Summary
Массив ГРЭС для обнаружения геномных вариантов числа копий заменил G-полосатую анализ кариотипа. Эта статья описывает технологии и их применение в диагностической лаборатории службы.
Introduction
Она была известна в течение многих лет, что делеции или дополнительные копии хромосомных сегментов вызывают интеллектуальной инвалидности, дисморфизм и congentical пороки развития, а в некоторых случаях вызывать генетические синдромы 1. Тем не менее, только технологии, доступные до середины 2000-х годов для генома обнаружения этих изменений было G-диапазонов хромосомный анализ, который имеет разрешение около 5-10MB, в зависимости от региона и характера дисбаланс, и которые не могут обнаружить аномальные хромосомы, где материал был заменен на области с различной хромосомы с той же схеме диапазонов. Вспомогательные цитогенетические методы, такие как флуоресценции в гибридизация и усиления зонда мультиплексной перевязки конкретных были доступны для допроса конкретного локусов, при подозрении на конкретном синдромному дисбаланса, но он не был до введения массива сравнительной геномной гибридизации (массив ГРЭС) в рутинной клинической диагностики се р в 2-5, что генома обнаружение варианты количества копий (ВКК) стало возможным в значительной степени повышенным разрешением (обычно около 120 КБ). Клиническая работа службы наряду исследований показали, что ВКК для некоторых регионов широко распространены в нормальной популяции 6-7, в то время другой ВКК, ранее обнаружить, связаны с neurodisabilities таких как аутизм и эпилепсия 8-11.
Протокол, описанный в этой статье, используются в нашей Национальной службы здравоохранения Великобритании (NHS) клинико-диагностической лаборатории; мы используем новые стратегии гибридизации, испытания партии и робототехники для минимизации затрат в этом состоянии, финансируемых службы.
До протокола, указанного ниже, высокое качество ДНК должна быть извлечена из соответствующего исходного материала, общ крови, культивируемых клеток или образцов ткани. Спектрофотометрии можно использовать для измерения концентрации (должно быть> 50 нг / мкл) и проверить 260: 280 коэффициентов абсорбции (б следуете 1,8-2,0). Гель-электрофорез может быть использован, чтобы проверить, что ДНК с высокой молекулярной массой без значительного ухудшения.
Этот протокол предназначен для более высокую пропускную способность лабораторий, которые нумерующих 96 проб в перспективе с использованием автоматической обработки робототехники жидкие. Тем не менее, он может быть адаптирован для более низких пропускной лабораторий без автоматизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Маркировка Реакция
- Перед использованием предварительно аликвоту цианин 3 и 5-меченых dUTPs, без маркировки нуклеотидов и случайных праймеров в концентрациях Рекомендуемая производителем в 96-луночные планшеты и хранить при температуре -20 С готов к использованию. Для целей настоящего Протокола, аликвотной 10,5 мкл соответствующей маркировкой дУТФ и 10,5 мкл немаркированные нуклеотидов и случайных праймеров в каждую лунку.
- Оттепель готовый к использованию 96-луночного планшета нуклеотидов и праймеров при 4 ° С в течение приблизительно 1 ч, защищенном от света.
- После оттаивания равновесие эту пластинку при комнатной температуре в течение по крайней мере 30 минут, защищенном от света месте.
- Равновесие образцы ДНК при 60 ° С в течение не менее 15 мин.
- Использование наливных робота, обойтись нуклеазы без воды в каждую лунку 96-луночного планшета.
Примечание: объем воды будет зависеть от концентрации каждого входного образца ДНК, и должно быть достаточным, чтобы привести к конечной концентрации 50 нг / мкл. - Использование жидкого ХанСл робота, пипетки 1 мкг ДНК в лунку 96-луночного планшета (см 1.5), чтобы довести общий объем до 20 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие количества ДНК могут быть использованы, хотя качество получаемых данных может быть нарушена (для драгоценных образцов, количества входных ДНК вплоть до 400 нг могут быть использованы). - Использование робота для жидкостей, передачи 20 мкл уравновешенной нуклеотидов и праймеров в каждую лунку пластины разбавленной ДНК.
