배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

Introduction

대규모 병렬 리포터 분석 실험은 (MPRA)는 DNA 서열 ^{1 (7)을} 수천 수백 수천의 전사 규제 활동의 다중 측정을 할 수 있습니다. 자신의 가장 일반적인 실시 예에서, 다중화는 오픈 리딩 프레임의 하류 서열 식별 태그가 포함되어 합성 리포터 유전자를 관심있는 각각의 시퀀스를 연결함으로써 달성된다 (ORF를,도 1). 형질 감염, RNA 분리 및 리포터 유전자 전 사체의 3 '말단의 깊이 순서화에 따라, 결합 된 서열의 상대적인 활동은 식별 태그의 상대적인 풍부로부터 추론 될 수있다.

MPRA의 그림 1 개요. MPRA 기자의 라이브러리는 합성으로 추정 조절 서열을 결합하여 구성되어 구축서열 식별 태그 뒤에 (예로서 루시페라아제 또는 GFP) "불활성"ORF로 구성 리포터 유전자. 도서관은 배양 된 세포의 인구에 대거 형질 전환하고, 전사 리포터 mRNA를 연속적으로 회수한다. 깊은 순서는 기자의 mRNA와 형질 전환 된 플라스미드 중 각 태그의 발생 수를 계산하는 데 사용됩니다. 플라스미드 카운트 대응하는 조절 서열의 활성을 추정하는 데 사용될 수있는 동안의 mRNA의 비를 계산. 멜린 니코의 허가를 적응, 등 ^2.

MPRA은 관심 궤적 걸쳐 신규 조절 요소에 대해 개별 유전자 조절 요소는 1) 광범위한 돌연변이 유발, 2) 주사를 포함하여, 실험 다양한 설계에 적용 할 수 있으며, 3) 추정의 세트 천연 유전 적 변이의 효과를 테스트 프로모터, 인핸서 또는 소음기, 합성 규제 요소 사) 반 합리적인 엔지니어링. 리시퀀스 변종 braries은 퇴화 올리고 ^1,4, 조합 결찰 ⁸ 게놈 DNA ^5의 조각화 올리고 뉴클레오티드 라이브러리 프로그램 마이크로 어레이 ^2,3,6,7-에 합성 (OLS), 조립 등 다양한 방법을 사용하여 생성 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 프로모터의 라이브러리의 구조를 설명 변종 OLS와 pMPRA1 및 pMPRAdonor1 벡터 (각각 Addgene ID를 49349 및 49352; http://www.addgene.org)를 사용하여, 배양 된 포유류 세포 및 후속 정량에이 라이브러리의 일시 발현을 관련 태그의 깊은 시퀀싱 (태그-SEQ)에 의해 프로모터 활동. 이 프로토콜의 이전 버전 (2013) 연구 23, 800-811 멜린 니코 등. 자연 생명 공학 30, 271-277 (2012)과 Kheradpour 등. 게놈에보고 된 연구에 사용되었다.

Protocol

1 시퀀스 설계 및 합성

1. 시퀀스의 설계 및 합성에 MPRA 시작은 규제 활동을 분석합니다. pMPRA 벡터 시리즈와의 호환성을 위해 다음과 같은 템플릿을 사용하여 각 시퀀스를 설계 : 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- var에 -GGTACCTCTAGA- 태그 -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 var에 정량 할 수있는 순서를 나타내며, 태그는 하나 이상의 식별 태그를 의미한다 '.
2. 이 가변 영역 (VAR 및 태그) 사이 리포터 유전자 단편의 방향을 용이하게 결찰를 KpnI (GGTACC)과를 XbaI (TCTAGA) 제한 부위의 쌍에 의해 분리된다. 또한, 두 가지 SfiI (GGCCNNNNNGGCC) 사이트는 pMPRA 백본으로 방향 결찰 할 수 있도록 PCR에 의해 추가됩니다. 변수 영역이 제한 부위의 사본을 추가로 포함 할 수 없습니다. 필요한 경우, 이들 제한 효소 중 하나 이상을 대체 할 수있다만큼 대체품으로서 1) 주변 DNA 분자의 말단에 효율적인 절단을 허용하고, 2) 벡터 시퀀스의 다른 곳에서 절단되지 않는다. 자세한 내용에 대한 설명을 참조하십시오.
3. 상용 공급 업체에서 표 1에 필요한 프라이머를 얻습니다.

