Summary
Array CGH per la rilevazione di varianti del numero di copie genomiche ha sostituito l'analisi del cariotipo G-fasciato. Questo articolo descrive la tecnologia e la sua applicazione in un laboratorio di servizio diagnostico.
Introduction
E 'noto da molti anni che delezioni o copie extra di segmenti cromosomici causano ritardo mentale, dismorfismi e malformazioni congentical, e in alcuni casi causare sindromi genetiche 1. Tuttavia, l'unica tecnologia disponibile fino alla metà degli anni 2000 per la rilevazione genoma a livello di questi cambiamenti era G fasciato analisi cromosomica, che ha una risoluzione di circa 5-10 MB, a seconda della regione e la natura dello squilibrio, e che non può rilevare cromosomi anormali in cui il materiale è stato sostituito da una regione di un cromosoma differente con lo stesso pattern di bande. Ausiliari tecniche di citogenetica, come ibridazione fluorescente in situ e multiplex specifici legatura probe amplificazione sono stati disponibili per l'interrogatorio di loci specifico, in caso di sospetto di squilibrio sindromico specifico, ma non è stato fino all'introduzione della matrice ibridazione genomica comparativa (CGH array) nella routine clinica s diagnosticoervice 2-5 che il rilevamento a livello di genoma di numero di copie varianti (CNV) è diventato disponibile in forte aumento la risoluzione (in genere circa 120 KB). Lavori di manutenzione clinica accanto studi di ricerca hanno dimostrato che CNVs per alcune regioni sono molto diffuse nella popolazione normale 6-7, mentre altri CNVs, precedentemente non rilevabili, sono associati con neurodisabilities come l'autismo e l'epilessia 8-11.
Il protocollo descritto in questo documento viene utilizzato nel nostro UK National Health Service (NHS) laboratorio di diagnosi clinica; usiamo strategie di ibridazione nuove, prove per lotto e robotica per minimizzare i costi di questo servizio finanziati dallo Stato.
Prima il protocollo descritto di seguito, il DNA di alta qualità dovrebbe essere estratto dal materiale di partenza appropriati, comunemente sangue, cellule coltivate o campioni di tessuto. Spettrofotometria può essere utilizzato per misurare la concentrazione (dovrebbe essere> 50 ng / ul) e controllare 260: 280 rapporti di assorbanza (dovrebbe be 1.8-2.0). Elettroforesi gel può essere utilizzato per verificare che il DNA è di alto peso molecolare senza degradazione significativa.
Questo protocollo è stato progettato per i laboratori di throughput più elevate che sono l'etichettatura 96 campioni per analisi utilizzando la robotica automatizzata gestione dei liquidi. Tuttavia, può essere adattato per laboratori di throughput inferiori senza automazione.
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Protocol
1. L'etichettatura di reazione
- Prima dell'uso, dUTPs pre-un'aliquota cianinico 3 e 5-etichettati, nucleotidi senza etichetta e primer casuali alle concentrazioni consigliate dal produttore in lastre e negozio a 96 pozzetti a -20 C pronto per l'uso. Ai fini del presente protocollo, aliquota 10,5 ml di adeguata dUTP etichettato e 10,5 ml nucleotidi senza etichetta e primer casuali in ogni pozzetto.
- Scongelare il piatto pronto all'uso 96 pozzetti di nucleotidi e primer a 4 ° C per circa 1 ora, al riparo dalla luce.
- Una volta scongelato, equilibrare questo piatto a temperatura ambiente per almeno 30 minuti, al riparo dalla luce.
- Equilibrare campioni di DNA a 60 ° C per almeno 15 min.
- Utilizzando un robot liquido movimentazione, erogare acqua priva di nucleasi a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
NOTA: Il volume di acqua dipenderà dalla concentrazione di ciascun campione di DNA input e dovrebbe essere sufficiente a determinare una concentrazione finale di 50 ng / ul. - Utilizzando un han liquidorobot dling, pipetta 1 mg di DNA in un pozzo della piastra a 96 pozzetti (vedi 1.5) per portare il volume totale a 20 l.
