Summary
유전자 복제 수 변이의 검출을위한 어레이 CGH는 G-밴드 핵형 분석을 대체하고있다. 이 문서는 기술 및 진단 서비스 실험실에서의 응용 프로그램을 설명합니다.
Introduction
이것은 염색체 결실 또는 세그먼트들의 추가 복사본들이 지적 장애, 및 dysmorphism congentical 기형을 일으킬 그 수년 동안 알려져 있고, 어떤 경우에는 하나의 유전 적 증후군을 야기하고있다. 그러나 이러한 변화의 게놈 전체의 검출을위한 2000 년대 중반까지 사용할 수있는 유일한 기술은 할 수없는 불균형의 지역 및 특성에 따라 5-10Mb 주위의 해상도를 가지고 염색체 분석을, 줄무늬 G, 그리고 어떤 재료가 동일한 밴딩 패턴 다른 염색체 영역에 의해 대체 된 염색체 이상을 검출한다. 이러한 현장 하이브리드 멀티 플렉스 결찰 특정 프로브 증폭 형광 등의 보조 세포 유전 학적 기술이 의심되는 특정 syndromic 불균형의 경우, 특정 유전자좌의 심문에 사용할 수 있었지만,이 배열 비교 게놈 교잡의 도입까지이지 않았다 (배열 CGH) 일상적인 임상 진단의에카피 수의 게놈 넓은 감지 (CNVs) 변종 서 비 스 2-5 (일반적으로 1백20킬로바이트 정도) 크게 증가 해상도로 가능하게되었다. 일부 지역은 일반 인구의 6-7에 널리 퍼져에 대한 조사 연구와 함께 임상 서비스 작업은 다른 CNVs 반면, 이전에 발견 할 수없는, 자폐증과 간질 8-11로 neurodisabilities과 관련된, CNVs 것으로 나타났습니다.
이 문서에 설명 된 프로토콜은 우리의 영국 국민 건강 서비스 (NHS) 임상 진단 실험실에서 사용된다 우리는이 국가 재정 지원 서비스 비용을 최소화하기 위해 새로운 하이브리드 전략, 배치 테스트 및 로봇을 사용합니다.
아래 설명 프로토콜 이전에, 고품질의 DNA가 적절한 출발 물질, 일반적으로 혈액, 세포 배양 또는 조직 샘플로부터 추출한다. 280 흡광도 비 (B한다 :이 측정법 농도를 측정하는데 사용될 수 있고 (260)을 확인 (> 50 NG / UL이 있어야한다)전자 1.8 ~ 2.0). 젤 전기 영동은 DNA가 크게 저하없이 높은 분자량 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 자동화 된 액체 처리 로봇을 사용하여 런타임 당 96 샘플에 레이블 높은 처리량 실험실을 위해 설계되었습니다. 그러나, 낮은 처리량없이 자동화 실험실 위해 적응 될 수있다.
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Protocol
1. 라벨 반응
- 사용할 준비가 -20 C에서 접시와 상점 96 웰으로 제조업체가 권장하는 농도에서, 미리 나누어지는 메틴 3, 5 표지 dUTPs, 레이블이없는 뉴클레오티드 랜덤 프라이머를 사용하기 전에. 이 프로토콜, 분취 적절한 표지 된 dUTP의 10.5 μL 10.5 μL 뉴클레오티드와 표지되지 않은 각 웰 랜덤 프라이머의 목적.
- 빛으로부터 보호는 약 1 시간 동안 12 ° C에서 뉴클레오티드 프라이머가 즉시 사용 96 웰 플레이트를 해동.
- 해동 후, 빛으로부터 보호 적어도 30 분 동안 실온에서 평형이 플레이트.
- 적어도 15 분 동안 60 ° C에서 DNA 샘플을 평형.
- 액체 핸들링 로봇을 이용하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 클레아없는 물을 분배.
주 : 물의 부피는 각각의 입력 샘플 DNA의 농도에 의존 할 것이다 NG 50 / UL의 최종 농도 야기하기에 충분해야한다. - 액체 한 사용dling 로봇, 96- 웰 플레이트의 웰에 피펫 1 μg의 DNA가 (1.5 참조) 20 μL에 전량을 가지고.
주 : 결과 데이터의 품질이 저하 될 수 있지만, DNA의 소량이 사용될 수있다 (귀중한 샘플 400 NG 아래로 입력 DNA 량을 사용할 수있다). - 액체 핸들링 로봇을 이용하여 DNA의 희석 플레이트의 각 웰에 평형화 뉴클레오티드 프라이머의 20 μl를 옮긴다.