MPRA_SfiI_F	GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG
MPRA_SfiI_R	GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC
TAGseq_P1	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
TAGseq_P2	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [인덱스] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG

표 1 프라이머 서열. [색인] 다중화 시퀀싱에 사용될 6-8 NT 인덱스 시퀀스를 나타낸다. 다른 인덱스 적어도 8 TagSeq-P2 프라이머를 얻습니다. 모든프라이머의 HPLC 또는 PAGE로 정제해야한다.

4. 올리고 뉴클레오티드 라이브러리는 상업적 공급 업체 또는 코어 설비로부터 얻어진, 또는 제조자에 의해 설명 된 바와 같이 프로그램 가능한 마이크로 어레이 계 올리고 뉴클레오티드 합성기를 사용하여 생성 될 수있다. 100 ㎕의 TE 0.1 버퍼에 OLS 제품을 재현 탁.
5. 폴리 아크릴 아미드 겔을 변성 10 % TBE-우레아에 올리고 뉴클레오티드 라이브러리를 실행. 품질 (그림 2A)를 평가하는 ssDNA의 민감한 형광 얼룩 차선 얼룩 당 약 1 pmol의를 넣습니다.
6. 전체 길이의 올리고 뉴클레오티드에 대응 이산 밴드 시각화 할 수있는 경우 (도 2a, 레인 1과 2), 대응 아크릴 아미드 겔 슬라이스를 절제하고 진탕하면서 실온에서 밤새 100 ㎕의 TE 0.1로 올리고 뉴클레오티드를 용출. 그렇지 않으면, 원시 OLS 서스펜션을 사용하여 진행합니다.
7. PCR 증폭 ⁹ 에멀젼을 이용한 올리고 뉴클레오티드 라이브러리 SfiI 꼬리를 추가 > SUP.
8. 표 2에 설명 된대로 50 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 설정합니다. 다음 4 ℃에서 5 분 동안 300 ㎕의 Micellula DNA 에멀젼에서 오일과 계면 활성제 혼합물의 정제 키트와 소용돌이와 결합.

시약	1X 볼륨 (μL)
Herculase II 퓨전 DNA 중합 효소	0.5
5 배 Herculase II 반응 버퍼	10
의 dNTP (10 mM의 각)	1.25
BSA (20 ㎎ / ㎖)	1.25
프라이머 MPRA_SfiI_F (25 μM)	0.25
프라이머 MPRA_SfiI_R (25 μM)	0.25
OLS 템플릿 (1-10 attomol)	변화
핵산 분해 효소가없는 물	50

ve_content "> 표 2 에멀젼 PCR 반응 믹스 (수상).

9. 생성물의 외관없이 증폭 생성물의 최대 수율을 제공 농도를 사용하여 (섹션 1.12 참조).
10. PCR 튜브에 생성 된 에멀젼을 분배하고 95 ° C에서 (2 분 PCR의 20주기를 수행, 20 × 95 ° C에서 20 초, 55 ° C, 72 ° C에서 30 초에서 20 초], 95시 3 분 ° C).
11. 풀 텍싱 간단히 1 ㎖의 이소 부탄올을 첨가하여 각각의 350 μL 에멀젼 PCR 반응을 중단 한 후 DNA 정제 컬럼을 사용하여 증폭 산물을 정제하고.
12. 유물없는 증폭 (그림 2B)를 확인하기 위해 2 % 또는 4 % 아가로 오스 겔에 나누어를 실행합니다.

올리고 뉴클레오티드 합성 라이브러리의 그림 2 준비.) B)로 직접 이동 제품. 복잡한 올리고 뉴클레오티드 라이브러리의 PCR 증폭 자주 키메라 제품과 상한 및 하한 밴드로 나타날 수 있습니다 다른 아티팩트를 생성합니다. 에멀젼 PCR은 이러한 아티팩트를 최소화 할 수 있습니다.

2 라이브러리 생성

1. , 1 % 아가 로스 겔상에서 실행 2 시간, 50 ° C에서 SfiI으로 분해 벡터 pMPRA1 의해 선형화 된 플라스미드 백본을 준비한다 (이 경우, 2.5 KB 단위) 백본 밴드를 절제하고, 겔 정제 스핀 컬럼을 사용하여 정제.
2. 다이제스트2 시간 동안 50 ° C에서 SfiI와 단계 1.4에서 에멀젼 PCR 제품과는 DNA 정제 컬럼을 사용하여 정제.
3. , 선형화 된 벡터 백본에 프로모터 태그 라이브러리를 결찰하기 위해 소화 PCR 제품의 100 NG, 선형화 된 벡터 백본 및 T4 DNA 리가 아제의 50 NG를 포함하는 반응을 설정합니다. 20 분 리가을 비활성화하는 65 ° C에서 다음 열을 16 ° C에서 밤새 품어.
4. E. 변환 연결 반응으로 대장균. 라이브러리 복잡성을 유지하기 위해, 설계 라이브러리에있는 개별의 프로모터 태그 조합이보다 적어도 10 배 더 CFU를 획득하는 것을 목표로하고 있습니다.
5. 태그의 총 개수가 약 10 인 경우, 타겟은 전형적으로 도서관 CFU 당 6-8 병렬 변환을 수행함으로써 달성 될 수있다.
6. 각 변환의 경우, E. electrocompetent 50 μl를 결합 얼음에 결찰 믹스의 2 μL와 대장균 세포. 800 μL의 SOC에 세포를 전기 천공에 의해 변형 복구병렬 변환에서 세포를 결합 후 1 시간 동안 37 ° C에서 흔들어, 그리고에 의해 매체.
7. 변환 효율을 평가하기 위해 50 ~ 100 μg / ml의 카르 베니 실린와 LB 아가 플레이트에 복구 된 세포의 alinquot에서 순차적으로 희석 플레이트 하룻밤에 37 ° C를 품어. / V, V 복구 세포와 V의 전체 볼륨 시리얼 희석 걸리는 나누어의 볼륨 - 총 CFU로 (관찰 CFU) × (희석 계수) × (V V)를 추정한다.
8. 동시에, 회수 된 세포의 나머지가 100 μg / ml의 카르 베니 실린이 보충 된 200 ㎖의 LB에 접종하는 데 사용. 진탕 배양기에서 하룻밤 37 ° C에서 세포를 성장하고 표준 절차에 따라 플라스미드 DNA를 분리.
9. 2 시간 동안 50 ° C에서 SfiI으로 절연 플라스미드 라이브러리의 분취 다이제스트와 삽입물의 존재를 확인하는 1 % 아가 로스 겔상에서 실행.
10. C에 의해 플라스미드 라이브러리를 선형화를 KpnI과 XbaI로를 사용하여 프로모터 변종와 태그 사이에 utting. 소화 효율을 극대화하기 위해, 일련 digestions를 수행
11. 첫째, 1 시간 동안 37 ° C에서 KpnI에서 다이제스트 및 자기 구슬을 사용하여 정제. 둘째, 2 시간 동안 37 ° C에서 1 U 새우 알칼리 포스 파타 아제의 첨가를 XbaI으로 소화, 열은 5 분 동안 65 ° C에서 비활성화 한 다음 자석 구슬을 사용하여 정제.
12. 완전한 선형화를 확인하는 1 % 아가 로스 겔상에서 분취 액을 실행. 미가공 플라스미드가 보이면, 선형화 된 단편을 겔 정제한다.
13. 포유 동물 세포에 형질 전환에 적합한 MPRA 라이브러리를 생성하기 위해, 선형화 된 중간 라이브러리에 KpnI으로 절단 / XbaI으로 호환 끝으로 ORF를 결찰.
14. pMPRAdonor1에서 호환 luc2 ORF 부분을 준비하려면 1 시간 동안 37 ° C에서를 KpnI과 XbaI으로이 플라스미드를 소화하고 1 % 아가 로스 젤에서 실행됩니다. ORF 부분을 절제 (1.7 K이 경우, b) 및 겔 정제 스핀 컬럼을 사용하여 정제.
15. 단계 2.3-2.8에서 설명한 바와 같이 선형화 된 라이브러리에 중간 ORF 단편을 복제.
16. 1 시간 동안 37 ° C에서 KpnI으로 절단과 MPRA 라이브러리 (1-2 μg에 해당) 나누어지는 다이제스트와 1 % 아가 로스 젤에서 실행됩니다. 소화 라이브러리가 하나의 밴드로 실행하면 추가 밴드가 (일반적으로 중간 구조의 이월에 해당), 라이브러리는 다음과 같이 추가로 정제 할 수있다 관찰하는 경우, 섹션 3으로 진행합니다 :
17. 1 시간 동안 37 ° C에서 KpnI으로 절단으로 오염 된 라이브러리의 3-5 μg을 소화하고 4 ℃에서 하룻밤 0.8 % 아가로 오스 겔에서 실행됩니다.
18. 올바른 라이브러리 밴드를 절제 겔 정제 스핀 컬럼을 사용하여 DNA를 정제하고, 1 시간 동안 37 ° C에서 고농도의 T4 DNA 리가 아제를 이용하여자가 결찰을 수행한다. 단계 2.8에 설명 된대로 그런 다음 변환 및 최종 라이브러리 DNA 분리를 반복합니다.

