSA tillhandahåller en enkel metod för att snabbt testa RR för bindning till målgenen kandidat, och tillåter också en bedömning av aktiviteten för det renade proteinet provet, samt bestämma optimala protein-DNA-bindningsförhållanden.

Den DNA-bindande aktiviteten kan även testas i närvaro och frånvaro av acetylfosfat att se om fosforylering är nödvändig för DNA-bindning. Inte alla RR fosforyleras av småmolekylära donatorer9, i dessa fall den renade besläktade sensor kinas, om sådana finns, kan användas för att aktivera proteinet. Det finns också atypiska RR kända som saknar viktiga aktiva site rester i mottagarens domän och inte aktiveras genom fosforylering 10. För majoriteten av RR studerade, stimulerar fosforylering DNA-bindning 11. Men det finns exempel där fosforylering inte påverkar in vitro DNA-bindning 12, och det finns exempel där det krävs fosforylering för att binda 13, och även fall där den undergrupp av initiativtagarna bundna ökar med fosforylering 14. DAP-chip-metoden kan utföras med och utan fosforylering för att bestämma om det finns skillnader i den uppsättning av promotorer som är bundna av RR. Det bör emellertid också noteras att vissa RR kan renas i en funktionellt fosforylerad form från E. coli 13.

Protokollet som beskrivs här är för en His-märkt protein sådan att proteinbundet DNA affinitetsrenas med användning av Ni-NTA-agaros-harts, men det kan lätt anpassas för alla typer av märkta proteinet genom användning av den lämpliga affinitetsharts för pull-down. Efter DAP-WGA steg ger qPCR steg ytterligare en kontroll för att se till att protein-gDNA bindningsförhållandena var lämpliga och att den proteinbundna DNA framgångsrikt berikas av affinitetsrening. Mer än 3-faldig anrikning är tillräcklig för att fortsätta med hybridiseringssteget. Till skillnad från den EMSA reaktion, finns det ingen icke-specifik konkurrent-DNA som poly-dI.dC tillsatt i gDNA bindningsreaktionen eftersom det stör den WGA steget. På grund av detta om provet proteinet har icke-specifik DNA-bindningsaktivitet då klar vinst för bekräftad mål-DNA kommer inte observeras av qPCR. Således qPCR styrsteget kan användas för att optimera mängden av protein som används i gDNA bindningsreaktionen. Kommersiellt tillgängliga kit för hela genom förstärkning hävdar att introduce ingen förstärkning partiskhet när du följer deras riktlinjer för minsta start DNA-material och lågt antal amplifieringscykler. Förstärknings partiskhet kan kontrolleras med hjälp av qPCR med olika primer set på förstärkt kontra oamplifierat DNA. Någon effekt på nedströms array hybridisering kan också bestämmas genom att på olika sätt märka och hybridisering poolade förstärkta och oförstärkta iskt DNA.

Listan med toppar som genereras följande matrisdataanalys är vanligtvis lång med flera toppar som har en falsk upptäckten hastighetsvärde av 0. Därför en kombination av andra topp attribut såsom högt log 2 R scores och cutoff_p värden (som genereras av array analys programvara som används i denna studie) används för att slakta ner listan till de högsta förtroende genen mål. Närvaron av den förutbestämda gen mål bland de fem hits stärker kraftigt förtroendet för datamängden. Att utföra denna analys för ett antal regulatoriska proteiner tillbakam samma organism kommer också att hjälpa till att identifiera "klibbiga" DNA-sekvenser som visas i flera datamängder 7. Dessutom om en bindningsställe motiv kan förutsägas och valideras sedan förekomsten av motivet i topparna sänka ned i listan kan också användas för att välja en konservativ målgen listan. Anrikning av andra än promotorregioner DNA-sekvenser kan vara artefakter av array hybridisering eller kan tyda på regleringen av tidigare oidentifierade öppna läsramar eller små RNA 7. För regulatorer där en gen mål inte kunde förutbestämda med hjälp av Europeiska sjösäkerhetsbyrån, kan DAP-chip test genomföras för "blinda" 7. I sådana fall också kommer att identifiera ett bindningsställe motiv förbättra urvalet av genen mål. Bestämning av proteinkoncentrationer som skall användas i analysen kommer att bero på den icke-specifika bindningsaktiviteten hos proteinet, som kan bedömas av EMSA med användning av slumpmässigt utvalda DNA-substrat. Lägre koncentrationer fungerar bättre för tslang proteiner med hög icke-specifik bindningsaktivitet. Tillförlitligheten av en blind DAP chipet kan förbättras genom att utföra upprepade analyser med olika proteinkoncentrationer. För RR med få mål, kanske bara två eller till och med en enda analys vara tillräcklig för att generera ett mål lista som kan valideras med hjälp av efterföljande EMSAs. Uppgifterna DAP-chip för sådana RR brukar visa ett tydligt hopp i loggen 2 R-poäng eller cutoff_p värden utöver de initiala få toppar. För RR med flera mål, kan data från tre replikat analyseras för att skapa en lista med vanliga toppar, av vilka kan väljas för EMSA validering.

