Summary
מערך CGH לצורך זיהוי של גרסאות עותק מספר הגנומי החליף ניתוח קריוטיפ התאגדו-G. מאמר זה מתאר את הטכנולוגיה והיישום שלה במעבדת שירות לאבחון.
Introduction
זה כבר ידוע במשך שנים רבות כי מחיקות או עותקים נוספים של מגזרי כרומוזומליות לגרום לנכות אינטלקטואלית, dysmorphism ומומי congentical, ובמקרים מסוימים לגרום לתסמונות גנטיות 1. עם זאת, הטכנולוגיה זמינה רק עד אמצע שנתי ה -2000 לגילוי הגנום של שינויים אלה יכול הייתה G-התאגדה ניתוח כרומוזום, שבו יש רזולוציה של כ 5-10Mb, בהתאם לאזור והטבע של חוסר האיזון, ושלא לזהות כרומוזומים לא נורמלים שבו חומר הוחלף באזור מכרומוזום שונה עם אותו דפוס פסים. טכניקות ציטוגנטית נלוות כגון הקרינה הכלאה באתר והגברת בדיקה קשירה ספציפית זמנית היו זמינות לחקירה של לוקוסים ספציפיים, במקרים של חוסר איזון syndromic הספציפי חשוד, אבל זה לא היה עד כניסתה של הכלאה גנומית השוואתית מערך (מערך CGH) לs אבחון הקלינית שגרתיתervice 2-5 שגילוי הגנום של עותק מספר הגרסאות (CNVs) התאפשר ברזולוציה גדלה מאוד (בדרך כלל סביב 120kb). עבודת שירות קלינית לצד מחקרים הראה כי CNVs לאזורים מסוימים נפוצים באוכלוסייה הרגילה 6-7, תוך CNVs האחר, בלתי ניתן לגילוי בעבר, המשויכים neurodisabilities כגון אוטיזם ואפילפסיה 8-11.
הפרוטוקול המתואר במאמר זה משמש במעבדה לאבחון הקלינית שירות הבריאות הלאומי בבריטניה (NHS); אנו משתמשים באסטרטגיות רומן הכלאה, בדיקות אצווה ורובוטיקה למזער את העלות בשירות במימון מדינה זו.
לפני הפרוטוקול המפורט להלן, DNA באיכות גבוהה צריך להיות מופק מהחומר המוצא המתאים, בדרך כלל הדם, תאים בתרבית או דגימות רקמה. Spectrophotometry ניתן להשתמש כדי למדוד ריכוז (צריך להיות> 50 ng / ul) ולבדוק 260: 280 יחסים ספיגה (צריך bדואר 1.8-2.0). ג'ל אלקטרופורזה יכולה לשמש כדי לבדוק שה- DNA הוא של משקל מולקולרי גבוה בלי השפלה משמעותית.
פרוטוקול זה מיועד למעבדות תפוקה גבוהות יותר, כי הם תיוג 96 דגימות לטווח באמצעות רובוטיקה טיפול הנוזלית אוטומטית. עם זאת, זה עשוי להיות מותאם למעבדות תפוקה נמוכות יותר ללא אוטומציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תגובת 1. תוויות
- לפני השימוש dUTPs, מראש aliquot cyanine 3 ו -5 שכותרתו, נוקלאוטידים ללא תווית ופריימרים אקראיים בריכוזים מומלץ יצרן ל96-גם צלחות וחנות ב -20 מעלות מוכנות לשימוש. למטרות פרוטוקול זה, aliquot 10.5 μl של dUTP שהכותרת המתאימה ו10.5 μl נוקלאוטידים ללא תווית ופריימרים אקראיים היטב כל אחד.
- להפשיר את הצלחת מוכנה לשימוש 96-היטב של נוקלאוטידים ופריימרים על 4 מעלות צלזיוס למשך כ 1 שעה, מוגן מפני אור.
- ברגע שהפשיר, לאזן צלחת זה ב RT לפחות 30 דקות, מוגנות מפני אור.
- לאזן דגימות DNA ב 60 ° C לפחות 15 דקות.
- באמצעות רובוט טיפול נוזלי, לוותר nuclease ללא מים היטב בכל צלחת 96-היטב.
הערה: נפח מים יהיה תלוי בריכוז של כל דגימת DNA קלט וצריך להיות מספיק כדי לגרום לריכוז סופי של 50 ng / ul. - באמצעות האן נוזלירובוט dling, פיפטה 1 מיקרוגרם של ה- DNA לתוך באר של צלחת 96-היטב (ראה 1.5) כדי להביא את הנפח הכולל עד 20 μl.