- Уплотнение 96-луночный планшет с полосы крышек (уплотнение имеет решающее значение).
- Денатурация ДНК при 99 ° С в течение 10 мин в машине ПЦР с нагретой крышкой, а затем оснастку охладили на льду в течение 5 мин для отжига праймеров.
- Использование жидкого обслуживание робота, добавить 10 мкл Кленова Exo ДНК-полимеразы друг ДНК и пипетки тщательно перемешать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем должен быть 50 мкл. - Уплотнение 96-луночного планшета и инкубировать при 37 ° С в течение 16 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: короче инкубационный 4 часа достаточно, однако O / N вcubation может быть более удобным. - Использование наливных робота, добавить 5 мкл стоп-буфера в каждую лунку.
Примечание: Краткое реагентов, используемых в реакции маркировки показано в таблице 1.
2. Удаление без образования юридического лица нуклеотидов
- Удалить некорпоративные нуклеотидов с использованием силикагеля мембраной на основе спиновых колонны и специальный обработки колонка спин робота (спин колонки также могут быть обработаны вручную). Следуйте инструкциям производителя.
- Передача содержимого каждой лунки в 2 мл пробирку; предварительно этикетки них с хорошо идентификаторов.
Примечание: Этот шаг может быть выполнен вручную или, предпочтительно, с использованием жидкой обработки робота. - При использовании обработки робота спин колонки, а затем загрузить робота с 2 мл пробирки, спин колонок очистки ДНК и связанных с ними буферов.
- Добавить 250 мкл высоким содержанием соли, ДНК-связывающий буфер (буфер PB) в реакции маркировки для связывания меченого ДНК кремниевой кислотымембрана.
- Удаления примесей путем промывки мембраны в два раза с 500 мкл промывочного буфера (буфера PE).
- Добавить 15 мкл буфера низкой соли элюции буфер (EB) в мембране, чтобы восстановить очищенную, меченой ДНК в объеме ~ 12 мкл.
- Передача содержимого каждой лунки в 2 мл пробирку; предварительно этикетки них с хорошо идентификаторов.
3. Смешайте HYB Пары
- Объедините соответствующие пары цианиновых 3 и 5-меченой ДНК, СОТ-1 ДНК, поставляемые изготовителем блокирования смеси и производитель поставляемого гибридизации буфер с помощью наливных робота.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти HYB пары могут быть образцом и ссылки, или образец против образце, если общая ВКК не проблема (например, мы обычно пару фенотип несоответствие образцов, таких как почки дисплазии пациента В.С. краниосиностоз пациента, так как они очень вряд ли обладают таким же клинически значимого CNV). При использовании эталонного ДНК, коммерческий источник ДНК рекомендуется, и она должна быть обработана вместе с образцом.- Использование перевалке жидких ROличинка, добавить COT-1 ДНК (3333 нг / мкл), производитель поставляемого блокирования смесь и гибридизации буфер в каждую лунку 96-луночного планшета, так, что каждая лунка содержит 1,1 мкл COT-1 ДНК, блокирующий 4,95 мкл смеси и 24,75 мкл буфера гибридизации.
- Добавить 9,35 мкл соответствующих цианин 3-меченой ДНК в каждую лунку. Предварительное смачивание каждый наконечник, чтобы повысить пипетки точность.
- Добавить 9,35 мкл соответствующих цианин 5-меченой ДНК в каждую лунку. Предварительное смачивание каждый наконечник, чтобы повысить пипетки точность.
- Уплотнение 96-луночного планшета и вихрь в течение 1 мин. Спин в 96-луночный планшет для сбора содержимого в нижней части каждой лунки.
4. Гибридизация
- Разогреть гибридизации духовку до 65oC и prewarm один защитный слайд и один камеру гибридизации для каждого массива слайда.
- Денатурации меченой ДНК в предварительно гибридизации инкубации, прежде чем применять к массивам. Выполнение гибридизации во вращающейся печи в течение 24 ч.