3 Transfection, 동요 및 RNA 분리

1. 각각의 독립적 인 형질 감염, 적절한 배양 배지에서 세포를 필요 매수 (MPRA 라이브러리의 복잡성에 의해 결정된 바와 같이, 논의 참조). 예를 들어, DMEM에서 배양 HEK293T / 17 세포를 10 % FBS 및 L-글루타민 / 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충. 각 라이브러리 및 실험 조건에 대한 적어도 두 개의 독립적 인 형질 감염을위한 세포를 배양.
2. MPRA 플라스미드와 함께 배양 된 세포를 형질. 형질 전환 방법 및 조건은 각 세포 유형에 맞게 최적화해야합니다. 각 형질 샘플 들어, 정합 제어로서 플라스미드 DNA의 분취 액 (50-100 NG)를 유지한다.
3. 예를 들어, 0.5 × 10 ⁷ HEK293T / 성장 17 세포를 형질에 ~ 나는 30 ㎕의 리포 펙 타민 LTX 10 μL 플러스 시약을 사용하여 혈청 중 감소 된 1 ml의 옵티-MEM에서 10 μg 플라스미드 DNA와 10cm 배양 접시에 50 %의 합류. 5시간 후 형질 전환 혼합물을 제거하고 허용세포는 24 ~ 48 시간 동안 복구 할 수 있습니다.
4. 선택적으로, 설계 라이브러리의 상황에 또는 신호에 의존하는 조절 서열을 활성화하는 데 필요한 교란을 수행합니다.
5. 세포를 수확과 제조업체의 지침을 사용하여 표준 올리고 (DT) 셀룰로오스 열 또는 구슬을 사용하여 폴리 (A) + mRNA를을 격리 할 것.
6. 열 또는 구슬의 최대 결합 용량이 수확 한 세포에서 mRNA의 예상 총 금액을 초과 할 수 있는지 확인합니다. 예를 들어, 3.3에서 기대 수익률은 약 0.5 내지 2.5 μg의 mRNA이다.