הערה: כמויות קטנות יותר של ה- DNA ניתן להשתמש למרות שהאיכות וכתוצאה מכך הנתונים עלולה לסכן (לדגימות יקרות, ניתן להשתמש בם כמויות DNA הקלט עד 400 ng). - באמצעות רובוט נוזל טיפול, להעביר 20 μl של נוקלאוטידים ופריימרים equilibrated לבאר כל הצלחת של DNA המדולל.
- חותם את צלחת 96-היטב עם כובעי רצועה (חותם חזק הוא קריטי).
- לפגל DNA ב -99 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות במכונה PCR עם מכסה מחומם ולאחר מכן הצמדתי מגניב על קרח למשך 5 דקות כדי פריימרים לחשל.
- באמצעות רובוט טיפול נוזלי, להוסיף 10 μl של אנזים פולימראז Klenow Exo DNA לכל DNAs ותמהיל פיפטה ביסודיות.
הערה: הנפח הכולל צריך להיות 50 μl. - חותם את צלחת 96-היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
הערה: דגירה קצרה של 4 שעות היא מספיק עם זאת O / N בcubation יכול להיות נוח יותר. - באמצעות רובוט טיפול נוזלי, להוסיף 5 μl של חיץ להפסיק את כל טוב.
הערה: סיכום של חומרים כימיים המשמשים לתגובת התיוג מוצג בטבלה 1.
2. ההסרה של נוקלאוטידים מאוגדים
- הסר נוקלאוטידים מאוגדים באמצעות עמודות ספין סיליקה-קרום מבוסס ורובוט עיבוד עמודת ספין ייעודי (עמודות הספין גם עשויות להיות מעובד באופן ידני). בצע את הוראות היצרן.
- העבר את התוכן של כל אחד גם לצינור 2 מיליליטר; מראש תווית אלה עם תעודת זהות ושל.
הערה: ניתן לבצע צעד זה באופן ידני או רצוי באמצעות רובוט טיפול נוזלי. - אם אתם משתמשים ברובוט עיבוד עמודת ספין, לאחר מכן לטעון את הרובוט עם 2 מיליליטר צינורות, עמודי ספין טיהור DNA ומאגרים כרוכים בכך.
- הוסף 250 μl מלח גבוה, חיץ (PB חיץ) מחייב DNA לתגובת התיוג כדי לאגד את ה- DNA שכותרתו לסיליקהקרום.
- להסיר זיהומים על ידי שטיפת הקרום פעמיים עם 500 חיץ לשטוף μl (חיץ PE).
- הוסף 15 חיץ elution מלח μl נמוך (חיץ EB) הקרום לשחזר את ה- DNA המטוהר, שכותרתו בהיקף של 12 ~ μl.
- העבר את התוכן של כל אחד גם לצינור 2 מיליליטר; מראש תווית אלה עם תעודת זהות ושל.
3. מערבבים את זוגות היב
- מערבבים את הזוגות המתאימים של cyanine 3 ו- DNA 5 שכותרתו, DNA COT-1, תערובת חסימה סיפק יצרן ומאגר הכלאה-סיפק יצרן באמצעות רובוט טיפול נוזלי.
הערה: זוגות היב אלה יכולים להיות דוגמא והתייחסות, או מדגם vs מדגם אם CNVs המשותף הוא לא בעיה (לדוגמא, אנו לשייך באופן שגרתי דגימות פנוטיפ-תואם, כגון חולה dysplasia כליות לעומת מטופל craniosynostosis, כפי שהם מאוד לא סביר לביצוע CNV המשמעותי קליני זהה). אם אתם משתמשים ב- DNA התייחסות, אספקת DNA מסחרית מומלצת, ואת זה צריך להיות מעובד לצד המדגם.- באמצעות ro טיפול נוזליבוט, תוספת 1 COT DNA (3333 ng / μl), חסימת תערובת ומאגר הכלאה היטב בכל צלחת 96-היטב, כך שכל גם מכיל COT-1 DNA 1.1 μl, תערובת חסימת 4.95 μl ו24.75 שסופק על-יצרן מאגר הכלאה μl.
- להוסיף 9.35 μl של DNA cyanine המתאים 3 שכותרתו היטב כל אחד. טרום רטוב כל קצה כדי לשפר את דיוק pipetting.
- להוסיף 9.35 μl של DNA cyanine המתאים 5 שכותרתו היטב כל אחד. טרום רטוב כל קצה כדי לשפר את דיוק pipetting.
- חותם את צלחת 96-היטב ומערבולת דקות 1. ספין צלחת 96-היטב כדי לאסוף תוכן בחלק התחתון של כל טוב.
4. הכלאה
- מחממים תנור הכלאה ל65oC וprewarm שקופיות גיבוי אחד ותא הכלאה אחת עבור כל שקופית מערך.
- לפגל DNA שכותרתו בדגירת הכלאה מראש לפני שהחלת על המערכים. לבצע הכלאה בתנור מסתובב למשך 24 שעות.
- דגירה את הצלחת 96-גם על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן לעזוב ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות.
- עובד על פלטפורמה מחוממת על 42 מעלות צלזיוס, לטעון כל שקופית גיבוי לתא הכלאה לפני השימוש. ודא שהחלק השקוף של שקופית האטם מיושר עם החלק 'חלונות' של תא ההכלאה.
- Pipet 42 μl של תמהיל ההכלאה שהוכן קודם לכן (ראה סעיף 3) על העמדה המתאימה במערך גיבוי שקופיות. טרום רטוב כל קצה כדי לשפר את דיוק pipetting. Pipet לאט על המרכז של כל עמדה, כדי לוודא שהנוזל לא נוגע בגבול טבעת גומי.
- ברגע שכל העמדות בשקופית הגיבוי מלאות, להוריד בזהירות את שקף המערך עליו ולהרכיב את תא ההכלאה. ודא שהצד של המערך עם כתיבה על זה עומד בפני שקופיות הגיבוי. הקפד להדק את בורג תא הכלאה מלאה.
- בדוק את תא ההכלאה התאסף. ENsure שאין דליפה של תערובת הכלאה מחוץ לגבולות טבעת הגומי וכל בועת אוויר היא ~ 4 מ"מ הגובה, כאשר תא ההכלאה הוא נח על הקצה שלה בצורה אנכית. סובב את תא ההכלאה ולבדוק שאין בועות אוויר שתקועים בעמדה ולא זז. אם יש בכל אלה, נותנים החדר ברז חד על הספסל. בדוק שכל בועות האוויר נעו.
- הנח את תא ההכלאה לתנור מסתובב על 65 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ודא הרוטור התנור הוא מאוזן; להשתמש תאים ריקים אחרים במידת צורך.
5. כביסה וסריקת שקופיות
- לשטוף מערכים להסיר DNA שכותרתו עודף ולאחר מכן לסרוק למדוד הקרינה של כל בדיקה.
- קח תאי הכלאה מתוך תנור ולפרק. שקופיות המערך ואטם תהיה תקועות יחד; לצלול אלה בחיץ לשטוף 1 ולהשתמש זוג המלקחיים פלסטיק, קצוות שטוחים לחטט אותם בנפרד.
- Discard שקופית האטם ובמקום להחליק לתוך המערך מתלה שקוע במאגר 1.
- לשטוף את שקופית המערך ב~ 700 מיליליטר של חיץ לשטוף טרי 1 למשך 5 דקות, תוך בחישה נמרצת (להשתמש פשפשים ובוחש מגנטי).
- העבר את שקופית המערך לחיץ לשטוף ~ 700 מיליליטר 2 ולשטוף עבור 90 שניות, תוך בחישה נמרצת. רם בעדינות את שקופיות מערך מלשטוף חיץ 2, הם צריכים לצאת יבשים.
- טען את שקופית המערך להחזיק שקופיות של הסורק, משתמש במגן שקופית. טען את השקופיות לתוך סורק המערך ולסרוק הבאים הוראות יצרן המערך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כל בדיקה על מערך הכלאה היא דמיינה כתערובת של fluorochromes האדום והירוק (ראה איור 1). היחס של אדום לאות ניאון ירוק עבור כל בדיקה הוא לכמת על ידי הסורק והתוכנה נלווית חלקות אלה כיחסי log2 על פי העמדה הגנומי שלהם, ומזהה אזורים נופלים גבולות מוגדרים מראש מחוץ. עקבות מערך וכתוצאה מכך לאפשר פרשנות של אזורים שזוהו כgenomically לא מאוזן. לדוגמא, העקבות מילד עם תסמונת ויליאמס, תסמונת microdeletion חוזרת בתיווכו של חזרות נמוכות עותק באזור הפרוקסימלי של כרומוזום 7, מתוארת באיור 2. חוסר איזון זה זוהה על ידי התוכנה והצביע על ידי קו אדום.
בדיקת יחסי יומן ניאון צריכים אשכול הדוק סביב 0, כפי שמוצגים באיור 2, מה שמעיד על יחס ירוק / אדום של 1: 1 לאזורים נורמלים של הגנום. עקבות מערך מפוזרות עשויות Resul t בייעוד מדויק של אזורים לא נורמלים, או כישלון בזיהוי חוסר איזון הגנומי (ראה איור 3). פיזור כזה עלול להיגרם על ידי מספר הגורמים, כולל איכות DNA העני, או הנוכחות של רמות מוגבהות של אוזון באטמוספרה. ניטור של רמות האוזון מומלץ, ושבו רמות אוזון גבוהות הן בעייתיות, ארונות הדרת אוזון מוקדשים זמינים; שימוש בארונות אלה נובעים בדרך כלל באיכות מערך השתפר במידה ניכרת.