NOTA: Piccole quantità di DNA possono essere utilizzati anche se la qualità dei dati risultante può essere compromessa (per i campioni preziosi, le quantità di DNA di ingresso fino a 400 ng possono essere utilizzati). - Utilizzando un robot manipolatore liquida, trasferire 20 ml di nucleotidi equilibrate e primer in ciascun pozzetto della piastra di DNA diluito.
- Sigillare la piastra a 96 pozzetti con tappi striscia (una tenuta stagna è fondamentale).
- Denaturare il DNA a 99 ° C per 10 min in una macchina PCR con un coperchio riscaldato e quindi far scattare raffreddare su ghiaccio per 5 min a primer ricottura.
- Utilizzando una gestione robot liquido, aggiungere 10 ml di Klenow DNA polimerasi Exo enzima per ogni DNA e mix pipetta accuratamente.
NOTA: Il volume totale dovrebbe essere di 50 ml. - Sigillare la piastra a 96 pozzetti e incubare a 37 ° C per 16 ore.
NOTA: A incubazione più breve di 4 ore è sufficiente tuttavia un O / N incubation può essere più conveniente. - Utilizzando un robot liquido movimentazione, aggiungere 5 ml di tampone di arresto a ciascun pozzetto.
NOTA: Una sintesi dei reagenti utilizzati per la reazione di marcatura è mostrato in Tabella 1.
2. Rimozione di Unincorporated nucleotidi
- Rimuovere nucleotidi non incorporati utilizzando silice membrana a base colonne di spin e un robot di spin elaborazione colonna dedicato (le colonne di rotazione possono essere trattati manualmente). Seguire le istruzioni del produttore.
- Trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in una provetta 2 ml; pre-label questi con ID e di.
NOTA: Questa fase può essere eseguita manualmente o, preferibilmente usando un robot di manipolazione di liquido. - Se si utilizza un trattamento robot Spin Column, quindi caricare il robot con 2 ml tubi, colonne di rotazione di purificazione del DNA e buffer associati.
- Aggiungere 250 microlitri di sale, di legame al DNA tampone (buffer PB) per la reazione di marcatura di legare il DNA marcato per la silicemembrana.
- Rimuovere le impurità lavando membrana due volte con 500 microlitri tampone di lavaggio (tampone PE).
- Aggiungere 15 microlitri tampone di eluizione basso sale (tampone EB) alla membrana per recuperare il purificato, DNA marcato in un volume di ~ 12 microlitri.
- Trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in una provetta 2 ml; pre-label questi con ID e di.
3. Unire Hyb Pairs
- Unire le coppie appropriate di cianinico 3 e 5 DNA marcato, COT-1 DNA, un mix di blocco fornito dal produttore e un buffer di ibridazione fornito dal produttore con un robot di liquido di movimentazione.
NOTA: Queste coppie Hyb possono essere un campione e un riferimento, o un campione vs campione se CNVs condivisa non sono un problema (ad esempio, abbiamo regolarmente pair campioni fenotipo-non corrispondenti, come ad esempio una displasia paziente renale vs un paziente craniosinostosi, in quanto sono molto improbabile portare la stessa clinicamente significativa CNV). Se si utilizza un DNA di riferimento, si raccomanda una fornitura DNA commerciale, e dovrebbe essere elaborato fianco campione.- Usando un trattamento liquido robot, aggiungere COT-1 DNA (3333 ng / ml), il fornito dal produttore di bloccaggio mix e tampone di ibridizzazione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in modo che ogni pozzetto contiene 1,1 microlitri COT-1 DNA, 4,95 ml mix di blocco e 24.75 tampone di ibridazione microlitri.
- Aggiungere 9.35 ml di DNA adeguato Cyanine 3-marcato in ciascun pozzetto. Pre-bagnato ogni suggerimento per migliorare accuratezza della dispensazione.
- Aggiungere 9.35 ml di DNA Cyanine appropriata 5 marcato a ciascun bene. Pre-bagnato ogni suggerimento per migliorare accuratezza della dispensazione.
- Sigillare la piastra a 96 pozzetti e vortex per 1 min. Spin la piastra a 96 pozzetti per raccogliere contenuti sul fondo di ciascun pozzetto.
4. Ibridazione
- Preriscaldare il forno a 65 ° C e ibridazione preriscaldare una diapositiva di supporto e una camera di ibridazione per ogni diapositiva array.