- Инкубируйте 96-луночного планшета при 70 ° С в течение 30 мин, а затем оставить при 37 ° С в течение по меньшей мере 5 мин.
- Работа на нагретую платформу при 42 ° С, загружать каждый резервное слайд в камеру гибридизации перед применением. Убедитесь, что прозрачная часть прокладки слайд совпадет с "оконного" части гибридизации камеры.
- Пипеткой 42 мкл смеси для гибридизации, полученного ранее (смотри раздел 3) на соответствующей позиции в массиве опорного слайд. Предварительное смачивание каждый наконечник, чтобы повысить пипетки точность. Внесите медленно на центр каждой позиции, убедившись, что жидкость не прикасайтесь к резиновым кольцом границу.
- После того, как все позиции по заднему слайд заполнены, аккуратно опустите массива скользить по ней и соберите камеру гибридизации. Убедитесь, что сторона массив с записи на него смотрит подложки слайд. Будьте уверены, чтобы затянуть камеру гибридизации винт полностью.
- Осмотрите собранный камеру гибридизации. ЕNsure, что нет никакой утечки гибридизации смеси за пределы кольцевых резиновых и каждый пузырек воздуха ~ 4 мм в высоту, когда гибридизация камера покоилась на его вертикально. Поверните камеру гибридизации и убедитесь, что нет пузырьков воздуха, которые застряли в положении и не двигается. Если есть какие-либо из них, дайте камере резкое кран на скамейке запасных. Убедитесь, что все воздушные пузырьки движутся.
- Поместите камеру гибридизации в вращающейся печи при 65 ° С в течение 24 ч. Убедитесь, что печь ротор сбалансированный; использовать другие пустые камеры, если это необходимо.
5. Мойка и сканирование слайдов
- Вымойте массивы, чтобы удалить лишнюю меченой ДНК, а затем сканировать для измерения флуоресценции каждого зонда.
- Возьмите гибридизации камеры из печи и разобрать. Массива и прокладка слайды будут склеены; погрузите их в буфере для промывки 1 и использовать пару из пластика, плоским краями пинцета, чтобы вырвать их друг от друга.
- ДиSCard прокладку слайд и поместите массив слайд в стойку, погруженной в буфер 1.
- Промыть массива слайда в ~ 700 мл свежего промывочного буфера 1 в течение 5 мин, при интенсивном перемешивании (использовать блох и магнитной мешалкой).
- Передача массива слайд ~ 700 мл промывочного буфера 2 и мыть в течение 90 сек, при интенсивном перемешивании. Аккуратно поднимите массива выдвигается из промывочного буфера 2, они должны выйти сухими.
- Загрузите массива слайд в держатель слайдов сканера, используя слайд-покровителя. Загрузите слайд в сканере массива и сканирования в соответствии с инструкциями изготовителя массива.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Каждый зонд на гибридизированной массива визуализируется в виде смеси красных и зеленых флуорохромами (рис 1). Отношение красного до зеленого флуоресцентного сигнала для каждого зонда можно измерить с помощью сканера и соответствующего программного обеспечения участки них как отношения log2 в соответствии с их геномной позиции, и выявить районы, выходящие за пределы заданных границ. Полученные следы массива позволяют интерпретацию регионах, выявленных как genomically несбалансированным. Например, след от ребенка с синдромом Вильямса, синдром повторяющегося микроделеционный посредничестве низких повторов копирования в проксимальной области хромосомы 7, показано на рисунке 2. Этот дисбаланс был выявлен с помощью программного обеспечения и обозначается красной линией.
Зонд люминесцентные отношения журналов должны кластера тесно вокруг 0, как показано на рисунке 2, что указывает на зеленый / красный соотношение 1: 1 для нормальных областей генома. Рассеянные следы массив может Расула т к неточным призвания аномальных регионов, или с неустановлением геномной дисбаланс (рис 3). Такой разброс может быть вызвано целым рядом факторов, в том числе Плохое качество ДНК, или наличие повышенного уровня озона в атмосфере. Мониторинг уровней озона рекомендуется, и где повышенные уровни озона являются проблематичными, посвященные исключения шкафы озона в наличии; Использование этих шкафов обычно приводит к заметно улучшенным качеством массива.