תמונת איור 1. של ההכלאה הבאה מערך. התיבה הלבנה מציגה אזור מוגדל, שבו ניתן דמיינו בדיקות אדומות ובדיקות ירוקות (המצביעים על חוסר איזון לאזורים מיוצגים על ידי בדיקות אלה), על רקע בדיקות צהובות (המצביע על אזורים הגנומי מאוזנים ).
איור עקבות 2. דוגמא () לכרומוזום 7 במדגם עם מחיקת 1.7MB, שמוצג על ידי יחס של -0.8 ממוצע במשך 43 בדיקות ברציפות. האזור שנמחק במקרה זה קשור לתסמונת וויליאמס-Beuren, עולה בקנה אחד עם סימן ההפניה של תכונות dysmorphic, מום בלב ונכות אינטלקטואליות. האזור שנמחק מעל מוצג בדפדפן הגנום USCS (B), המציג את הגנים שבנמחקו אזור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3.דוגמא של עקבות מערך מפוזרות לכרומוזום 7 במדגם עם הכלאה עניה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מֵגִיב | נפח (μl) |
| Primers & מאגר תגובה | 20 |
| DNA (1μg) + מים | 20 |
| פולימראז Klenow exonuclease DNA | 10 |
סיכום 1. טבלה של חומרים כימיים המשמשים לתגובת התיוג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערך CGH לא יזהה שחלופים מאוזנים או הפרעות ploidy כגון triploidy. יתר על כן, חוסר איזון פסיפס רמה נמוכה עשוי שלא להיות מזוהה. עם זאת, יש מערך CGH רזולוציה גבוהה יותר לזיהוי CNV מאשר ניתוח כרומוזום התאגדו-G בו החליף במעבדות ציטוגנטיקה רבות. לכן תקן הזהב הנוכחי לגילוי CNV הגנום. זה יכול להיות מוחלף על ידי טכנולוגיות רצף של הדור הבא בעתיד, אבל כרגע, עלותם והמורכבות הטכנית הקשורות בשימוש קצר קוראים לגילוי CNV אומר שזה עדיין לא בכושר טוב לשימוש קליני.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא בשימוש שיגרתי במעבדה השירות הקלינית שלנו. שתי ריצות של 96 דגימות כל מעובדות בכל שבוע באמצעות רובוט טיפול נוזלי ורובוט עיבוד עמודת ספין קרום סיליקה ייעודי. אוטומציה מומלצת מאוד כדי לשפר את העקביות ולשמור על איכות. DNA שחולץ מן הדם, רוק, דגימות טרום לידתי (למשל, chorionic villi או מי שפיר) או דגימות רקמה יכול להיות, ובאופן שגרתי כלומר, בשימוש עם פרוטוקול זה.
אוזון ידוע לבזות צבעי cyanine ולכן ניטור אוזון והגנה מומלץ. וריאציה עונתית ברמות אוזון היא גם נפוצה. המסכים שלנו במעבדה ורמות אוזון רשומות ברציפות. יחידת הסרת אוזון מורכב על קיר משמשת כדי להפחית את רמות האוזון וחלקים רגישים במיוחד של הפרוטוקול (כלומר, מערכי כביסה וסריקה) מבוצעים בברדסים ללא אוזון. במידת האפשר, רמות האוזון נשמרות מתחת ל -5 ppb.
רוב המגיבים הם קנו ערכות של יצרנים למיקור חוץ בקרת איכות ביעילות; זה הוכיח את עצמו אסטרטגיה יעילה. עם זאת, זה לא אומר שבקרת איכות אינה נדרשה. ואכן, מדדי איכותם במעקב צמודים לכל חריגות: סטיית תקן נגזרת של יחסי log2 (DLRS) יש below 0.2, עוצמות cyanine 3 ו -5-אות צריכה להיות גדול מ -500 וcyanine 3 ו -5-אות לרעש יחס צריך להיות> 30. מדדים אלה נוצרים כחלק מפרוטוקול הסריקה על ידי תוכנת הסריקה ונרשמים לניטור ארוך טווח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients. Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).
- Ahn, J. W., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).
- Beaudet, A. L. The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics. Child Dev. 84, 121-132 (2013).
- Park, S. J., et al. Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases. Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).
- Iafrate, A. J., et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).
- Redon, R., et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 444, 444-454 (2006).
- Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome. Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).
- Molin, A. M., et al. A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features. J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).
- Tropeano, M., et al. Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders. PLoS One. 8, e61365 (2013).
- Bon, B. W., et al. Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome. J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).