4 태그-SEQ

1. 형질 세포 용 해물에서 벡터 DNA의 이월을 제거하기 위해 2.4 ㎕의 터보 DNase의 불 활성화 시약을 1 시간 동안 37 ° C에서 1 μL 터보 DNase의 (2 U) 및 2.3 ㎕의 10 배 터보 DNase의 버퍼 각 20 μL mRNA의 샘플을 처리 추가 RT 후 5 분간 혼합과 90 초간 원심 분리기에 10,000그램 및 위해 신선한 용액 튜브에 옮긴다.
2. 확인 아가로 오스 겔상에서의 제품을 각각의 mRNA 시료 60-100 ng의 섹션 4.6에 설명 된 바와 같이 PCR을 수행하고 실행하여 순도. (luc2와 pMPRA1를 사용하는 경우 0.25 킬로바이트) 특정 증폭 산물을 볼 수있는 경우, 열은 치료의 mRNA를 정제 한 후 DNase를 처리를 반복합니다.
3. , 태그-SEQ 시퀀싱 라이브러리를 생성하는 cDNA에 기자의 mRNA를 변환 PCR에 의해 시퀀싱 어댑터를 추가합니다.
4. 표 3에 설명 된대로의 mRNA / RT 프라이머 혼합물을 설정합니다. 다음 얼음에 놓고 5 분 동안 65 ° C에서 품어. 표 4에 설명 된대로 병행하여, cDNA 합성 반응을 설정합니다.

시약	1X 볼륨 (μL)
mRNA의 샘플 (400-700 NG 전체)	8
올리고 0dT (50 μM)	1
의 dNTP (10 mM의 각)	1

cDNA 합성을위한 ove_content "> 표 3 RNA / 역전사 프라이머 믹스.

시약	1X 볼륨 (μL)
10 배 첨자 III RT 버퍼	이
MgCl2를 (25 밀리미터)	4
DTT (0.1 M)	이
RNaseOut (40 U / μL)	1
첨자 III (200 U / μL)	1

표 4의 cDNA 합성 반응 믹스.

5. 조심스럽게 mRNA의 / RT 프라이머 cDNA 합성 믹스와 혼합 결합한다. 50 분, 5 분, 85 ° C, 50 ° C에서 부화 한 후 얼음에 배치합니다. 마지막으로, 20 분 동안 37 ° C에서 2 U 리보 뉴 클레아 제의 H와 부화.
6. 4-6 μL와 표 5에 설명 된대로 PCR 반응을 설정cDNA의 반응 혼합물 또는 템플릿으로 50 ng의 리포터 플라스미드. 그런 다음 PCR 증폭 (2 분 95 ° C, 26 X [30 초 동안 95 ° C, 30 초 30 초 동안 55 ° C, 72 ° C], 3 분 동안 72 ° C)를 수행합니다.

시약	1X 볼륨 (μL)
배 PfuUltra II HotStart PCR 마스터 믹스	25
프라이머 TagSeq_P1 (25 μM)	0.5
프라이머 TagSeq_P2 (25 μM)	0.5
템플릿 (mRNA를 cDNA를 혼합 또는 플라스미드 DNA)	변화
핵산 분해 효소가없는 물	50

표 5 태그-SEQ PCR 반응 혼합물.

7. 2 % 아가 로스 젤 PCR 제품을 실행 태그-SEQ 라이브러리 증폭 산물에 해당하는 소비세 밴드 (0.25 킬로바이트 사용하는 경우luc2와 pMPRA1) 및 이들의 겔 정화 스핀 열을 정화.
8. 수영장, 변성 및 Illumina의 시퀀싱 기기와 직접 정제 된 태그-SEQ 증폭 산물을 시퀀싱.
9. 필터 저품질는 시퀀스 태그 내에 30 개 미만의 점수 또는 b) 정확하게 설계된 태그가 일치하지 않는 Phred 품질로 하나 이상의 위치를​​ 포함) 모두를 제거하여 판독한다. 나머지 각 태그는 각 도서관에 나타나는 횟수를 계산합니다. TPM에 (백만 시퀀싱 태그 당 태그) 태그 카운트를 정규화 한 후 시퀀싱 라이브러리의 각 쌍에 대한 플라스미드 유래 태그 카운트 위에 유래의 mRNA 태그 카운트의 비율을 계산한다. 서로 다른 여러 태그를 각 시퀀스 변종에 연결 한 경우, 다운 스트림 분석을 위해 자신의 평균 비율을 사용합니다.

