Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas

Introduction

Ensayos Reporteros Massively Parallel (MPRA) permiten medir multiplexado de las actividades reguladoras de la transcripción de miles a cientos de miles de secuencias de ADN ^1-7. En su aplicación más común, la multiplexación se logra mediante el acoplamiento de cada secuencia de interés a un gen indicador sintético que contiene una identificación de etiqueta de secuencia aguas abajo de un marco de lectura abierto (ORF; Figura 1). Después de la transfección, el aislamiento de ARN y secuenciación profunda de los extremos 3 'de los transcritos del gen reportero, las actividades relativas de las secuencias unidas se pueden deducir de la abundancia relativa de sus etiquetas de identificación.

Figura 1 Descripción general de MPRA. Una biblioteca de reportero MPRA construcciones se construye acoplando secuencias reguladoras putativas a sintéticogenes indicadores que consisten en un "inerte" ORF (como GFP o luciferasa), seguido de una identificación de marcadores de secuencias. La biblioteca es transfectada en masa en una población de células cultivadas y ARNm transcrito reportero se recupera posteriormente. Secuenciación de profundidad se utiliza para contar el número de ocurrencias de cada etiqueta entre los mRNAs reportero y los plásmidos transfectados. La proporción de mRNA cuenta sobre los recuentos de plásmido puede utilizarse para inferir la actividad de la secuencia reguladora correspondiente. Adaptado con permiso de Melnikov, et al ^2.

MPRA se puede adaptar a una amplia variedad de diseños experimentales, incluyendo 1) la mutagénesis integral de elementos reguladores de genes individuales, 2) la exploración de nuevos elementos reguladores a través de un locus de interés, 3) probar el efecto de la variación genética natural en un conjunto de putativo promotores, potenciadores o silenciadores, y 4) ingeniería semi-racional de los elementos reguladores sintéticos. Libraries de variantes de secuencia pueden generarse usando una variedad de métodos, incluyendo la síntesis de la biblioteca de oligonucleótidos (OLS) en microarrays programables ^2,3,6,7, conjunto de oligonucleótidos degenerados, ^1,4 ligadura ⁸ combinatoria y la fragmentación de ADN genómico ^5.

Este protocolo describe la construcción de una biblioteca de variantes de promotor usando OLS y los vectores de pMPRA1 y pMPRAdonor1 (Addgene IDs 49349 y 49352, respectivamente; http://www.addgene.org), la transfección transitoria de esta biblioteca en células de mamífero cultivadas y la posterior cuantificación de las actividades promotoras de secuenciación profunda de sus etiquetas asociadas (Tag-Seq). Las versiones anteriores de este protocolo se utilizaron en la investigación publicada en Melnikov et al. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) y en Kheradpour et al. Genome Research 23, 800-811 (2013).

Protocol

1. Secuencia Diseño y Síntesis

1. Comience MPRA con el diseño y la síntesis de secuencias a ensayar para la actividad reguladora. Para la compatibilidad con la serie de vectores pMPRA, diseñar cada secuencia utilizando la siguiente plantilla: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- etiqueta -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 ', donde var indica la secuencia a ensayar y la etiqueta indica una o más etiquetas de identificación.
2. Las dos regiones variables (var) y la etiqueta están separadas por un par de KpnI (GGTACC) y XbaI (TCTAGA) sitios de restricción para facilitar la ligadura direccional de un fragmento de gen reportero entre ellos. Además, dos sitios distintos SfiI (GGCCNNNNNGGCC) se añadirán por PCR para permitir la ligación direccional en la columna vertebral pMPRA. Las regiones variables no deben contener copias adicionales de cualquiera de estos sitios de restricción. Si es necesario, uno o más de estas enzimas de restricción se pueden sustituir, Siempre y cuando las sustituciones 1) permitir un corte eficaz cerca de los extremos de moléculas de ADN, y 2) no corte en otra parte de la secuencia del vector. Ver discusión para más detalles.
3. Obtener los cebadores necesarios listados en la Tabla 1 de un proveedor comercial.

MPRA_SfiI_F	GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG
MPRA_SfiI_R	GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC
TAGseq_P1	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
TAGseq_P2	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [índice] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG

Tabla 1. Primer secuencias. [Indice] denota una secuencia de índice de 6 a 8 nt utilizado para la secuenciación de multiplexado. Obtener al menos 8 cebadores TagSeq-P2 con diferentes índices. Todosde los cebadores debe ser purificado por HPLC o PAGE.

4. Bibliotecas de oligonucleótidos pueden obtenerse a partir de una instalación de proveedor o núcleo comercial, o se generan utilizando un microarray basado programable sintetizador de oligonucleótidos como se describe por el fabricante. Resuspender los productos MCO en 100 l de tampón TE 0,1.
5. Ejecute las bibliotecas de oligonucleótidos en un 10% TBE-Urea desnaturalización gel de poliacrilamida. Cargar aproximadamente 1 pmol por carril y tinción con colorante fluorescente sensible a ssDNA para evaluar su calidad (Figura 2A).
6. Si una banda discreta correspondiente a los oligonucleótidos de longitud completa se puede visualizar (Figura 2A, carriles 1 y 2), escindir el correspondiente trozo de gel de acrilamida y se eluye oligonucleótidos en 100 l TE 0,1 durante la noche a temperatura ambiente con agitación. De lo contrario, continúe con el OLS suspensión cruda.
7. Potenciar y colas SfiI a la biblioteca de oligonucleótidos utilizando emulsión PCR ⁹ sup>.
8. Establecer 50 l mezclas de reacción PCR como se describe en la Tabla 2. Luego combine con 300 l de aceite y surfactante mezcla desde el Micellula ADN Emulsión y kit de purificación y agitar durante 5 min a 4 ° C.

Reactivo	1x Volumen (l)
Herculase II Fusión ADN polimerasa	0,5
Reaction Buffer 5x Herculase II	10
dNTP (10 mM cada uno)	1.25
BSA (20 mg / ml)	1.25
MPRA_SfiI_F Primer (25 mM)	0.25
MPRA_SfiI_R Primer (25 mM)	0.25
Plantilla OLS (1-10 attomol)	varía
Agua libre de nucleasa	a 50

ve_content "> Cuadro 2 mezcla de reacción de PCR de emulsión (fase acuosa).

9. Utilizar la concentración que da el máximo rendimiento de los productos de amplificación sin la aparición de artefactos (véase la sección 1.12).
10. Prescindir de la emulsión resultante en tubos de PCR y realice 20 ciclos de PCR (2 min a 95 ° C, 20 x [20 segundos a 95 ° C, 20 segundos a 55 ° C, 30 segundos a 72 ° C], 3 min a 95 ° C).
11. Piscina y romper cada 350 l de reacción de PCR en emulsión mediante la adición de 1 ml de isobutanol y brevemente vórtex, y luego purificar el producto de amplificación usando una columna de purificación de ADN.
12. Ejecutar una alícuota en un gel de agarosa al 2% o 4% para verificar la amplificación libre de artefactos (Figura 2B).

Figura 2 Preparación de bibliotecas de síntesis de oligonucleótidos. A) B) los productos de amplificación por PCR abierto y emulsión de la misma corrida biblioteca de oligonucleótidos en un gel de agarosa. La amplificación por PCR de las bibliotecas de oligonucleótidos complejos con frecuencia crea productos quiméricos y otros artefactos que pueden aparecer como bandas superiores e inferiores. Emulsión PCR puede minimizar estos artefactos.

