Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

Introduction

Ensaios Repórter Massively Parallel (MPRA) permitem a medição multiplexado das atividades de regulação transcricional de milhares a centenas de milhares de seqüências de DNA ^{1 a 7.} Na sua aplicação mais comum, a multiplexação é obtida por acoplamento de cada sequência de interesse de um gene repórter sintético que contém uma marca de identificação de sequência a jusante de uma grelha de leitura aberta (ORF, Figura 1). Após a transfecção, o isolamento do RNA e profunda seqüenciamento de extremidades 3 'dos ​​transcritos do gene repórter, as atividades relativas das sequências acopladas pode ser inferida a partir da abundância relativa de suas etiquetas de identificação.

Figura 1 Visão de MPRA. Uma biblioteca de MPRA repórter constrói é construído acoplando sequências regulatórias putativos para sintéticogenes repórter que são constituídas por uma "inerte" (ORF tais como GFP ou luciferase), seguido por uma sequência de marcação de identificação. A biblioteca é transfectado em massa para uma população de células cultivadas e o ARNm transcrito repórter é subsequentemente recuperado. Sequenciação profunda é utilizado para contar o número de ocorrências de cada etiqueta de entre os ARNm e os plasmídeos repórter transfectadas. A proporção de ARNm conta sobre contagens de plasmídeo pode ser usada para inferir a actividade da sequência reguladora correspondente. Adaptado com permissão de Melnikov, et al ^2.

MPRA podem ser adaptadas a uma ampla variedade de modelos experimentais, incluindo 1) mutagénese global de elementos reguladores de genes individuais, 2) para digitalização através de novos elementos reguladores um locus de interesse, 3) para testar o efeito da variação genética natural em um conjunto de putativas promotores, intensificadores ou silenciadores, e 4) engenharia semi-racional de elementos reguladores sintéticos. LiAs variantes da sequência de braries pode ser gerado utilizando uma variedade de métodos, incluindo síntese de biblioteca de oligonucleótidos (OLS) em microarrays programáveis ^{​​2,3,6,7,} montagem de oligonucleótidos degenerados, ^1,4 ligadura combinatória ⁸ e fragmentação do ADN genómico ^5.

Este protocolo descreve a construção de uma biblioteca de variantes do promotor utilizando MQO e os vectores e pMPRA1 pMPRAdonor1 (Addgene IDs de 49349 e 49352, respectivamente; http://www.addgene.org), a transfecção transiente desta biblioteca em células de mamífero de cultura e quantificação subsequente das atividades promotoras de profunda seqüenciamento de suas marcas associadas (Tag-Seq). Versões anteriores deste protocolo foram utilizados na pesquisa, publicada na Melnikov et al. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) e em Kheradpour et al. Genome Research 23, 800-811 (2013).

Protocol

1 Seqüência de Projeto e Síntese

1. Comece MPRA com o desenho e síntese de sequências a ser testado para a actividade reguladora. Para compatibilidade com a série vector pMPRA, projetar cada seqüência usando o seguinte modelo: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- tag -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 ', onde var denota a seqüência a ser analisada e tag denota uma ou mais marcas de identificação.
2. As duas regiões variáveis ​​(e var tag) são separados por um par de Kpnl (GGTACC) e XbaI (TCTAGA) locais de restrição para facilitar a ligação direccional de um fragmento do gene repórter entre eles. Além disso, dois locais distintos Sfil (GGCCNNNNNGGCC) será adicionado por PCR para permitir a ligação direccional no esqueleto pMPRA. As regiões variáveis ​​não devem conter cópias adicionais de qualquer destes locais de restrição. Se necessário, uma ou mais destas enzimas de restrição pode ser substituído, Desde que as substituições 1) permitir que o corte eficaz perto das extremidades de moléculas de DNA, e 2) não cortar em outros lugares na sequência do vector. Veja a discussão para obter detalhes adicionais.
3. Obter os iniciadores necessários listados na Tabela 1 a partir de um fornecedor comercial.

MPRA_SfiI_F	GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG
MPRA_SfiI_R	GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC
TAGseq_P1	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
TAGseq_P2	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [índice] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG

Tabela 1 sequências de primer. [Índice] denota uma seqüência de índice 6-8 nt utilizado para seqüenciamento multiplexado. Obter pelo menos 8 primers TagSeq-P2 com diferentes índices. Todosdos iniciadores deve ser purificado por HPLC ou PAGE.