Representative Results

MPRA 고해상도, 전사 조절 요소의 시퀀스 - 활성 관계를 정량적으로 절개를 용이하게한다. 성공적인 MPRA 실험은 전형적으로 형질 라이브러리 (도 3a)에서 서열의 대부분 고도로 재현 가능한 측정 값을 수득한다. 나쁨 재현성 (도 3b)이 관찰되는 경우, 이는 정량 서열 중 하나) 낮은 절대 활성, 또는 2) 낮은 형질 감염 효율 하나에, 회수 된 RNA 샘플에서 리포터의 mRNA 너무 낮은 농도를 나타낸다.

도 4는 시금 생성 대표적인 "공간 ^정보"를 보여준다 ~ ^1,2 또는 센다이 바이러스에의 노출없이 HEK293 세포에서 인간 IFNB 유전자의 상류에 145 bp의 서열의 임의의 변형 37000. 발기인 TATA 박스 알려진 근위 증강 ^(10)는 명확하게 정보가 풍부한 REGI으로 식별 할 수 있습니다바이러스 의존적으로 기능.

그림 3 태그-SEQ 재현성. 고 (A)과 낮은 (B) 재현성이 독립적 인 복제 형질에서 태그-SEQ 데이터의 예를 나타내는 산포도. 후자의 플롯은 반복에의 한 높은 mRNA의 수가 많은 아웃 라이어의 태그를 보여줍니다. 이러한 유물은 일반적으로 기자의 mRNA의 농도 인해 기자의 구조 중 낮은 절대 활동, 또는 낮은 형질 전환 효율에 하나, 정량적 PCR 증폭 너무 낮았다을 나타냅니다.

인간의 IFNB 전사 시작 사이트와 근위 증강의 그림 4 정보 배출량 측정. IFNB 인간 유전자의 뉴클레오티드 145 (NT) 영역의 약 37,000 랜덤 변형 (A)로 및 센다이 바이러스 (B)의 노출없이 HEK293 세포를 사용 MPRA 분석 하였다. 파란색 막대는 각 위치에서 리포터 출력 및 뉴클레오타이드 간의 상호 정보를 나타낸다. 근위 증강 및 TATA 박스는 바이러스 감염시 높은 정보 콘텐츠의 영역으로 눈에 띄는.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide library synthesis	Agilent, CustomArray, or other OLS vendors	custom	If using OLS construction method
pMPRA1	Addgene	49349	MPRA plasmid backbone
pMPRAdonor1	Addgene	49352	luc2 ORF donor plasmid
TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)	Generic	n/a	OLS buffer
Novex TBE-Urea Gels, 10%	Life Technologies	EC6875BOX	PAGE purification of OLS products
Novex TBA-Urea Sample Buffer	Life Technologies	LC6876	PAGE purification of OLS products
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494	PAGE purification of OLS products
Micellula DNA Emulsion & Purification Kit	EURx/CHIMERx	3600-01	Library amplification by emulsion PCR
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600675	Polymerase for emulsion PCR
SfiI	New England Biolabs	R0123S	Library cloning with pMPRA vectors
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S	Library cloning with pMPRA vectors
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Library cloning with pMPRA vectors
T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)	New England Biolabs	M0202T	Library cloning with pMPRA vectors
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Life Technologies	C4040-50	Library cloning with pMPRA vectors
LB agar and liquid media with carbenicllin	Generic	n/a	Growth media for cloning
E-Gel EX Gels 1%	Life Technologies	G4010-01	Library verification and purification
E-Gel EX Gels, 2%	Life Technologies	G4010-02	Library verification and purification
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	Library and backbone purification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Library DNA isolation
Cell culture media	n/a	n/a	Experiment-specific
Transfection reagents	n/a	n/a	Experiment-specific
MicroPoly(A)Purist Kit	Life Technologies	AM1919	mRNA isolation
TURBO DNA-free Kit	Life Technologies	AM1907	Plasmid DNA removal
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Life Technologies	18080-051	cDNA synthesis
PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix	Agilent	600850	Polymerase for Tag-Seq PCR
Primers (see text)	IDT	custom	PAGE purify Tag-Seq primers