- 스트립 캡 (단단히 밀착이 중요하다)와 함께 96 웰 플레이트를 밀봉합니다.
- 가열 뚜껑 PCR 기계에서 10 분 동안 99 ° C에서 DNA를 변성하고 어닐링 프라이머 5 분 동안 얼음 냉각 스냅.
- 액체 핸들링 로봇을 이용하여 각 DNA를 철저히 혼합하고 피펫으로 엑소 클레 나우 DNA 폴리머 라제 효소의 10 μL를 추가한다.
참고 : 전체 볼륨이 50 μl를해야한다. - 96 웰 플레이트를 밀봉하고 16 시간 동안 37 ° C에서 품어.
참고 : 4 시간의 짧은 배양 그러나의 O / N 충분하다cubation 더 편리 할 수 있습니다. - 액체 처리 로봇을 사용하여, 각 웰에 정지 버퍼의 5 μl를 추가합니다.
주 : 라벨에 사용되는 반응 시약의 개요를 표 1에 나타낸다.
비법 인 뉴클레오티드 2. 제거
- 실리카 막 기반 스핀 열 및 전용 스핀 열 처리 로봇 (스핀 열을 수동으로 처리 될 수있다)를 사용하여 비법 인 뉴클레오티드를 제거합니다. 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 웰 2 ㎖의 튜브에 각각의 내용을 전송; 잘 ID 년대와 사전 라벨이는.
주 :이 단계는 액체 핸들링 로봇을 이용하여 수동으로 또는 바람직하게 수행 될 수있다. - 스핀 컬럼 처리 로봇을 사용하면, 2 ㎖의 튜브, DNA 정제 스핀 컬럼과 연관된 버퍼와로드 로봇.
- 실리카에 표시된 DNA에 결합하는 라벨링 반응 250 ㎕의 높은 소금, DNA 결합 버퍼 (완충 PB)를 추가합니다막.
- 500 μL 세척 버퍼 (PE 버퍼)로 두 번 막을 세척하여 불순물을 제거합니다.
- ~ 12 μL의 부피 정제, 표지 된 DNA를 회수하는 막에 15 μL 저염 용출 완충액 (EB 버퍼)에 추가.
- 웰 2 ㎖의 튜브에 각각의 내용을 전송; 잘 ID 년대와 사전 라벨이는.
3. 그리고, Hyb 쌍을 결합
- 시아닌 3, 5 표지 DNA의 적절한 쌍을 결합, COT-1 DNA, 제조업체에서 제공 차단 믹스와 액체 처리 로봇을 사용하여 제조업체에서 제공 하이브리드 버퍼입니다.
참고 : 공유 CNVs는 문제가되지 않습니다 경우 이러한 HYB 쌍 (예를 들어, 우리가 일상적으로 그들은 매우만큼, 같은 두개골 조기 유합 환자 대 신 이형성증 환자 등의 표현형 - 일치하지 않는 샘플을, 쌍 샘플 대 샘플과 기준, 또는 샘플이 될 수 있습니다 ) 같은 임상 적으로 유의 CNV 운반 가능성. 기준 DNA를 사용하는 경우, 상용 전원 DNA를 권장하고, 시료와 함께 처리되어야한다.- 액체 취급 RO 사용로봇, COT-1 DNA (3333 NG / μL)을 추가 제조업체 제공 각 웰 1.1 μL의 COT-1 DNA, 4.95 ㎕의 블로킹 믹스 24.75 포함되도록 96 웰 플레이트의 각 웰에 혼합하고 혼성화 블로킹 완충액 μL 하이브리드 버퍼입니다.
- 각 웰에 해당 시아닌 3 표지 DNA의 9.35 μl를 추가합니다. 사전 젖은 각각의 팁은 정확성을 피펫 팅 향상.
- 각 웰에 해당 시아닌 5 표지 DNA의 9.35 μl를 추가합니다. 사전 젖은 각각의 팁은 정확성을 피펫 팅 향상.
- 1 분 동안 96 웰 플레이트와 소용돌이 인감. 각 웰의 바닥에 내용을 수집하기 위해 96- 웰 플레이트 스핀.
4. 하이브리드
- 65oC에 하이브리드 오븐을 예열 한 백업 슬라이드 및 각 배열 슬라이드 한 하이브리드 챔버를 prewarm.
- 배열에 적용되기 전에 미리 하이브리드 배양에 표시된 DNA를 변성. 24 시간 동안 회전 오븐에서 하이브리드를 수행합니다.
- 30 분 동안 70 ° C에서 96 웰 플레이트를 인큐베이션 후 적어도 5 분 동안 37 ° C에서 떠난다.
- 42 ° C에서 가열 된 플랫폼에서 작업 사용하기 전에 하이브리드 실에 각각의 백업 슬라이드를로드합니다. 가스켓 슬라이드의 투명한 부분은 하이브리드 챔버의 '윈도 윙'부분과 정렬되었는지 확인합니다.
- 피펫 이전에 제조 된 하이브리드 믹스의 42 μl의 슬라이드를 백업 어레이의 적절한 위치에 (섹션 3 참조). 사전 젖은 각각의 팁은 정확성을 피펫 팅 향상. 피펫 천천히 확인하고 각 위치의 중심에 액상 고무 링 경계를 만지지 않습니다.
- 백업 슬라이드에 모든 위치가 작성되면,주의 깊게에 배열 슬라이드를 낮추고 하이브리드 챔버를 조립한다. 그것을 쓰기로 배열의 측면 등판이 슬라이드를 향하고 있는지 확인하십시오. 완전히 하이브리드 실 나사를 조이십시오.
- 조립 된 하이브리드 챔버를 검사합니다. E이 고무 링 경계 외부 혼성화 믹스의 누설이없고, 혼성화 챔버의 수직 단부에 얹혀 때마다 기포 높이 ~ 4mm로되어 nsure. 하이브리드 챔버를 돌려 위치 및 이동되지 붙어있는 기포가 없는지 확인합니다. 이들 중 하나라도있을 경우, 챔버를 벤치에 예리한 탭을 준다. 모든 기포가 이동하고 있는지 확인하십시오.
- 24 시간 동안 65 ° C에서 회전 오븐에 하이브리드 챔버를 놓습니다. 오븐 로터가 균형을 확인하십시오; 필요한 경우 다른 빈 챔버를 사용합니다.
5. 세탁 스캔 슬라이드
- 초과 표지 DNA를 제거한 다음 각 프로브의 형광을 측정하기 위해 스캔 배열을 씻으십시오.
- 오븐과 분해에서 하이브리드 챔버를 가져 가라. 배열 및 가스켓 슬라이드 붙어됩니다; 세척 버퍼 1이 잠수함과 간격을 캐 내려고 플라스틱, 평면 깨끗 포셉 한 쌍을 사용합니다.
- 디가스켓 슬라이드를 scard 버퍼 1에 잠긴 랙에 배열 슬라이드를 배치합니다.
- 격렬하게 교반, 5 분 동안 신선한 세척 버퍼 1 ~ 700 ml의에 배열 슬라이드를 씻으 (벼룩과 자석 교반기를 사용).
- ~ 700 ml의 세척 버퍼 (2)에 배열 슬라이드를 전송하고 격렬하게 교반, 90 초 동안 세척한다. 부드럽게 세척 버퍼 2 중 배열 슬라이드를 올려, 그들은 건조 등장한다.
- 슬라이드 방지기를 사용하여 스캐너의 슬라이드 홀더에 배열 슬라이드를 넣습니다. 배열 스캐너로 슬라이드를 넣고 배열 제조업체의 지침에 따라 검사합니다.
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Representative Results
혼성화 된 각 프로브 어레이에 적색, 녹색의 형광체의 혼합물로서 가시화된다 (도 1 참조). 각 프로브에 대한 녹색 형광 신호에 빨간색의 비율은 스캐너에 의해 정량화하고 관련 소프트웨어는 자신의 게놈 위치에 따라 LOG2 비율 이러한 플롯, 외부 프리셋 경계 떨어지는 영역을 식별합니다. 결과 배열 트레이스는 genomically 불균형으로 식별 영역의 해석을 할 수 있습니다. 예를 들어, 윌리엄스 증후군, 염색체 7의 인접 지역에서 낮은 복사 반복에 의해 매개 되풀이 microdeletion 증후군을 가진 아이의 추적이 그림 2에 도시되어있다.이 불균형은 소프트웨어에 의해 확인되었다 빨간 선으로 표시.
게놈의 정상 영역에 대한 1 : 1의 녹색 / 적색의 비율을 나타내는,도 2에 도시 된 바와 같이 형광 로그 비율은, 0 주위에 클러스터링한다 밀접 프로브. 흩어져 배열 흔적 resul 수 있습니다 부정확 비정상 영역 호출, 또는 게놈 불균형을 식별 할 때 실패 t (도 3 참조). 이러한 산란은 DNA 불량한 품질, 또는 오존 분위기에서의 상승 수준의 존재를 포함하여 다수의 인자에 의해 야기 될 수있다. 오존 수준의 모니터링을 권장하고, 상승 된 오존 수준에 문제가있는 전용 오존 제외 캐비닛을 사용할 수 있습니다; 이러한 캐비넷의 사용은 일반적으로 현저하게 개선 된 어레이 품질을 초래한다.
배열 다음 하이브리드의 그림 1. 이미지. 흰색 상자 빨간색 프로브 및 녹색 프로브는 노란색 프로브의 배경에 대해, (이 프로브로 표시되는 지역에 대한 불균형을 나타내는) 시각화 할 수있는 확대 된 영역을 보여줍니다 (밸런스 게놈 영역을 나타내는 ).
43 연속 프로브 -0.8의 평균 비율로 나타낸 1.7MB 삭제와 샘플, 염색체 7 그림 2. (A) 예 추적. 이 경우, 삭제 된 영역은 추형 기능, 심장 결함 및 지적 장애의 조회 지시와 일치 윌리엄스 Beuren 증후군과 관련된다. (B) USCS 게놈 브라우저에 표시되는 상기 삭제 된 영역 삭제 내의 유전자를 도시 지역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3.가난한 하이브리드와 샘플에서 염색체 7 흩어져 배열 추적의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 볼륨 (μL) |
| 프라이머 및 반응 버퍼 | (20) |
| DNA (1μg) + 물 | (20) |
| 엑소 뉴 클레 나우 DNA 폴리머 라 | (10) |
표지 반응에 사용되는 시약의 표 1에 요약.
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Discussion
어레이 CGH는 triploidy로 균형 재 배열 또는 배수성 이상을 감지하지 않습니다. 또한, 낮은 수준의 모자이크 불균형을 감지 할 수없는 문제점이있다. 그러나, 배열 CGH는 많은 세포 유전학 실험실에서 대체하고 G 줄무늬 염색체 분석보다 CNV 검출을위한 높은 해상도를 가지고있다. 따라서 게놈 전체의 CNV 감지를위한 황금의 현재 표준입니다. 이것은 향후 차세대 시퀀싱 기술로 대체 될 수 있지만, 현재, 그 비용 및 기술적 인 복잡성이 아직 임상 사용에 적합하지 않은 것으로 의미 CNV 감지 판독 짧은 사용과 관련된.
여기에 설명 된 프로토콜은 임상 서비스 실험실에서 일상적인 사용 중입니다. 96 샘플을 각각 두 실행은 액체 처리 로봇과 전용 실리카 막 스핀 열 처리 로봇을 사용하여 각 주에 처리됩니다. 자동화는 매우 일관성을 개선하고 품질을 유지하는 것이 좋습니다. DNA 혈액에서 추출타액, 산전 샘플 (예, 융모 또는 양수) 또는 조직 샘플이 될 수 있으며, 통상적으로되고,이 프로토콜에 사용.
오존은 시아닌 염료를 저하하는 것으로 알려져있다 따라서 오존 모니터링 및 보호하는 것이 좋습니다. 오존 농도의 계절 변화는 일반적입니다. 지속적으로 우리의 실험실 감시 및 기록 오존 수준. 벽걸이 오존 제거 장치는 오존 농도와의 프로토콜, 특히 민감한 부분을 줄이기 위해 사용된다 (즉, 세정 및 주사 어레이) 오존 자유로운 후드에서 수행된다. 가능하면, 오존 수준은 5ppb 이하로 유지된다.
대부분의 시약은 효과적으로 품질 관리를 아웃소싱하는 제조업체의 키트로 구입하고 있습니다; 이것은 효과적인 전략으로 입증했다. 그러나,이 품질 관리가 필요하지 않음을 의미하지 않는다. 사실, 품질 메트릭을주의 깊게 이상에 대한 모니터링 : LOG2 비율 (DLRS)의 파생 표준 편차가 ㄱ해야0.2 elow, 시아닌 3, 5 신호 강도보다 큰 500는 시아닌 (3, 5) 신호 잡음 비율> (30)를해야하는 것입니다. 이 메트릭은 스캔 소프트웨어에 의해 주사 프로토콜의 일부로서 생성되고, 장기간 모니터링을 위해 기록된다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
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