Рисунок 1. Изображение массива следующей гибридизации. Белая коробка показана увеличенной области, где красные и зеленые зонды Зонды могут быть визуализированы (с указанием дисбаланс для областей, представленных этими датчиками), на фоне желтых зондов (с указанием сбалансированные геномных областей ).
Рисунок 2. () Пример трассировки для хромосоме 7 в образце с делецией 1.7Mb, показанной в среднем соотношении -0,8 для 43 последовательных проб. Удален область в этом случае связана с синдромом Вильямса-Берен, в соответствии с консультативным указанием дисморфических функций, пороком сердца и интеллектуальной инвалидности. (B) удаляются область выше отображается в USCS генома браузер, показывая генов в удалена область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3.Пример рассеянного следа массива для хромосоме 7 в образце с плохой гибридизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Реагент | Объем (мкл) |
| Грунтовки и реакционный буфер | 20 |
| ДНК (1 мкг) + вода | 20 |
| Полимеразы Кленова экзонуклеаза ДНК | 10 |
Таблица 1. Резюме реагентов, используемых в реакции маркировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Массив ГРЭС не будет обнаруживать сбалансированные перестройки или плоидности аномалии, такие как триплоидии. Кроме того, мозаика дисбаланс низкий уровень может быть не обнаружен. Тем не менее, массив ГРЭС имеет более высокое разрешение для обнаружения CNV, чем G-ленточной хромосомного анализа, который он заменил во многих цитогенетики лабораторий. Поэтому ток золотой стандарт для генома обнаружения CNV. Это может быть заменен технологий секвенирования следующего поколения в будущем, но в настоящее время, их стоимость и технические сложности, связанные с использованием короткого считывает для обнаружения CNV означает, что это еще не подходит для клинического применения.
Протокол, описанный здесь регулярно используется в нашей клинической лабораторной службы. Два пробеги 96 образцов каждого обрабатываются каждую неделю с использованием наливных робота и специального кремния мембраны обработки спин колонка робота. Автоматизация настоятельно рекомендуется повышение согласованности и поддержания качества. ДНК, выделенную из крови, Слюна, пренатальная образцы (например, ворсин хориона или амниотической жидкости) или образцы тканей может быть, и обычно есть используются с этим протоколом.
Озон, как известно, ухудшают цианиновые красители и поэтому мониторинга озона и защита рекомендуется. Сезонные колебания уровня озона является обычным явлением. Наша лаборатория контролирует и уровни записи озона непрерывно. Настенный блок удаления озона используется для уменьшения концентрации озона и, в частности, чувствительные к протоколу (то есть, стиральные и сканирование массивов) осуществляется в озоноразрушающих бесплатно капюшонами. Если это возможно, уровни озона была ниже 5 частей на миллиард.
Большинство реагенты купил как комплекты от известных производителей эффективно аутсорсинг контроля качества; Это оказалось эффективной стратегией. Тем не менее, это не означает, что контроль качества не требуется. Действительно, показатели качества тщательно контролироваться для каких-либо аномалий: производная стандартное отклонение коэффициентов log2 (DLRS) следует бElow 0,2, цианиновые 3 и 5-сигнала интенсивности должен быть больше, чем 500, и цианин 3 и 5-сигнал-шум должно быть> 30. Эти показатели формируются в рамках протокола сканирования в программном обеспечении сканирования и записываются для долгосрочного мониторинга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients. Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).
- Ahn, J. W., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).
- Beaudet, A. L. The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics. Child Dev. 84, 121-132 (2013).
- Park, S. J., et al. Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases. Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).
- Iafrate, A. J., et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).
- Redon, R., et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 444, 444-454 (2006).
- Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome. Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).
- Molin, A. M., et al. A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features. J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).
- Tropeano, M., et al. Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders. PLoS One. 8, e61365 (2013).
- Bon, B. W., et al. Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome. J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).