4. Bibliotecas oligonucleotídicas podem ser obtidas a partir de um vendedor ou de núcleo instalação comercial, ou gerado usando um sintetizador de oligonucleótidos baseada microarray programável, tal como descrito pelo fabricante. Ressuspender os produtos OLS em 100 ul de tampão TE 0,1.
5. Executar as bibliotecas de oligonucleótidos sobre um 10% de TBE-ureia desnaturante em gel de poliacrilamida. Coloque cerca de 1 pmol por pista e mancha com mancha fluorescente ssDNA-sensível para avaliar a sua qualidade (Figura 2A).
6. Se uma banda discreta correspondente aos oligonucleótidos de comprimento completo pode ser visualizado (Figura 2A, pistas 1 e 2), excisar a fatia de gel correspondente a acrilamida e eluir oligonucleótidos em 100 ul de TE 0,1 durante a noite à temperatura ambiente com agitação. Caso contrário, continue usando o OLS suspensão de matéria.
7. Amplificar e adicionar caudas Sfil para a biblioteca oligonucleotídeo utilizando emulsão PCR ⁹ sup>.
8. Defina-se 50 ul de misturas de reacção de PCR como descrito na Tabela 2. Em seguida combinam-se com 300 ul mistura de óleo e agente tensioactivo da emulsão e ADN Micellula kit de purificação e de vórtice durante 5 min a 4 ° C.

Reagente	1x Volume (uL)
Herculase II Fusão ADN Polimerase	0,5
Tampão de reacção 5x Herculase II	10
de dNTP (10 mM cada)	1,25
BSA (20 mg / ml)	1,25
MPRA_SfiI_F Primer (25 uM)	0,25
MPRA_SfiI_R Primer (25 uM)	0,25
Modelo OLS (1-10 attomol)	varia
Água livre de nuclease	50

ve_content "> Tabela 2 Emulsão mistura de reacção de PCR (fase aquosa).

9. Utilizar a concentração que dá o máximo de rendimento de produtos de amplificação, sem o aparecimento de artefactos (ver secção 1.12).
10. Dispensar a emulsão resultante em tubos de PCR e executar 20 ciclos de PCR (2 minutos a 95 ° C, 20 x [20 s a 95 ° C, 20 seg a 55 ° C, 30 segundos a 72 ° C], 3 min a 95 ° C).
11. Piscina e romper cada emulsão de reacção de PCR de 350 ul por adição de 1 ml de isobutanol e brevemente vórtex e, em seguida, purificar o produto de amplificação, utilizando uma coluna de purificação de ADN.
12. Executar uma aliquota sobre um gel de agarose a 2% ou 4% para verificar a amplificação livre de artefacto (Figura 2B).

Figura 2: Preparação de bibliotecas de síntese de oligonucleótidos. UM) B) produtos de aberto e de emulsão de amplificação por PCR da mesma biblioteca de oligonucleótidos corrida num gel de agarose. Amplificação por PCR de bibliotecas de oligonucleotídeos complexas freqüentemente cria produtos quiméricos e outros artefatos que podem aparecer como bandas superiores e inferiores. Emulsão PCR pode minimizar esses artefatos.

2 Construção da Biblioteca

1. Prepara-se uma estrutura do plasmideo linearizado por digestão com Sfil pMPRA1 vector a 50 ° C durante 2 horas, corrido num gel de agarose a 1%, excisão da banda de espinha dorsal (neste caso, de 2,5 kb) e purificá-lo através de uma coluna de gel de spin-purificação.
2. Digestos produtos de PCR a partir de emulsão passo 1.4 com Sfil a 50 ° C durante 2 horas e purificar por meio de colunas de purificação de ADN.
3. Para ligar a biblioteca de promotor-tag na estrutura do vector linearizado, configurar as reacções contendo 100 ng do produto de PCR digerido, 50 ng do esqueleto do vector linearizado e ADN-ligase de T4. Incubar durante a noite a 16 ° C e, em seguida, aquece-se a 65 ° C durante 20 minutos para inactivar a ligase.
4. Transformar E. coli com a reacção de ligação. Para preservar a complexidade biblioteca, visam obter pelo menos 10x mais ufc do que há combinações distintas promotor-tag na biblioteca projetada.
5. Quando o número total de marcadores é de aproximadamente 100.000, o ufc alvo pode normalmente ser conseguido através da realização de transformações paralelas 6-8 por biblioteca.
6. Para cada transformação, combinar 50 ul electrocompetentes E. As células de E. coli com 2 ul de mistura de ligação em gelo. Transformar por electroporação, recuperar as células em 800 ul SOCpor meio de agitação a 37 ° C durante 1 hora, e, em seguida, combinam as células a partir das transformações paralelas.
7. Para avaliar a eficiência da transformação, placa de diluições em série a partir de uma alinquot de células recuperadas em placas de LB-agar com 50-100 ug / ml de carbenicilina e incubar durante a noite a 37 ° C. Estimar ufc totais (CFU observada) x (factor de diluição) x (V - V) / V, em que V é o volume total de células recuperado e v é o volume da alíquota para as diluições em série.
8. Ao mesmo tempo, utilizar o restante das células recuperadas para inocular 200 ml de LB suplementado com 100 ug / ml de carbenicilina. Crescer as células a 37 ° C durante a noite numa incubadora com agitador e, em seguida, isolar o ADN de plasmídeo de acordo com procedimentos normalizados.
9. Digerir uma aliquota do plasmídeo da biblioteca isolado com Sfil a 50 ° C durante 2 horas e separado num gel de agarose a 1% para confirmar a presença dos insertos.
10. Linearizar o plasmídeo da biblioteca por cutting entre as variantes do promotor e tags usando Kpnl e Xbal. Para maximizar a eficiência da digestão, realizar digestões de série:
11. Primeiro, digerir com Kpnl a 37 ° C durante 1 hora e purificar usando esferas magnéticas. Em segundo lugar, digerir com Xbal com adição de 1 U de fosfatase alcalina de camarão a 37 ° C durante 2 horas, o calor inactiva a 65 ° C durante 5 min, e em seguida purificar usando esferas magnéticas.
12. Executar uma aliquota sobre um gel de agarose a 1% para verificar a linearização completa. Se o plasmídeo não cortado é visível, o fragmento linearizado deve ser purificado em gel.
13. Para gerar uma biblioteca MPRA adequado para transfecção em células de mamíferos, ligar uma ORF com KpnI / XbaI extremidades -compatível na biblioteca intermediário linearizado.
14. Para preparar um fragmento ORF luc2 compatível de pMPRAdonor1, digerir este plasmídeo com Kpnl e Xbal a 37 ° C durante 1 hora e corrido num gel de agarose a 1%. Extirpar o fragmento ORF (1,7 kb neste caso) e purifica-se utilizando uma coluna de gel de purificação de centrifugação.
15. Clonar o fragmento do ORF na biblioteca intermediário linearizado como descrito nos passos 2,3-2,8.
16. Digerir uma aliquota (correspondendo a 1-2 ng) da biblioteca MPRA com Kpnl a 37 ° C durante 1 hora e corrido num gel de agarose a 1%. Se a biblioteca digerido é executado como uma única banda, avance para a secção 3 Se forem observadas bandas adicionais (correspondendo tipicamente a transição de construções intermédios), a biblioteca pode ser ainda purificado como se segue:
17. Digerir 3-5 ug da biblioteca contaminado com Kpnl a 37 ° C durante 1 hora e corrido num gel de agarose a 0,8% durante a noite a 4 ° C.
18. Excisar a banda correcta biblioteca, purificar o ADN utilizando uma coluna de purificação de gel de rotação e realizar a auto-ligação de alta concentração utilizando a ligase de ADN de T4 a 37 ° C durante 1 hora. Em seguida, repetir a transformação e isolamento final, biblioteca de ADN, tal como descrito na etapa 2.8.

3 Transfection, perturbação, e Isolamento de RNA

1. Para cada transfecção independentes, o número necessário de cultura de células (tal como determinado pela complexidade da biblioteca MPRA, ver discussão) em meio apropriado. Por exemplo, a cultura de células HEK293T / 17 em meio DMEM suplementado com 10% de FBS e L-glutamina / penicilina / estreptomicina. Células de cultura durante pelo menos duas transfecções independentes para cada biblioteca e condição experimental.
2. Transfectar as células cultivadas com plasmídeos MPRA. O método e as condições de transfecção deve ser optimizada para cada tipo de célula. Para cada uma das amostras transfectadas, reter-se uma alíquota (50-100 ng) de ADN de plasmídeo como controlo correspondente.
3. Por exemplo, transfectar 0,5 x 10 ⁷ HEK293T / 17 células cultivadas para ~ 50% de confluência numa placa de cultura de 10 centímetros, com 10 ug de plasmídeo de DNA em 1 ml de Opti-MEM I Reduced Serum Medium, utilizando 30 ul de Lipofectamina LTX e 10 ul de reagente Além disso. Retirar a mistura de transfecção após 5 horas e permitir que océlulas recuperar durante 24-48 hr.
4. Opcionalmente, execute qualquer perturbação necessária para ativar seqüências regulatórias ao contexto ou dependentes de sinal na biblioteca projetada.
5. Colher as células e isolar ARN poli (A) + ARNm utilizando colunas padrão de oligo (dT) celulose ou pérolas utilizando as instruções do fabricante.
6. Assegure-se que a capacidade máxima de ligação das colunas ou grânulos exceder a quantidade total de ARNm esperado a partir das células colhidas. Por exemplo, o rendimento esperado da seção 3.3 é de cerca de 0,5-2,5 mg mRNA.

4. Tag-Seq

1. Para eliminar o arraste de ADN do vector a partir dos lisados ​​de células transfectadas, o tratamento de cada uma das amostras de mRNA de 20 ul com 1 ul Turbo ADNase (2 U) e 2,3 ul de tampão 10x turbo ADNase a 37 ° C durante 1 h, adicionar 2,4 mL de reagente de DNase Turbo Inactivação pelo RT durante 5 min, com agitação, de centrifugação a 10.000 g durante 90 segundos, e, em seguida, transferir a solução para um tubo fresco.
2. Verifique pureza através da realização de PCR, como descrito na secção 4.6 em 60-100 ng de cada amostra de mRNA, e depois executar os produtos em gel de agarose. Se os fragmentos específicos são visíveis (0,25 kb se usando pMPRA1 com luc2), coluna de purificar o mRNA tratada e, em seguida, repetir o tratamento DNase.
3. Para gerar bibliotecas de sequenciamento Tag-Seq, converter mRNA repórter de cDNA e adicione adaptadores de sequenciamento por PCR.
4. Defina-se misturas de iniciadores de ARNm / IF, tal como descrito na Tabela 3. Incubar a 65 ° C durante 5 min, em seguida, colocar em gelo. Em paralelo, criar reacções de síntese de cDNA, como descrito na Tabela 4.

Reagente	1x Volume (uL)
amostra de ARNm (400-700 ng total)	8
Oligo-0DT (50 uM)	1
de dNTP (10 mM cada)	1

ove_content "> Tabela 3 ARN / transcrição reversa mistura de iniciadores para a síntese de cDNA.

Reagente	1x Volume (uL)
10x SuperScript III RT buffer	2
MgCl2 (25 mM)	4
DTT (0,1 M)	2
RNaseOut (40 U / ul)	1
SuperScript III (200 U / ul)	1

Tabela 4 Mistura de reacção de síntese de cDNA.

5. Suavemente combinar ARNm / RT iniciador mistura com misturas de síntese de cDNA. Incubar a 50 ° C durante 50 min, 85 ° C durante 5 min e, em seguida, colocar em gelo. Finalmente, incubar com 2 U de ribonuclease H, a 37 ° C durante 20 min.
6. Defina-se reacções de PCR como descrito na Tabela 5 com 4-6 ulmistura de reacção de cDNA ou 50 ng de plasmídeo repórter como modelos. Em seguida, realizar a amplificação por PCR (95 ° C durante 2 min, 26 x [95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg], 72 ° C durante 3 min).

Reagente	1x Volume (uL)
2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix	25
TagSeq_P1 Primer (25 uM)	0,5
TagSeq_P2 Primer (25 uM)	0,5
Molde (mRNA, cDNA ou a mistura de ADN de plasmídeo)	varia
Água livre de nuclease	50

Tabela 5 mix reação Tag-Seq PCR.

7. Executar os produtos de PCR através de um gel de agarose a 2%, faixas especiais de consumo correspondentes aos amplicons biblioteca de tags-Seq (0,25 kb se usandopMPRA1 com luc2) e purificar estas usando colunas de giro de purificação em gel.
8. Pool, desnaturar e sequenciar os amplicons Tag-Seq purificadas diretamente com um instrumento seqüenciamento Illumina.
9. Filtro de baixa qualidade lê, removendo tudo o que a) conter um ou mais posição com uma qualidade Phred pontuação inferior a 30 dentro da tag seqüenciado ou b) não corresponde exatamente a tag projetado. Conte o número de vezes que cada etiqueta restante aparece em cada biblioteca. Normalizar as contagens de tag de TPM (tags por milhão de etiquetas sequenciados) e, em seguida, calcular a relação de contagem de tag ARNm derivados sobre contagens tag derivado de plasmídeo para cada par de bibliotecas de sequenciação. Se várias marcas diferentes foram ligados a cada variante de sequência, use os seus rácios médios para análise a jusante.

Representative Results

MPRA facilita alta resolução, dissecção quantitativa das relações de elementos reguladores da transcrição seqüência de atividades. Um experimento MPRA bem sucedido irá tipicamente produzir medições altamente reprodutíveis para a maioria das sequências na biblioteca transfectadas (Figura 3A). Se for observada uma fraca reprodutibilidade (Figura 3B), isto é indicativo de uma muito baixa concentração de mRNAs repórter nas amostras de RNA recuperado, devido ou a 1) reduzida actividade absoluta entre as sequências ensaiadas, ou 2) a baixa eficiência de transfecção.

A Figura 4 mostra uma representação "pegada informações" ^1,2 gerado por ensaio ~ 37.000 variantes aleatórias de uma sequência de 145 pb a montante do gene ifnb humano em células HEK293 com ou sem exposição ao virus Sendai. O promotor TATA-box e conhecido potenciador proximal ¹⁰ pode ser claramente identificada como regi rica em informaçõesons de um modo dependente de vírus.

Figura 3 Tag-Seq reprodutibilidade. Gráficos de dispersão que mostram exemplos de dados de tag-Seq de dois transfections réplicas independentes com alta (A) e baixa (B) reprodutibilidade. A última trama mostra muitas marcas de outlier com contagens elevadas de ARNm em apenas uma das duas repetições. Tais artefactos tipicamente indicam que as concentrações de ARNm repórter foram demasiado baixos para a amplificação de PCR quantitativa, quer devido a baixas actividades absolutas entre as construções repórter, ou baixos níveis de eficiência de transfecção.

Figura 4. Informação pegada do local de início da transcrição ifnb humano e potenciador proximal. ifnb foram ensaiadas usando MPRA em células HEK293 com (A) e sem (B) exposição a vírus de Sendai. As barras azuis mostrar a informação mútua entre a saída do repórter e as sequências de nucleótidos em cada posição. O potenciador proximal e caixa TATÁ destacam como regiões com elevado teor de informação, por infecção viral.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide library synthesis	Agilent, CustomArray, or other OLS vendors	custom	If using OLS construction method
pMPRA1	Addgene	49349	MPRA plasmid backbone
pMPRAdonor1	Addgene	49352	luc2 ORF donor plasmid
TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)	Generic	n/a	OLS buffer
Novex TBE-Urea Gels, 10%	Life Technologies	EC6875BOX	PAGE purification of OLS products
Novex TBA-Urea Sample Buffer	Life Technologies	LC6876	PAGE purification of OLS products
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494	PAGE purification of OLS products
Micellula DNA Emulsion & Purification Kit	EURx/CHIMERx	3600-01	Library amplification by emulsion PCR
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600675	Polymerase for emulsion PCR
SfiI	New England Biolabs	R0123S	Library cloning with pMPRA vectors
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S	Library cloning with pMPRA vectors
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Library cloning with pMPRA vectors
T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)	New England Biolabs	M0202T	Library cloning with pMPRA vectors
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Life Technologies	C4040-50	Library cloning with pMPRA vectors
LB agar and liquid media with carbenicllin	Generic	n/a	Growth media for cloning
E-Gel EX Gels 1%	Life Technologies	G4010-01	Library verification and purification
E-Gel EX Gels, 2%	Life Technologies	G4010-02	Library verification and purification
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	Library and backbone purification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Library DNA isolation
Cell culture media	n/a	n/a	Experiment-specific
Transfection reagents	n/a	n/a	Experiment-specific
MicroPoly(A)Purist Kit	Life Technologies	AM1919	mRNA isolation
TURBO DNA-free Kit	Life Technologies	AM1907	Plasmid DNA removal
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Life Technologies	18080-051	cDNA synthesis
PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix	Agilent	600850	Polymerase for Tag-Seq PCR
Primers (see text)	IDT	custom	PAGE purify Tag-Seq primers