2. Construcción de la Biblioteca

1. Preparar un plásmido linealizado por digestión de columna vertebral pMPRA1 vector con SfiI a 50 ° C durante 2 horas, se ejecutan en un gel de agarosa al 1%, escindir la banda columna vertebral (en este caso, 2,5 kb) y purificar usando una columna de centrifugación purificación en gel.
2. Recopilaciónlos productos de la PCR de emulsión de la etapa 1.4 con SfiI a 50 ° C durante 2 horas y purifican utilizando columnas de purificación de ADN.
3. Para ligar la biblioteca promotor-tag en el esqueleto del vector linealizado, configurar las reacciones que contenían 100 ng del producto de PCR digerido, 50 ng de esqueleto del vector linealizado y ADN ligasa de T4. Incubar toda la noche a 16 ° C y luego se calienta a 65 ° C durante 20 min para inactivar la ligasa.
4. Transformar E. coli con la reacción de ligación. Para preservar la complejidad de la biblioteca, el objetivo de obtener al menos 10 veces más ufc que hay combinaciones de promotor-etiquetas distintas en la biblioteca diseñada.
5. Cuando el número total de etiquetas es de aproximadamente 100.000, el ufc objetivo típicamente se puede lograr mediante la realización de 6-8 transformaciones paralelas por biblioteca.
6. Para cada transformación, se combinan 50 l electrocompetentes E. células de E. coli con 2 l de mezcla de ligación en hielo. Transformar mediante electroporación, recuperar las células en 800 l SOCmedio por agitación a 37 ° C durante 1 h, y luego se combinan células de las transformaciones paralelas.
7. Para evaluar la eficiencia de transformación, placa diluciones seriadas de un alinquot de células recuperadas en placas de agar LB con 50 a 100 mg / ml de carbenicilina y se incuba durante la noche a 37 ° C. Estimar ufc total, (cfu observado) x (factor de dilución) x (V - V) / V, donde V es el volumen total de células recuperadas y V es el volumen de la alícuota tomada para las diluciones en serie.
8. Al mismo tiempo, utilizar el resto de las células recuperadas para inocular 200 ml de LB suplementado con 100 mg / ml de carbenicilina. Se cultivan las células a 37 ° C durante la noche en una incubadora con agitador y luego aislar el ADN plásmido siguiendo los procedimientos estándar.
9. Digerir una alícuota de la biblioteca de plásmido aislado con SfiI a 50 ° C durante 2 horas y correr en un gel de agarosa al 1% para confirmar la presencia de insertos.
10. Linealizar el plásmido biblioteca por cutting entre las variantes promotoras y etiquetas utilizando KpnI y XbaI. Para maximizar la eficiencia de la digestión, realizar digestiones de serie:
11. En primer lugar, digerir con KpnI a 37 ° C durante 1 hora y purificar usando perlas magnéticas. En segundo lugar, digerir con XbaI con la adición de 1 U de fosfatasa alcalina de camarón a 37 ° C durante 2 h, el calor inactiva a 65 ° C durante 5 min, y luego se purifica usando perlas magnéticas.
12. Ejecutar una alícuota en un gel de agarosa al 1% para verificar la linealización completa. Si plásmido sin cortar es visible, el fragmento linealizado se purificó en gel debe ser.
13. Para generar una biblioteca de MPRA adecuados para la transfección en células de mamífero, ligar un ORF con KpnI / XbaI extremos -Compatible en la biblioteca intermedia linealizado.
14. Para preparar un fragmento ORF luc2 compatible desde pMPRAdonor1, digerir este plásmido con KpnI y XbaI a 37 ° C durante 1 hora y se ejecutan en un gel de agarosa al 1%. Cortar el fragmento ORF (1,7 kb en este caso) y se purifican usando una columna de gel de purificación de giro.
15. Clonar el fragmento ORF en la biblioteca intermedio linealizado como se describe en los pasos 2.3 a 2.8.
16. Digerir una parte alícuota (correspondiente a 1-2 g) de la biblioteca MPRA con KpnI a 37 ° C durante 1 hora y correr en un gel de agarosa al 1%. Si la biblioteca digerido se ejecuta como una sola banda, pase a la sección 3 Si se observan bandas adicionales (por lo general corresponde a remanente de construcciones intermedias), la biblioteca puede ser purificado de la siguiente manera:
17. Digerir 3-5 g de la biblioteca contaminada con KpnI a 37 ° C durante 1 hora y correr en un gel de agarosa al 0,8% durante la noche a 4 ° C.
18. Escindir la banda biblioteca correcta, purificar el ADN usando una columna de centrifugación purificación en gel y llevar a cabo la auto-ligación utilizando alta concentración de ADN ligasa de T4 a 37 ° C durante 1 hr. A continuación, repita la transformación y la biblioteca definitiva de aislamiento de ADN como se describe en el paso 2.8.

3. Transfection, Perturbación, y Aislamiento de ARN

1. Para cada transfección independiente, la cultura el número requerido de células (como se determina por la complejidad de la biblioteca MPRA, ver Discusión) en un medio apropiado. Por ejemplo, cultivo de células HEK293T 17 / en DMEM suplementado con 10% de FBS y L-glutamina / penicilina / estreptomicina. Células de cultivo de al menos dos transfecciones independientes para cada biblioteca y condición experimental.
2. Transfectar las células cultivadas con plásmidos MPRA. El método y las condiciones de transfección debe ser optimizado para cada tipo de célula. Para cada muestra transfectadas, retener una parte alícuota (50-100 ng) de ADN plásmido como control emparejado.
3. Por ejemplo, transfectar 0,5 x 10 ⁷ HEK293T / 17 células cultivadas a ~ 50% de confluencia en una placa de cultivo de 10 cm con el plásmido de ADN 10 mg en 1 ml de Opti-MEM I medio de suero reducido utilizando 30 l Lipofectamine LTX y 10 l de reactivo Plus. Retire la mezcla de transfección después de 5 horas y permitir lalas células se recuperen durante 24-48 h.
4. Opcionalmente, realice cualquier perturbación necesaria para activar secuencias reguladoras al contexto o dependientes de señales en la biblioteca diseñada.
5. Recoger las células y aislar poli (A) + mRNA utilizando columnas estándar oligo (dT) celulosa o perlas usando las instrucciones de su fabricante.
6. Asegúrese de que la capacidad máxima de unión de las columnas o los granos supere el importe total de ARNm que se espera de las células recogidas. Por ejemplo, el rendimiento esperado de la sección 3.3 es de aproximadamente 0,5-2,5 mg ARNm.

4. Tag-Seq

1. Para eliminar el arrastre de ADN del vector de los lisados ​​de células transfectadas, tratar a cada muestra de ARNm 20 l con 1 l Turbo DNasa (2 U) y 2,3 l de tampón 10x Turbo DNasa a 37 ° C durante 1 hora, añadir 2,4 l Turbo DNasa inactivación reactivo en RT durante 5 min con mezcla, centrifugar a 10.000 g durante 90 seg, y luego transferir la solución a un tubo nuevo.
2. Compruebe pureza mediante la realización de PCR como se describe en la sección 4.6 de 60-100 ng de cada muestra de ARNm, y luego ejecutar los productos en un gel de agarosa. Si amplicones específicos son visibles (0,25 kb si usa pMPRA1 con luc2), la columna de purificar el mRNA tratado y luego repetir el tratamiento DNasa.
3. Para generar bibliotecas de secuenciación-Tag Seq, convertir reportero ARNm en ADNc y añadir adaptadores de secuenciación por PCR.
4. Configurar mezclas de cebadores ARNm / RT como se describe en la Tabla 3. Incubar a 65 ° C durante 5 min, luego colocar en hielo. En paralelo, configurar las reacciones de síntesis de ADNc como se describe en la Tabla 4.

Reactivo	1x Volumen (l)
muestra de ARNm (400-700 ng total)	8
Oligo-0DT (50 M)	1
dNTP (10 mM cada uno)	1

ove_content "> Cuadro 3 ARN mezcla de cebadores / transcripción inversa para la síntesis de ADNc.

Reactivo	1x Volumen (l)
10x superíndice III RT Buffer	2
MgCl2 (25 mM)	4
DTT (0,1 M)	2
RNaseOUT (40 U / l)	1
Superíndice III (200 U / l)	1

Tabla ADNc 4. mezcla de reacción de síntesis.

5. Combinan suavemente imprimación mRNA / RT mezcla con mezclas de síntesis de ADNc. Incubar a 50 ° C durante 50 min, 85 ° C durante 5 min y luego se coloca en hielo. Finalmente, se incuba con 2 U de ribonucleasa H a 37 ° C durante 20 min.
6. Configurar las reacciones de PCR como se describe en la Tabla 5 con 4-6 lcDNA mezcla de reacción o 50 ng de plásmido reportero como plantillas. A continuación, realizar la amplificación por PCR (95 ° C durante 2 min, 26 x [95 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 seg], 72 ° C durante 3 min).

Reactivo	1x Volumen (l)
2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix	25
TagSeq_P1 Primer (25 mM)	0,5
TagSeq_P2 Primer (25 mM)	0,5
Plantilla (ARNm, ADNc o ADN plásmido mix)	varía
Agua libre de nucleasa	a 50

Tabla 5. mezcla de reacción de PCR Tag-Seq.

7. Ejecutar los productos de PCR en un gel de agarosa al 2%, bandas especiales correspondientes a los amplicones biblioteca-Tag Sec (0,25 kb si se utilizapMPRA1 con luc2) y purificar estas utilizando columnas giratorias de purificación de gel.
8. Piscina, desnaturalizar y secuenciar los amplicones-Tag Sec purificados directamente con un instrumento de secuenciación de Illumina.
9. Filtro de baja calidad se lee mediante la eliminación de todo lo que a) contener una o más posiciones con una calidad Phred puntuación de menos de 30 dentro de la etiqueta secuenciado o b) que no coincide exactamente una etiqueta diseñada. Cuente el número de veces que cada etiqueta restante aparece en cada biblioteca. Normalizar la etiqueta cuenta con TPM (etiquetas por millón de etiquetas secuenciados) y luego calcular la relación de etiqueta cuenta derivados de ARNm más de etiqueta cuenta plásmido derivado para cada par de bibliotecas de secuenciación. Si varias etiquetas diferentes estaban vinculados a cada variante de secuencia, utilice sus ratios de la mediana para el análisis de aguas abajo.