- Denaturare il DNA marcato in incubazione pre-ibridazione prima di applicare agli array. Eseguire ibridazione in un forno rotante per 24 h.
- Incubare la piastra a 96 pozzetti a 70 ° C per 30 min e poi lasciato a 37 ° C per almeno 5 minuti.
- Lavorando ad una piattaforma riscaldata a 42 ° C, caricare ogni vetrino backup in una camera di ibridazione prima dell'uso. Assicurarsi che la parte trasparente della slitta guarnizioni allinea con la parte 'finestrato' della camera di ibridazione.
- Dispensare 42 ml di mix ibridazione preparato in precedenza (vedi punto 3) sulla posizione appropriata sulla matrice sostegno diapositiva. Pre-bagnato ogni suggerimento per migliorare accuratezza della dispensazione. Pipettare lentamente sul centro di ciascuna posizione, assicurandosi che il liquido non tocchi il confine anello di gomma.
- Una volta che tutte le posizioni sul vetrino supporto sono pieni, attenzione abbassare la diapositiva matrice su di esso e assemblare la camera di ibridazione. Assicurarsi che il lato della matrice con la scrittura su di esso si trova ad affrontare la diapositiva supporto. Assicurarsi di serrare la vite camera di ibridazione.
- Ispezionare la camera di ibridazione assemblato. ENsure che non vi siano perdite di miscela di ibridazione fuori dei confini anello in gomma e ogni bolla d'aria è ~ 4 mm quando la camera di ibridazione viene appoggiata sulla sua estremità verticalmente. Ruotare la camera di ibridazione e controllare che non vi siano bolle d'aria che sono bloccati in posizione e non si muove. Se ci sono uno di questi, dare la camera di un forte tap in panchina. Verificare che tutte le bolle d'aria si muovono.
- Posizionare la camera di ibridazione in forno rotante a 65 ° C per 24 ore. Assicurarsi che il rotore del forno è equilibrato; utilizzare altre camere vuote se necessario.
5. Lavaggio e la scansione di diapositive
- Lavare gli array per rimuovere l'eccesso di DNA marcato e quindi eseguire la scansione per misurare la fluorescenza di ogni sonda.
- Prendere camere ibridazione di forno e smontare. Le diapositive di matrice e guarnizioni saranno incollati; immergere questi in tampone di lavaggio 1 e utilizzare un paio di plastica, pinze piatto da taglio per fare leva loro a parte.
- Discard la diapositiva guarnizione e posizionare il vetrino array in un rack sommersa in tampone 1.
- Lavare il vetrino array in ~ 700 ml di tampone di lavaggio fresco 1 per 5 min, agitando vigorosamente (utilizzare una pulce e un agitatore magnetico).
- Trasferire il vetrino array per ~ 700 ml tampone di lavaggio 2 e lavare per 90 secondi, mescolando energicamente. Sollevare delicatamente le diapositive matrice su tampone di lavaggio 2, dovrebbero emergere a secco.
- Caricare il vetrino array in un portavetrini dello scanner, utilizzando un protettore diapositiva. Caricare la diapositiva nello scanner matrice e la scansione seguendo le istruzioni del produttore della matrice.
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Representative Results
Ogni sonda su una matrice ibrida è visualizzato come una miscela di fluorocromi rosso e verde (vedi Figura 1). Il rapporto di rosso al segnale verde fluorescente per ciascuna sonda viene quantificato dallo scanner e il relativo software traccia questi come rapporti log2 base alla loro posizione genomica, e identifica le regioni di confine preimpostati fuori. L'array tracce risultanti permettono l'interpretazione delle regioni identificate come genomicamente sbilanciato. Per esempio, la traccia di un bambino con sindrome di Williams, una sindrome microdeletion ricorrente mediata da ripetizioni copia bassi nella regione prossimale del cromosoma 7, è illustrato nella figura 2. Tale squilibrio è stato identificato dal software ed indicato da una linea rossa.