Förmågan att förutsäga bindningsstället motiv baserade på DAP-chip mål läggs till värdet av denna metod och kraftigt ökar den information de fått. EMSA har återigen ett effektivt protokoll för att experimentellt verifiera förutsägelser. Programvaru skript i Perl eller andra programmeringsspråk kan användas för att snabbt söka igenom tillgängliga genom sequeNCES. Resultaten kommer att identifiera både ortologa målgener samt målgener unikt regleras i genomen sökte. I den representativa resultat som visas här, har tre av de fyra uppströms målområdena identifierats för DVU3023 kommenterad gen funktioner relaterade till laktat upptag och oxidation. Dessutom eftersom bindningsstället motiv för DVU3023 validerades, kunde andra genom sökas för liknande motiv webbplatser. Tillsammans indikerar resultaten att den DVU3022-3023 TCS är väl konserverad i Desulfovibrio och andra besläktade sulfatreducerande bakterierna, och att den reglerar gener för laktat transport och oxidation till acetat. Eftersom laktat är den primära kol och elektronkälla som används av dessa organismer, DVU3023 spelar troligen en viktig roll i deras fysiologi. Bland de bästa DAP-chip toppar för RR DVU3023, fanns det också en intergenregion. Även om ett bindningsställe motiv inte kunde hittas i denna region, föreslår närvaron av en förutsagd sigma-54-beroende promotor thatt kan det finnas en oidentifierad ORF eller Srna kodad, och att det kan vara en riktig mål för DVU3023. Detta fynd belyser värdet av den experimentella metod DAP-chip i kombination med bindande site förutsägelser i motsats till att fastställa mål webbplatser baserat på beräknings förutsägelser ensam.

Liknande metoder in vitro, såsom den som beskrivs här har endast använts i ett fåtal fall från 15 till 17 och mycket sällan för en tidigare unstudied regulator. Optimeringen EMSA och qPCR steg före arrayen hybridisering kommer att avsevärt hjälpa till vid analys av resultaten när metoden som skall användas för en ny regulator. Om matris utskrift blir ett hinder, kan DAP steg kombineras med nästa generations sekvensering för att erhålla bindningsställen 18,19. När fler array-baserade metoder blir ersättas med sekvensbaserade strategier, såsom framtida anpassningar av metoden kringgår behovet av att utforma anpassade kakel microarrays för organism av intresse. Chip-Seq teknik resulterar i större känslighet och specificitet för detektion av toppar jämfört med chip-chip metoder, och är också snabbt på att bli mer kostnadseffektiv 20. Även om denna artikel fokuseras på två komponentregulatorrespons kan denna metod användas för någon prokaryot eller eukaryot transkriptionsfaktor 15. Nukleosomen occupancies har ofta en effekt på mål som är reglerad och att jämföra den målbindande ställen för eukaryota transkriptionsfaktorer från in vivo-och in vitro-analyser kan avslöja dessa effekter 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att lämna ut.