Representative Results

MPRA facilita de alta resolución, la disección cuantitativa de las relaciones de secuencia de la actividad de elementos reguladores transcripcionales. Un experimento exitoso MPRA típicamente producirá mediciones altamente reproducibles para la mayoría de las secuencias en la biblioteca transfectadas (Figura 3A). Si se observa una mala reproducibilidad (Figura 3B), esto es indicativo de una concentración demasiado baja de mRNAs reportero en las muestras de ARN recuperado, ya sea debido a 1) una baja actividad absoluta entre las secuencias ensayadas, o 2) la baja eficiencia de transfección.

La figura 4 muestra un representante "información de la huella" ^1,2 generada por el ensayo de ~ 37.000 variantes aleatorias de una secuencia de 145 pb aguas arriba del gen IFNB humano en células HEK293 con o sin exposición al virus Sendai. El promotor TATA-box y conocido promotor de proximal ¹⁰ pueden ser claramente identificados como regi rico en informacióncomplementos de una manera dependiente de virus.

Figura 3.-Tag Sec reproducibilidad diagramas de dispersión que muestran ejemplos de datos de la etiqueta de la Seq dos transfecciones independientes replicadas con alta (A) y baja (B) la reproducibilidad.. Este último gráfico muestra muchas etiquetas de valores atípicos con recuentos de alta mRNA en sólo una de las dos repeticiones. Tales artefactos típicamente indican que las concentraciones de ARNm reportero eran demasiado bajos para la amplificación de PCR cuantitativa, ya sea debido a las actividades absolutas bajas entre los constructos informadores, o bajas eficiencias de transfección.

Figura 4. Información footprinting del sitio de inicio de transcripción IFNB humano y potenciador proximal. IFNB humano se analizaron utilizando MPRA en células HEK293 con (A) y sin (B) la exposición al virus Sendai. Las barras azules muestran la información mutua entre la salida reportero y el nucleótido en cada posición. El potenciador proximal y la caja TATA se destacan como las regiones de alto contenido de información a la infección viral.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide library synthesis	Agilent, CustomArray, or other OLS vendors	custom	If using OLS construction method
pMPRA1	Addgene	49349	MPRA plasmid backbone
pMPRAdonor1	Addgene	49352	luc2 ORF donor plasmid
TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)	Generic	n/a	OLS buffer
Novex TBE-Urea Gels, 10%	Life Technologies	EC6875BOX	PAGE purification of OLS products
Novex TBA-Urea Sample Buffer	Life Technologies	LC6876	PAGE purification of OLS products
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494	PAGE purification of OLS products
Micellula DNA Emulsion & Purification Kit	EURx/CHIMERx	3600-01	Library amplification by emulsion PCR
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600675	Polymerase for emulsion PCR
SfiI	New England Biolabs	R0123S	Library cloning with pMPRA vectors
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S	Library cloning with pMPRA vectors
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Library cloning with pMPRA vectors
T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)	New England Biolabs	M0202T	Library cloning with pMPRA vectors
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Life Technologies	C4040-50	Library cloning with pMPRA vectors
LB agar and liquid media with carbenicllin	Generic	n/a	Growth media for cloning
E-Gel EX Gels 1%	Life Technologies	G4010-01	Library verification and purification
E-Gel EX Gels, 2%	Life Technologies	G4010-02	Library verification and purification
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	Library and backbone purification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Library DNA isolation
Cell culture media	n/a	n/a	Experiment-specific
Transfection reagents	n/a	n/a	Experiment-specific
MicroPoly(A)Purist Kit	Life Technologies	AM1919	mRNA isolation
TURBO DNA-free Kit	Life Technologies	AM1907	Plasmid DNA removal
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Life Technologies	18080-051	cDNA synthesis
PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix	Agilent	600850	Polymerase for Tag-Seq PCR
Primers (see text)	IDT	custom	PAGE purify Tag-Seq primers