Sonda rapporti log fluorescenti dovrebbero raggrupparsi strettamente circa 0, come illustrato in figura 2, che indica un verde / rosso rapporto di 1: 1 per normali regioni del genoma. Tracce di array sparsi possono Resul t in chiamata imprecisa delle regioni anomale, o mancata identificazione squilibrio genomica (vedi figura 3). Tale dispersione può essere causato da una serie di fattori, tra cui la qualità scadente DNA, o la presenza di livelli elevati di ozono nell'atmosfera. Si raccomanda il monitoraggio dei livelli di ozono, e dove i livelli di ozono elevati sono problematici, armadi esclusione ozono dedicati sono disponibili; uso di questi armadi genere provoca notevolmente migliorata qualità array.
Figura 1. Immagine di un seguito ibridazione array. La scatola bianca presenta un'area ingrandita, in cui le sonde rosse e verdi sonde possono essere visualizzati (indicando squilibrio per le regioni rappresentate da queste sonde), in un contesto di sonde giallo (che indica le regioni genomiche bilanciati ).
Figura 2. (A) Esempio di traccia per cromosoma 7 in un campione con una delezione 1.7Mb, dimostrato da un rapporto medio -0.8 per 43 sonde consecutivi. La regione eliminata in questo caso è associata con la sindrome di Williams-Beuren, in linea con l'indicazione rinvio di dismorfismi, un difetto cardiaco e ritardo mentale. (B) La regione cancellata sopra visualizzato nel browser USCS genoma, mostrando i geni all'interno della cancellata regione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3.Esempio di una traccia matrice sparsi per cromosoma 7 in un campione con scarsa ibridazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Reagente | Volume (ml) |
| Primer e tampone di reazione | 20 |
| DNA (1 ug) + acqua | 20 |
| Polimerasi Klenow Exonuclease DNA | 10 |
Tabella 1. Sintesi dei reagenti utilizzati per la reazione di marcatura.
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Discussion
Array CGH non rileverà riarrangiamenti bilanciati o anomalie ploidia quali triploidia. Inoltre, basso livello squilibri mosaico non possono essere rilevati. Tuttavia, CGH array ha una risoluzione più alta per il rilevamento CNV di analisi cromosomica G-banded quale essa ha sostituito in molti laboratori di citogenetica. E 'quindi il gold standard attuale per tutto il genoma di rilevamento CNV. Essa può essere sostituito da tecnologie di sequenziamento di prossima generazione per il futuro, ma attualmente, il loro costo e la complessità tecnica associata con l'utilizzo di breve legge per il rilevamento CNV significa che questa non è ancora una buona misura per uso clinico.
Il protocollo qui descritto è in uso di routine nel nostro laboratorio servizio clinico. Due percorsi di 96 campioni ciascuna sono trattati ogni settimana con un robot di gestione dei liquidi e una membrana di silice elaborazione Spin Column robot dedicato. Automation è altamente raccomandato per migliorare la coerenza e mantenere la qualità. DNA estratto da sangue, Saliva, campioni prenatali (ad esempio, villi coriali o liquido amniotico) o campioni di tessuto possono essere, e di routine è, usato con questo protocollo.
L'ozono è noto a degradare cianine e quindi si raccomanda un monitoraggio dell'ozono e protezione. Variazione stagionale dei livelli di ozono è anche comune. I nostri monitor di laboratorio e di aggiudicazione di ozono continuamente. Un'unità rimozione di ozono a parete viene utilizzato per ridurre i livelli di ozono e zone particolarmente sensibili del protocollo (ossia, il lavaggio e la scansione array) vengono eseguite in cappe senza ozono. Se possibile, i livelli di ozono sono mantenuti al di sotto di 5 ppb.
La maggior parte dei reagenti vengono acquistati come kit da produttori di esternalizzare efficacemente il controllo della qualità; questo ha dimostrato di essere una strategia efficace. Tuttavia, questo non significa che non è richiesto il controllo di qualità. In effetti, le metriche di qualità sono attentamente monitorati per eventuali anomalie: derivata deviazione standard dei rapporti log2 (DLRS) dovrebbe essere Below 0.2, cianinici 3 e 5-segnale intensità dovrebbe essere maggiore di 500 e cianinico 3 e 5-rapporto segnale rumore dovrebbe essere> 30. Questi parametri vengono generati come parte del protocollo di scansione dal software di scansione e vengono registrati per il monitoraggio a lungo termine.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
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