Acknowledgments

Vi tackar Amy Chen för hennes hjälp i förberedelserna för video shoot och för att demonstrera tekniken. Arbetet utfördes av ENIGMA: Ekosystem och nätverk Integrerat med Gener och Molecular Assemblies (http://enigma.lbl.gov), en vetenskaplig Fokusområde Program vid Lawrence Berkeley National Laboratory, stöddes av Office of Science, kontor för bio-och Environmental Research, av US Department of Energy enligt kontrakt nr DE-AC02-05CH11231.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HisTrapFF column (Ni-Sepharose column) GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA 17-5255-01
Akta explorer (FPLC instrument) GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA
HiPrep 26/10 Desalting column GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA 17-5087-01
Qiaquick Gel extraction kit Qiagen Inc, Valencia, CA, USA 28704
Biotin-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies N/A
6% polyacrylamide-0.5x TBE precast mini DNA retardation gel Life Technologies, Grand Island, NY, USA EC63652BOX Alternately, you can pour your own gel.
Nylon membrane EMD Millipore, Billerica, MA, USA INYC00010
Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell Biorad, Hercules, CA, USA 170-3940
Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm Biorad, Hercules, CA, USA 170-3967
UV crosslinker Model XL-1000 Fisher Scientific 11-992-89
Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce) Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA 89880
Ni-NTA agarose resin Qiagen Inc, Valencia, CA, USA 30210
GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10x amplification master mix, WGA polymerase) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA WGA2-50RXN
Nanodrop ND-1000 Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA For quantitation of DNA
Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX Quanta biosciences 95055-500 Any Sybr Green PCR mix may be used
PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR Axygen
Name Company Catalog Number Comments
96-well clear low profile PCR microplate Life Technologies, Grand Island, NY, USA PCR-96-LP-AB-C
Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system Life Technologies, Grand Island, NY, USA 4376600 Any real time PCR system may be used
Qiaquick PCR purification kit Qiagen Inc, Valencia, CA, USA 28104 Any PCR clean up kit may be used
Cy3/Cy5-labeled nonamers Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA N46-0001, N46-0002
Klenow polymerase 50,000 U/ml, 3'-5' exo- New England Biolabs, Ipswich, MA M0212M
Hybridization system Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used.
Custom printed microarrays and mixers Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A
Hybridization kit (2x Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo) Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A
Wash buffer kit (10x Wash buffer I, II, III, 1 M DTT) Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A
GenePix 4200A microarray scanner Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA This model has been replaced by superior ones
GenePix Pro microarray software Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA
Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
  2. Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).
  3. Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo. Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).
  4. McCleary, W. R., Stock, J. B. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).
  5. Novichkov, P. S., et al. RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics. Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).
  6. Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes. Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).
  7. Rajeev, L., et al. Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium. Genome Biol. 12, 99 (2011).
  8. Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).
  9. Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts. J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).
  10. Bourret, R. B. Receiver domain structure and function in response regulator proteins. Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).
  11. Gao, R., Stock, A. M. Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity. Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).
  12. Hung, D. C., et al. Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation. J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).
  13. Ladds, J. C., et al. The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).
  14. Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).
  15. Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity. Genome Res. 15, 421-427 (2005).
  16. Gossett, A. J., Lieb, J. D. DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity. CSH Protoc. 2008, (2008).
  17. Mascher, T., et al. The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis. J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).
  20. Ho, J. W., et al. ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis. BMC Genomics. 12, 134 (2011).
  21. Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection. Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).

Tags

Genetics DNA-affinitetsrenat-chip svarsregulator transkriptionsfaktor-bindningsstället två-komponentsystem signaltransduktion, Laktat utnyttjande regulator chip-chip
DNA-affinitetsrenade Chip (DAP-chip) metod för att bestämma genen mål för bakteriell Två komponent regelsystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajeev, L., Luning, E. G.,… More

Rajeev, L., Luning, E. G., Mukhopadhyay, A. DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems. J. Vis. Exp. (89), e51715, doi:10.3791/51715 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter