Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes

doi: 10.3791/51720 Published: October 23, 2014

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליך להפקת וטיהור מסוג בר וגרסאות מוטציה של מתחם שיפוץ הכרומטין INO80 האנושי. Epitope מתויג גרסאות של יחידות משנה INO80 באות לידי ביטוי ביציבות בתאי HEK293, ומתחמים שלמים ומתחמים חסרי מערכות ספציפיות של יחידות משנה הם מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה immunoaffinity.

Abstract

מתחמי שיפוץ הכרומטין INO80 להסדיר דינמיקת הנוקלאוזום ונגישות DNA על ידי מזרזות שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP. מתחמי INO80 אדם מורכבים מ14 יחידות משנה חלבון כולל Ino80, ATPase כמו SNF2, המשמש גם כמקטע קטליטי והפיגום להרכבה של המכלולים. פונקציות של יחידות משנה האחרות והמנגנונים שבאמצעותם הם תורמים לפעילות שיפוץ הכרומטין של מתחם INO80 להישאר הבינו היטב, בין שאר בשל האתגר של יצירת מכלולי INO80 בתאים אנושיים או מערכות ביטוי Heterologous. פרוטוקול יופיטר זה מתאר הליך המאפשר טיהור של subcomplexes שיפוץ הכרומטין INO80 האנושי שחסרי מקטע או קבוצת משנה של יחידות משנה. epitope דגל N-סופני מתויג Ino80 cDNA הם הציגו ביציבות לכליה עוברית אנושית (HEK) 293 שורות תאים באמצעות רקומבינציה בתיווך FLP. במקרה שקבוצת משנה של יחידות משנה של מתחם INO80 הוא bדואר שנמחק, אחד מבטא חלבוני Ino80 במקום מוטציה שחסר את הפלטפורמה הנדרשת להרכבה של תת יחידות אלה. באירוע למקטע בודד הוא להיות מדולדל, siRNAs אחד transfects מיקוד למקטע זה לשורת תאי HEK 293 יציבות להביע FLAG tagged Ino80 ATPase. תמציות גרעיניות מוכנות, וimmunoprecipitation FLAG מתבצעת על מנת להעשיר את השברים חלבון המכילים נגזרי Ino80. הקומפוזיציות של subcomplexes INO80 מטוהר לאחר מכן ניתן לנתח באמצעות שיטות כגון immunoblotting, צביעת כסף, וספקטרומטריית מסה. Subcomplexes INO80 וINO80 שנוצר על פי פרוטוקול זה ניתן לנתח נוסף באמצעות מבחני ביוכימיים שונים, אשר מתוארים בפרוטוקול יופיטר הנלווה. השיטות שתוארו כאן יכולות להיות מותאמות ללימודים של התכונות המבניות ותפקודיות של כל שיפוץ הכרומטין רב למקטע של יונקים ומתחמי שינוי.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מתחמי שיפוץ הכרומטין משפחת SNF2 אבולוציונית שמורים הם רגולטורים מרכזיים של ארגון הכרומטין ונגישות DNA 1. מתחמי שיפוץ אלה תמיד כוללים מקטע מרכזי כמו SNF2-ATPase, אשר, במקרים מסוימים, מרכיב בחלבוני אבזר שונים ויוצר מכלולי מקרו מולקולרי רב למקטע. כדי לחקור את הפרטים המולקולריים של תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATP, זה חשוב להבין את תרומתם של תת קבוצות מסוימות של יחידות משנה ו / או מבני תחום לפעילות של מתחמים. ניתוח מסוג זה דורש את היכולת ליצור מתחמי מוטציה נקיים במיוחד שחסרות יחידות משנה חלבון מסוימות או מבני תחום.

מחקרי מבנה פונקציה קודמים של מתחמי שיפוץ הכרומטין תלוי ATP התמקדו באופן נרחב במערכת שמרי המודל בשל manipulability מעולה של הגנום השמרים (ראה, למשל, שופטים 1-4). בהתחשב בשימורהרכב למקטע ופונקציונליות בין מתחמי שיפוץ orthologous, מחקרים של המבנה והתפקוד של קומפלקסי שיפוץ שמרים סיפקו תובנות חשובות עמיתיהם באאוקריוטים גבוהים יותר. עם זאת, מינים ספציפיים ניכרים הבדלים בין מתחמי שיפוץ קיימים, כתוצאה מרווח או הפסד של מינים ספציפיים יחידות משנה, הרווח או הפסד של תחומים מינים ספציפיים של יחידות משנה נשמרו, והשתנות רצף בתוך תחומים משומרים של יחידות משנה נשמרת. יכולים באופן עקרוני להיות מונעים את ההבדלים כאמור על ידי הצורך בתאים האיקריוטים גבוהים יותר להסתגל לסביבות מולקולריות ותאיות חדשות. לפיכך, ההבנה כיצד יחידות משנה של מתחמי שיפוץ אוקריוטים גבוהים לתרום לתהליך שיפוץ הנוקלאוזום היא בעל ערך, כי זה לא רק גם שופך אור על מנגנונים בסיסיים של תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATP, אבל יכול לספק תובנה חשובה המנגנונים שבאמצעותם מבנה הכרומטין וביטוי גנים בפואאוקריוטים מוסדרים.

עד כה, יש כבר מוגבל רק מחקרים מבניים ותפקודיים של מתחמי שיפוץ הכרומטין יונקים רב למקטע, נובע בחלקו בקשיים בהשגת מתחמים מוגדרים ביוכימית הכרומטין שיפוץ וsubcomplexes. באופן חלקי יש לנו לעקוף את הקשיים הללו לנהלים שיפורטו להלן, שבו לטיהור immunoaffinity משמשת להכנת subcomplexes INO80 או INO80 שלם מהתאים אנושיים ביציבות להביע epitope דגל N-סופני מתויג סוג בר או גרסאות מוטציה של Ino80 5-7 (איור 1) . כדי להשיג מתחמי INO80 שלמים מהתאים אנושיים, רקומבינציה בתיווך FLP משמשת ליצירת שורות תאי HEK293 מהונדסים ביציבות להביע cDNAs מתויגים epitope דגל קידוד יחידות משנה של המתחם INO80 8-10. בגלל ביטוי יתר של יחידות משנה INO80 יכול להיות רעיל במידה מסוימת, יש צורך לבודד ולשמור על שורות תאים משובטים תחת שיתוף סלקטיביnditions כדי להבטיח ביטוי transgene יציב במהלך הקטעים רבים הנדרשים להרחבה של תרביות תאים בקנה מידה גדולה. כדי להשיג subcomplexes INO80 קטן יותר המכיל רק קבוצת משנה של יחידות משנה, השתמשנו בהצלחה שתי גישות (איור 2 א, ב '). בחלק הראשון, אנו יוצרים שורות תאי HEK293 FLP-In ביציבות להביע גרסאות מוטציה של Ino80 שחסרת ​​תחומים הנדרשים לאינטראקציה עם יחידות משנה ספציפיות 5. לחלופין, מציאה בתיווך siRNA משמשת לרוקן למקטע הרצוי מהתאים לבטא מקטע מתאים מתויג דגל INO80 (נתונים שלא פורסמו). לבסוף, כדי לטהר את מתחמי INO80 האנושיים, כרומטוגרפיה המבוססת agarose FLAG 11 משמשת להעשרת חלק המכיל INO80 מתמציות גרעיניות, ובכך מפחיתה ביעילות את נוכחותם של חלבונים מזהמים cytosolic בשבריר הסופי המכיל subcomplexes INO80 או INO80 המטוהר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

.1 ייצור ותרבות של שורות תאי יציבות HEK293 הבעה באורך מלא או גרסות משתנות של הדגל epitope מתויג Ino80 או יחידות משנה INO80 מורכבות אחרות

  1. שיבוט cDNA קידוד באורך מלא או Ino80 ATPase אנושי מוטציה או מקטע INO80 אחר לpcDNA5 / FRT וקטור ביטוי של היונקים עם, תג epitope דגל מסוף N במסגרת.
  2. לאשר את הרצף של cDNAs הוכנסו על ידי רצפי DNA לפני שתמשיך.
  3. כדי לבצע transfection, לגדול FLP-In HEK293 תאים בצלחות תרבית רקמת 10 סנטימטר במצע המכיל DMEM (הנשר בינוני השתנה Dulbecco), 5% גלוטמין, ו10% FBS (בסרום שור עוברי).
  4. כאשר תאים מגיעים confluency ~ 70%, להוסיף לכל מנה בתרבית רקמת תערובת של 40 μl של מגיב transfection FuGENE6, 0.5 מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי pcDNA5 / FRT המתאים, ו9.5 מיקרוגרם של pOG44, אשר מקודד recombinase FLP, בהיקף כולל של 800 μl.
  5. 48 שעות מאוחר יותר, trypsinize והיםPlit תאים ביחס של 01:30 ל10 מנות סנטימטר, ולגדל אותם בDMEM עם גלוטמין 5%, 10% FBS, ו100 מיקרוגרם / hygromycin B מ"ל ל3 - 4 שבועות. לשנות את התרבות בינונית בכל פעם שהוא מתחיל להפוך צהוב (בדרך כלל כל 3 - 5 ימים).
  6. לזהות שיבוטים חיוביים המבטאים את הרמה הגבוהה ביותר של החלבון מתויג דגל, בחר מושבות B עמיד hygromycin האישי ולהעבירם לטוב אחד של צלחת 24 גם.
    1. ברגע שהתאים מגיעים confluency 80%, תאי קציר מכל טוב ב~ 1 מ"ל PBS וגלול על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות.
    2. לאחר הסרת supernatant, resuspend התא גלולה ב60 μl של חיץ מדגם SDS-PAGE.
    3. מחצית נושא של התא גלולה resuspended לדף SDS ומערבי סופג לפקח ביטוי של FLAG tagged חלבון פיתיון; להציל את החצי השני לעתיד ניתוחים.
  7. אם לא חלבון Ino80 אדם מתויג דגל מזוהה בlysates תא, להרחיב את popu התאים המשובט הראשוןויסות נוסף על ידי תאי ציפוי מבארות בודדות של צלחת 24 גם לצלחות תרבית רקמת 15 סנטימטר.
    1. למסוק תאים מ15 מנות סנטימטר, resuspend ליד תאים ומחוברות בקרח הקר PBS והעברת צינור חרוטי 50 מ"ל.
    2. להביא לנפח סופי של 50 מ"ל על ידי הוספת PBS נוסף.
    3. תאים גלולה ב 1,000 XG למשך 5 דקות, ולהסיר ככל האפשר מsupernatant.
    4. Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של חיץ Lys450 (20 pH HEPES מ"מ-NaOH 7.9, 450 mM NaCl, 0.5% TritonX-100, 10 מ"מ KCl, 4 מ"מ MgCl 2, 0.2 mM EDTA, גליצרול 10%, 1 מ"מ DTT, 200 PMSF מיקרומטר, ו1: 1,000 קוקטייל מעכבי פרוטאז).
      הערה: כאן ובמקומות אחרים, תמיד להוסיף DTT, PMSF, ומעכבי פרוטאז קוקטייל למאגרים מייד לפני תחילת ניסוי.
    5. חיסוני משקע הדגל מתויג חלבונים מlysate התא השלם וכתוצאה מכך באמצעות 20 μl של agarose ג'ל אנטי FLAG, ולנתח את eluates FLAG על ידי מערבי סופג. [לפרטים של immunהליך oprecipitation, ראה שלב 5]
  8. הכן מניות קפוא של שורות תאים משובטים רצויים 12 ולאחסן אותם בחנקן נוזלי עד לשימוש.

2 קווים סלולריים HEK293 גידול בבקבוקי רולר

להכנה בקנה מידה גדולה של מתחמי INO80, תאי תרבות ב10 - 20 בקבוקים גליליים; תשואה אופיינית מכל בקבוק רולר היא ~ 1 מ"ל של תאים ארוזים.

  1. לכל בקבוק רולר, להוסיף 200 מ"ל DMEM, 5% גלוטמין, ו10% עגל בסרום, ללא B. hygromycin
  2. העבר את כל התאים מצלחת 15 סנטימטר כמעט ומחוברות אחת לכל בקבוק רולר
  3. בקבוקי רולר מקום לחממת בקבוק רולר 37 מעלות צלזיוס ולסובב ב0.2 סל"ד.
  4. , ברגע שתאים מגיעים confluency ~ 70% לשפוך ותשאיר את המדיום.
  5. להוסיף ~ PBS 50 מ"ל של קרח קר לכל בקבוק. מחזיק בקבוקים אופקיים, בעדינות מערבולת כדי לשחרר את monolayer התא.
  6. להעביר את תאי resuspended 250 plast מ"לבקבוקי ic חרוטי ומניחים על קרח.
  7. יש לשטוף את בקבוקי רולר עם PBS נוסף, העברתו ברצף מבקבוק לבקבוק. כאשר פתרון שטיפה כבר לא ברור (בדרך כלל לאחר שנהג לשטוף כ -5 בקבוקים), להוסיף אותו להשעית התא.
  8. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה ב XG 400 עבור 10 דקות.
  9. בעדינות resuspend תאי PBS, לשלב אותם לתוך בקבוק חרוטי 250 מ"ל אחד, ולשמור על קרח עד עיבוד נוסף.

.3 מציאה בתיווך siRNA של יחידות משנה INO80 בתאים המבטאים נוסף מתויג דגל INO80 מקטע

כדי להשיג subcomplexes INO80 חסר מקטע בודד, השימוש FLAG-immunopurification לטהר מתחמי INO80 מתאי siRNA שטופלו או תאים ביציבות להביע shRNA. SiRNA "הפוך" פרוטוקול (קטן מפריע RNA) transfection מתואר כאן הוא מותאם לHEK293 תאים גדלו ב15 מנות סנטימטר. הפרוטוקול הוא למנה 15 סנטימטר אחד של תאים וshoULD לשנותם עד בהתאם בהתאם למספר התאים הדרושים. כדי להכין כמויות יוכימית שימושיות של מורכב INO80 מהתאים שטופל siRNA, יש בהיקף של עד תרבויות גדלו ב40 15 מנות סנטימטר; אלה יניבו כ 2 - 4 מ"ל של תא גלולה ארוז.

  1. לגדל תאי HEK293 ביציבות להביע למקטע הרצוי של מתחם INO80 לconfluency הקרובה ב15 מנות סנטימטר.
  2. הוספת נפח של של חיץ siRNA resuspension (20 מ"מ KCl, 6 מ"מ HEPES-pH 7.5, ו0.2 מ"מ MgCl 2) מספיק כדי להכין את פתרון מניות 50 מיקרומטר של siRNA לצינור המכיל siRNA lyophilized. פיפטה הפתרון למעלה ולמטה כמה פעמים ודגירה על nutator ל30 דקות ב RT כדי להבטיח siRNA נמס לגמרי.
  3. הכן קוקטייל transfection המכיל siRNAs ומגיב transfection. מערבבים 10 μl של פתרון מניות 50 מיקרומטר siRNA עם 32 μl Lipofectamine RNAiMAX ולהוסיף אותו ל4 מ"ל של Opti-MEM מופחת סרום בינוני עם ערבוב עדין מאוד; אלנמוכים כל ריאגנטים לאזן לRT לפני השימוש.
  4. דגירה את התערובת על RT למשך 30 דקות.
  5. הכן תאי FLP-In HEK293 ביציבות להביע מקטע INO80 הרצוי עבור transfection.
    1. במהלך הדגירה של שלב 3.4, לשטוף תאים ב15 מנות סנטימטר פעם אחת עם RT PBS.
    2. לאחר הסרת PBS, טיפול בתאים עם טריפסין 1 מ"ל רק עד שהם מתחילים להרים את הצלחת.
    3. מייד להוסיף 10 מ"ל של מדיום מלא (+ 5% FBS + 10% גלוטמין DMEM) לtrypsinized תאים ומערבבים בעדינות. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ב RT.
    4. Resuspend התא גלולה ב ~ בינוני מלא 4 מ"ל, ולספור את resuspension התא באמצעות haemocytometer.
    5. לדלל תאים עם מדיום מלא לריכוז של ~ 5.4 x 10 6 מ"ל /.
  6. לכל מנה 15 סנטימטר, להוסיף 15 מ"ל מדיום תרבות השלם ואחריו קוקטייל transfection 4 מ"ל. מערבולת בעדינות על מנת להבטיח את הקוקטייל הבינוני וtransfection הם Thoroughly מעורב. לבסוף, להוסיף אחד מ"ל של השעיה תא ושוב לערבל בעדינות לפיזור תאים באופן אחיד.
  7. לאחר 60 שעות של תרבות ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור, להסיר בעדינות בינונית, תאים גלולים בקרח הקר PBS, ופנה מייד להכנת תמציות גרעיניות.

.4 הכנת תמציות גרעיניות

הליך זה שונה מהפרוטוקול של 13 Dignam וניתן לשנותם למעלה או למטה, תלוי בגודל של החל כדורי תא. בדרך כלל, 1 מ"ל של תשואות תא גלולה ארז 1 מ"ל של תמצית גרעינית סופית. כל המאגרים צריכים להיות קר כקרח, ויש לבצעו בכל הצעדים בחדר קר או בקרח, אם חדר קר מתאים אינו זמין.

  1. בידוד של גרעינים:
    1. בעדינות להעביר תאים מתאימים בגודל (15 או 50 מ"ל) סיים את לימודיו צינור וספין חרוטי XG ב 1000 10 דקות ב 4 ° C.
    2. הסר את supernatant, ולמדוד את הנפח של pel התא ארוזבואו. 1 מ"ל של תאים ארוזים מתאים ל~ 3 x 10 8 HEK293 תאים.
    3. הוסף 5 כרכים גדושים תא של הצפת (10 HEPES מ"מ, pH 7.9, 1.5 מ"מ MgCl 2, 10 מ"מ KCl וטרי הוסיף 1 מ"מ DTT, 200 PMSF מיקרומטר, ו1: 1,000 קוקטייל מעכבי פרוטאז). Resuspend התא גלולה ידי pipetting העדין.
    4. לדגור על קרח במשך בדיוק 10 דקות.
    5. גלולה התאים XG ב 1000 10 דקות ב 4 ° C, ולהסיר את supernatant.
    6. גודלו של התא גלולה צריך להגדיל עד פי 2 במהלך הדגירה בא המאגר
    7. Resuspend התאים בשני כרכי תא צפופים של חיץ, ולהעביר את ההשעיה התא לhomogenizer רקמות Dounce בגודל מתאימה. אם מתחיל עם פחות מ 2 מ"ל של תאים ארוזים, להשתמש homogenizer 7 מ"ל; ל2 - תאים ארוזים 4 מ"ל, להשתמש homogenizer 15 מ"ל; ול10 או יותר מ"ל של תאים ארוזים, להשתמש homogenizer 40 מ"ל.
    8. Homogenize ההשעיה התא עם העלי הזכוכית הרופף של האו"ם homogenizer Douncetil 90% מהתאים להכתים חיובי עם 1% trypan כחולים.
    9. להעביר את ההשעיה לצינור 45 מ"ל במהירות גבוהה צנטריפוגות ספין על 25,000 XG ל20 דקות ב 4 ° C בהרוטור JA-17 או דומה (ראה טבלה של חומרים / ציוד).
    10. מהגלולה הגרעינית, להסיר את supernatant, אשר מכיל חלבונים או חלבונים שלדלוף החוצה של הגרעין במהלך חלוקה cytosolic.
  2. חילוץ גרעינים עם מלח:
    1. הוסף חוצץ C (20mm HEPES, pH 7.9, גליצרול 25%, 1.5 מ"מ MgCl 2, 0.2 mM EDTA, והוסיף טרי 1 מ"מ DTT, 200 PMSF מיקרומטר, ו1: 1,000 מעכבי פרוטאז קוקטייל) לגלולה הגרעינית; להשתמש 2.5 מ"ל הצפת C לכל 3 מ"ל של החל ארז נפח תא (~ 1 x 10 9 תאים).
    2. באמצעות מוט זכוכית או פיפטה, לעקור את גלולה הגרעינית מהקיר של הצינור ולהעביר את התערובת כולה לhomogenizer Dounce בגודל מתאים.
    3. Resuspend הגרעינים על ידי שמאחד התערובת דואר עם שתי משיכות של העלי LOOSE.
    4. העברת החלק הגרעיני resuspended לתוך כוס מקוררת. בחר כוס כך שההשעיה ימלא את הכוס לפחות 0.5 סנטימטר עמוק.
    5. כדי לחלץ חלבונים גרעיניים מהכרומטין או מבנים בלתי מסיסים אחרים, להגדיל בהדרגה את ריכוז מלח של ההשעיה ל0.42 M NaCl על ידי תוספת dropwise של 5 M NaCl תוך ערבוב ההשעיה עם מוט פיפטה או זכוכית על קרח בעדינות; פעם אחת כל 5 M NaCl נוסף, הפתרון צריך להיות צמיג מאוד או כמו ג'ל. חשב את הנפח של 5 M NaCl צריך להביא הפתרון לריכוז סופי של 0.42 M NaCl על פי הנוסחא הבאה:
      משוואת 1
    6. להעביר בזהירות את ההשעיה צמיגה ל10 מ"ל צינורות פוליקרבונט ל70.1 הרוטור Ti סוג (או שווי ערך) בקבוקי פוליקרבונט או 70 מ"ל לo Ti סוג 45r הרוטור דומה (ראה טבלה של חומרים / ציוד). לאטום היטב עם parafilm אם באמצעות 10 צינורות מ"ל או עם הרכבה כובע אם באמצעות 70 מ"ל בקבוקים.
    7. לאט לאט רוק הצינורות האטומים על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות nutator.
    8. ספין הדגימות בסוג 45 Ti או 70.1 הרוטור Ti ל30 דקות ב 120,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
    9. העבר את supernatant לצינור פלסטיק בודד או בקבוק. supernatant זה התמצית הגרעינית, והגלולה מכילה הכרומטין ופסולת גרעינית אחרת.
    10. מחלקים את התמצית הגרעינית לaliquots בגודל נוח, להקפיא אותו בחנקן נוזלי, ולאחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס.

.5 טיהור Immunoaffinity של INO80 האדם או INO80 Subcomplexes

  1. להפשיר תמצית גרעינית קפואה, צינורות מקום המכילים את התמצית על צינורות benchtop או גלגול בין ידיים עד שהחומר הקפוא הופך סלארי. לאחר מכן למקם את הצינורות על קרח או בחדר הקר עד התמצית היא לגמרי לאגמגמתי.
  2. העבר את התמצית מופשרת גרעינית לצינורות ultracentrifuge פוליקרבונט 10 מ"ל, והספין ב100,000 XG עבור 20 דקות ב 4 ° C בהרוטור Ti סוג 70.1 או שווה ערך כדי להסיר כל משקע שאולי נוצר במהלך מחזור ההפשרה הקפאה.
  3. מעבירים את supernatant לצינור חרוטי 15 מ"ל. להוסיף קוקטייל DTT, PMSF, ומעכבי פרוטאז טרי לריכוזים סופיים של 1 מ"מ DTT, 200 PMSF מיקרומטר, ו1: קוקטייל 1,000 מעכבי פרוטאז.
  4. כדי להכין agarose אנטי FLAG לimmunopurification, להעביר 200 μl של סלארי 50% מחרוזי agarose אנטי FLAG לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל באמצעות P200 או פיפטה הדומה עם קצה שממנו הסוף נותק עם אזמל נקי או סכין גילוח.
  5. גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה בmicrocentrifuge המעבדתיים ב8,000 XG למשך 30 שניות. הסר את supernatant, ולשטוף את החרוזים על ידי resuspending את החרוזים 1 מ"ל של חיץ Lys450, וגלולת חרוזים ב8,000 XG למשך 30 שניות. שטוף את bEADS עוד פעמיים.
  6. Resuspend חרוזים שטפו אנטי FLAG agarose בכ -100 μl של התמצית הגרעינית באמצעות P200 או פיפטה נפח מתכווננת הדומה עם קצה שממנו הסוף נותק עם אזמל נקי או סכין גילוח ו, תוך שימוש באותה העצה, העברה חרוזים resuspended לצינור חרוטי 15 מ"ל מכיל התמצית. חזור כמה פעמים עד שכל חרוזים הועברו לצינור 15 מ"ל.
  7. דגירה את תערובת תמצית / חרוז ל4 שעות ב 4 ° C עם סיבוב איטי על הכתף מעבדה. אופציונאלי: כלול Benzonase בריכוז של 25 מ"ל / יחידות כדי להסיר את זיהום DNA.
  8. לאסוף את agarose FLAG על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ב 4 ° C..
  9. Resuspend ב10 מ"ל Lys450 לשטוף, דגירה 5 דקות ב 4 ° C עם הנדנדה עדינה על nutator. גלולה חרוזים ב1,000 XG למשך 5 דקות ב 4 ° C..
  10. Resuspend ב100 - של Lys450 וחרוזים העברה 150 μl לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. Continue לשטוף את צינור חרוטי 15 מ"ל עם 100 - של Lys450 150 μl עד שכל חרוזים הועברו לצינור microcentrifuge.
  11. ספין למטה חרוזים ב8,000 XG למשך 30 שניות על 4 מעלות צלזיוס בmicrocentrifuge. לשטוף שלוש פעמים יותר עם ​​1 מ"ל Lys450 ופעם אחת עם חיץ EB100 1ml (10 HEPES מ"מ pH 7.9, גליצרול 10%, 100 mM NaCl, 1.5 מ"מ MgCl 2, 0.05% TritonX-100, והוסיפו טרי 1 מ"מ DTT, PMSF 200 מיקרומטר , ו1: 1,000 קוקטייל מעכבי פרוטאז).
  12. לelute חלבונים קשורים, להוסיף למאגר EB100 200 μl מכיל 0.25 מ"ג / מ"ל ​​1x פפטיד FLAG. דגירה 30 דקות ב 4 ° C כל על nutator.
  13. גלולה חרוזים ב8,000 XG למשך 30 שניות על 4 מעלות צלזיוס בmicrocentrifuge. מעבירים את supernatant, המכיל קומפלקס INO80 eluted, לצינור microcentrifuge טרי.
  14. חזור על elution ארבע פעמים יותר, וברכה כל supernatants לתוך צינור אחד.
  15. כדי להסיר כל חרוזים FLAG-agarose השיורי משבריר חלבון eluted,להעביר את eluate באמצעות טור ספין ריק.
  16. לרכז את חלק חלבון eluted ~ פי 10 באמצעות מכשיר אולטרה צנטריפוגלי מסנן (50,000 הפסקת משקל מולקולרי).
  17. כדי להסיר את הפפטיד הדגל, לעבור ברצף שבריר חלבון המרוכז באמצעות שתי עמודות desalting.
  18. מחלקים את חלק החלבון המטוהר, desalted ל20 aliquots μl, הוקפא בחנקן נוזלי, ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
  19. לנתח את ההרכב למקטע של INO80 או subcomplexes INO80 על ג'לים מוכתם כסף או על ידי מערבי סופג, ולהעריך הריכוזים שלהם על ידי מערבי סופג חצי כמותית באמצעות הכנות של יחידות משנה INO80 רקומביננטי של ריכוז ידוע כסטנדרטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 1 מציג תרשים זרימה המסכם את הנהלים המשמשים לייצור, לטהר, ולאפיין מתחמי הכרומטין INO80 תלוי ATP אנושיים שיפוץ.

כפי שמודגם באיורים 2 ו -3, נהלים אלה מאפשרים את הדור של שני subcomplexes INO80 הסוג וINO80 הפראי שאין תת יחידות שונות, ובכך מאפשרים ניתוחים ביוכימיים הבאים של התרומה של יחידות משנה חסרות אלה לפעילות האנזימטית של INO80. איור 2 מתאר שתי אסטרטגיות שיש לנו משמש להגדרת הארכיטקטורה של מתחם INO80 וליצור subcomplexes INO80. בחלק הראשון, שמוצג באיור 2 א, הם מטוהרים מתחמי INO80 שלמים באמצעות גרסאות מתויג דגל של יחידות משנה פראיות סוג (Ies2 או INO80E). יכול להיות מטוהר Subcomplexes דרך גרסאות מתויג epitope של חלבוני Ino80 מוטציה שאין לי תחומים בודדים שבו קבוצות שונות של יחידות משנה עאסםble. כפי שניתן לראות באיור 3 א, טוהר מתחמים וכתוצאה מכך נבחנים באמצעות כסף מוכתם ג'ל SDS-polyacrylamide, ואילו הרכב של מתחמים נבחנים באמצעות מערבי סופג עם נוגדנים נגד תת יחידות INO80 שונות (איור 3 ב) או על ידי ספקטרומטריית מסה (מידע לא מוצג). שימוש בגישה זו, מצאנו כי תת יחידות מוצגות באדום באיור 2 א אבדו על מחיקה של Ino80 NTD (תחום N-מסוף); תת יחידות מוצגות בכחול אבדו על מחיקה של Ino80 HSA (helicase SANT Associated) תחום; ושתחום SNF2 ATPase, מורכב מאזורי SNF2N וHelicC (סגולים) מופרדים על ידי אזור החדרה ארוכה (לבן), היה הכרחי ומספיק לכריכה ליחידות משנה שמוצגת בסגול. לפיכך, subcomplexes INO80 (INO80ΔN.com או INO80ΔNΔHSA.com) שחסרים גם יכולה להיות מטוהרת יחידות משנה שמוצגת באדום או יחידות משנה שמוצגת באדום וכחול באמצעות FLAG-Ino80ΔN או FLAG-INO80ΔNΔHS, בהתאמה 5.

אפשר גם ליצור subcomplexes ידי דלדול יחידות משנה נפרדת מהתאים לבטא מקטע מתאים מתויג דגל INO80 (תוצאות לא פורסמו). בדוגמא הראשונה שמוצגת באיור 2, מציאה בתיווך siRNA של X למקטע מכלה רק X ממתחם INO80, המצביעה על X אינו נדרש להרכבה של כל תת יחידות אחרות לINO80. בדוגמאות השניה ושלישית, מציאה siRNA של או Y או Z מובילה לשיתוף דלדול של שני Y ויחידות משנת Z, המצביע על Y וZ להרכיב לתוך מתחם INO80 באופן תלות הדדית.

איור 1
. איור 1 תרשים זרימה המתאר את הנהלים המשמשים לייצור, לטהר ולאפיין מתחמי שיפוץ הכרומטין INO80 תלוי ATP אנושיים F, N-מסוף תג epitope הדגל במסגרת; GOI, Gene-of-בהתעניינות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
תרשים איור 2 מראה שתי אסטרטגיות המשמשות לייצור subcomplexes INO80 המכיל קבוצת משנה של יחידות משנה. () Ino80 ATPase מכיל אזורים המתפקדים פיגומים מודולרית שכבו יחידות משנה INO80 האחרות להרכיב. (ב ') בתיווך siRNA מציאה יכול לשמש כדי לרוקן למקטע הרצוי (X או Y או Z) מהתאים לבטא FLAG- מתאים מקטע INO80 מתויג (למשל, FLAG-Ino80ΔN). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 איור ניתוח .3 של הרכב מתחמי INO80 immunopurified וsubcomplexes. () מתחמי INO80 או subcomplexes היו מטוהרים מן התאים ביציבות להביע החלבונים מתויג דגל המצוין, נתון לג'ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide, ומדמיינים ידי צביעת כסף. המדגם בימני ביותר הנתיב הוכן מתאי הורים 293 שלא יביעו חלבון מתויג דגל; חלבונים המופיעים בנתיב שליטה זו הם מזהמים הקושרים את הלא במיוחד כדי FLAG-agarose. תוויות בצד השמאל מצביעות על הלהקות המתאימות לכמה יחידות משנה INO80, ואלה מהימין mobilities של סמני משקל מולקולריים. העמדה של הסוג בר Ino80 מצויינים על ידי המלבן השחור, ועמדות של מוטציות Ino80 מסומנות על ידי חוגים פתוחים. הנתיבים מופרדים על ידי הקו השחור הם מג'לי נפרד. מתחמי INO80 (B) וsubcomplexes נותחו על ידי מערבי סופגבאמצעות נוגדנים נגד יחידות משנה נציג של NTD, HSA, ומודולים SNF2. מחקר זה פורסם במקור בכתב עת Journal of Biological Chemistry. חן et al, ארגון למקטע של קומפלקס INO80 האדם הכרומטין שיפוץ. קומפלקס אבולוציונית נשמרים Core מזרז תלוי ATP הנוקלאוזום שיפוץ. Journal of Biological Chemistry כרך 286:. עמ '11,283-11,289. © 2011, על ידי האגודה האמריקנית לביולוגיה מולקולרית ביוכימיה ו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחקרים מבניים ותפקודיים של רב למקטע מתחמי שיפוץ הכרומטין יונקים מאאוקריוטים גבוהים כבר הקשו על ידי הקושי של הכנה ביוכימית כמויות שימושיות של מתחמים כגון המכילים יחידות משנה שעברו מוטציה או חסרי יחידות משנה מסוימות לגמרי. ישנם מספר של מכשולים טכניים: ראשית, מניפולציה גנטית בתאי יונקים הייתה מאתגרת מבחינה טכנית ודורש זמן רב. שלא כמו תאי שמרים, הגנום שניתן לערוך בקלות וממוקדת תוך שימוש בטכניקות recombineering, הגנום של היונקים הוא יותר מבחינה מבנית מורכב ופחות רגיש להתערבויות recombineering. לפיכך, מחיקה או שינוי של גנים של יונקים בתאים או בעלי חיים תרבותיים הוא זמן רב יותר ודורשת מומחיות מיוחדת יותר. כתוצאה מכך, הדור של מתחמי יונקים מוטציה שנשאו מוטציות מבניות או חסרים תת קבוצות של מקטע (ים) כבר שער הגבלה. שנית, הכינון מחדש ביוכימיים גישות באמצעות הטרומערכות ביטוי חלבון logous משמשות לעתים קרובות כדי ליצור מכלולים רב חלבון מוגדר. עם זאת, גישות כאלה נעשים מאתגרות מבחינה טכנית לקומפלקסים גדולים מאוד, שיחידות משנה ייתכן שיצטרכו לבוא לידי ביטוי בו זמנית בstoichiometry הראוי ו / או שהורכבו בהזמנה מיוחדת, עם עזרה ממלווים או cofactors ספציפיים. בעיות אלה הן חמורות במיוחד במקרה של מתחם INO80, כי מקטע Ino80 ATPase שלה הוא קשה במיוחד להביע בחרק או E. קולי תאים בכמויות ביוכימית שימושיות. במחקרים של מתחם שיפוץ הכרומטין INO80, זה כבר אפשרי לעקוף חלק מאתגרים אלה באמצעות האסטרטגיות שתוארו בפרוטוקול זה.

יצירת שורות תאים אנושיות ביציבות להביע יחידות משנה epitope מתויג של מתחם INO80 היא צעד מפתח בהליך זה, שכן הוא מאפשר הטיהור של מתחמי שיפוץ הכרומטין מוגדרים היטב שניתן לבדוק באמצעות יוכימיים שוניםssays. למרות שזה בעיקרון יותר זמן רב כדי ליצור שורות תאי יציבות מאשר להשתמש transfection החולף לספק cDNAs מהונדסים לתוך שורות תאי יונקים לייצור של חלבון רקומביננטי, transfection החולף סובל מכמה חסרונות. ראשית, DNA-בצורה של תוספת-כרומוזומליות transfected זמנית וקטור-הוא קצר ימים, ובדרך כלל לא יכול עצמית להפיץ במהלך מחזור התא. יעילות שנית, transfection משתנה מאוד בהתאם לסוג תא ותנאי גידול. transfection הטרוגנית יכול לגרום לדפוס ביטוי פסיפס שמקנה יתרון צמיחה סלקטיבית או חסרון בתוך אוכלוסיית התאים. לפיכך, זמני הציג transgenes נוטה ללכת לאיבוד במעברים סלולריים רבים הנדרשים על מנת ליצור את הכמות הגדולה של תאים דרושים לטיהור כמויות יוכימית שימושיות של חלבון. שורות תאי יציבות הם נפוצים ביותר שנוצרו תוך שימוש בשיטות שתגרומנה לאינטגרציה של cDNAs אקראיים קידוד חלבוןשל עניין. עם זאת, cDNAs המשולבים באופן אקראי יכולים לשבש ביטוי של גנים מהמקור פנימיים וכפופים להשתקת גנים עם מעברי תאים מרובים. מסיבות אלה, אנו בדרך כלל להציג את Ino80 cDNAs לתוך תאים תוך שימוש בטכנולוגית רקומבינציה בתיווך FLP, שבי cDNA משולב ביציבות למיקום כרומוזומליות ספציפית באמצעות הכנסה בתיווך recombinase FLP לאתר FRT יחיד המשולב ביציבות לתוך הגנום.

במהלך הבחירה של שורות תאי יציבות, זה הכרחי כדי להיות מסוגל לזהות,, סוג הביע אקסוגני מתויג דגל בר או חלבוני Ino80 מוטציה. בגלל חלבון Ino80 מתויג הדגל בא לידי ביטוי לעתים קרובות ברמות נמוכות מאוד וקשה או בלתי אפשרי לזהות על ידי מערבי סופג בlysates הגולמי של תאים שגודלו בבאר אחד של צלחת 24 גם לכן, לעתים קרובות יש צורך להרחיב את משובט הראשון אוכלוסיית תא לפני ההקרנה לביטוי של חלבון Ino80. אז יכול להיות מטוהר חלבון Ino80 מתויג דגל ושיתוףncentrated ידי immunopurification FLAG לפני הניתוח על ידי מערבי סופג.

היעילות של מציאה בתיווך siRNA היא די רגישה לצפיפות תאים בעת transfection; מצאנו כי יעילות מציאה ירדה כאשר transfections בוצע עם תאים בצפיפויות אחרות מזו המומלצת בפרוטוקול. האורך האופטימלי של זמן לtransfection siRNA הוא משתנה וצריך להיקבע באופן אמפירי עבור כל חלבון מטרה, כפי שהוא תלוי ביציבות של חלבון המטרה, התחלופה של החלבון הממוקד בקומפלקסי חלבונים, והמידה שבה החלבון חיוני לקיום תא. כחלופה לשימוש בtransfection החולף של siRNAs לרוקן יחידות משנה נפרדת, אחד מומלץ לשקול יצירת שורות תאי shRNAs יציבות להביע תחת לחץ בררני כפי שהוא עשוי להיות קל יותר וחסכוני יותר לגדול כמויות יוכימית שימושיות של שורות תאים כאלה. עם זאת, זה יכול להוכיח קשהכדי להשיג מציאה מספיק באמצעות מציאה בתיווך shRNA בשורות תאי יציבות.

גם מפתח להצלחה של ההליך שלנו הוא השימוש בתמציות גרעיניות כחומר מוצא לטיהור מתחמי INO80. מצאנו כי מתחמי INO80 immunopurified מתמציות תא כל לעתים קרובות מזוהמים עם ATPase ו / או פעולות שיפוץ הנוקלאוזום שאינן תלויים בATPase Ino80; זיהום מסוג זה במידה רבה נמנע כאשר מתחמים מטוהרים מתמציות גרעיניות.

הכנה של תמציות ובידוד של מתחמי INO80 שלמים גרעיניים תלויה במספר גורמים קריטיים. ראשית, התאים המשמשים להכנת תמציות גרעיניות צריכים להיות שלמים ובריאים. התא גלולה שטף צפוי להתנפח לשתי לקפל הבא דגירה בא מאגר hypotonic אם תאים לא להתנפח ו / או supernatant הופך עכור בשלב זה, האוכלוסייה של תאים מתחילות ייתכן שהייתה לא בריאה. לחלופין, גוף אדם תאים שטופלו בגסות מדי במהלך שלבי קציר או resuspension, או שהם עשויים כבר מודגרות זמן רב מדי במאגר א השני, חשוב לא מעל homogenize תאים או גלולה הגרעינית, כמו זה יהיה הגזירה הכרומטין ו לשחרר DNA לשבריר המסיס. DNA בחלק המסיס יכול להפריע לטיהור וassay של מתחמי INO80 שלאחר מכן. בפרט, זיהום DNA יכול להוביל להיווצרות מוגברת של משקעים במהלך הדגירה של התמצית עם אנטי FLAG agarose, ובכך להפחית את היעילות של צעדי כביסה וelution ו / או עלול להגביר את השפע של זיהום מחייב חלבוני DNA בשבריר המטוהר הסופי . בנוסף, פעילויות במורד הזרם ביוכימיים מידת מבחני, כי הם תלויים בDNA, ובכך לשאת על הפוטנציאל של DNA מהתמצית עלולות לסבך פרשנות של מבחני אלה. כדי להימנע over-הומוגניזציה, במהלך תמוגה תא רצוי כדי לבדוק את אחוז התאים הכחולים חיוביים trypanים לאחר כל מכה של homogenizer; לHEK293 תאים, תמוגה תא ליד מלאה בדרך כלל דורשת 4 - 6 משיכות של הומוגניות. כמו כן, חשוב להימנע מהחדרת בועות אוויר תוך שמאחד. Supernatant מספין 120,000 XG בשלב 4.2.8 צריך להיות פתרון ברור, שאינו צמיג, עם כמות רק מאוד מינימאלית של חומר מעונן או צמיג ליד גלולה הכרומטין או צפים על גבי. בעת איסוף supernatant, צריך אחד לדאוג שלא לאסוף כל החומר המעונן או צמיג, כפי שהוא עשוי לכלול הכרומטין ו / או DNA. לבסוף, עדיף להימנע מהקפאת תאים לפני הכנת תמציות גרעיניות, מאז מתחמים הוכנו מהתאים קפוא נוטים להפגין פעילות ספציפית נמוך יותר ולכלול דנ"א וחלבונים מזהמים יותר.

היחס האופטימלי בין כמות החל agarose תמצית ואנטי הדגל תלוי בריכוז של חלבון פיתיון הדגל הנוכחי בתמציות וaccessibility של epitope FLAG והצרכים שייקבע באופן אמפירי. אנחנו בדרך כלל מתחילים immunopurification עם 100 μl מיטת נפח של חרוזים agarose אנטי FLAG ו 3 - 14 מ"ל של תמצית גרעינית; הסכום של תמצית משמשת תלוי במטרות של הניסוי והזמינות של תמצית. Immunopurification צעד בודד באמצעות agarose אנטי הדגל הוא בדרך כלל מספיק כדי לטהר subcomplexes INO80 או INO80 במידה נאותה למבחנים אמינות של פעילותם; עם זאת, שלב טיהור נוספת (ים), כגון סינון ג'ל, שקיעת שיפוע צפיפות, או כרומטוגרפיה חילוף יונים עשוי להיות נחוץ לטיהור מתחמים אחרים או להסיר פעילויות מזהמות שעלולות לסבך פרשנות של מבחני ביוכימיים.

האסטרטגיות המתוארות כאן צריכה להיות באופן כללי יותר שימושי עבור מחקרים של אנזימי שיפוץ הכרומטין אחרים, כמו גם מתחמי multiprotein גדולים אחרים. יישום מוצלח של אסטרטגיות אלה לניתוח של mu האחרמתחמי ltiprotein תלויים בזיהוי (i) של מקטע בודד או למקטע (ים) המשמש כפיגום (ים) שבו תת יחידות אחרות להרכיב ו( ii) הגדרה של תחומים או אזורים הספציפיים שבו תת ספציפי של יחידות משנה להרכיב. ההגדרה של תחומים כגון ניתן להקל על ידי ניתוח הרצף הראשוני של מקטע פיגום ליבה (ים) לאזורים או אזורים שמורים באבולוציה שמתאימה לתחומים מבניים ידועים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה במעבדה של המחברים נתמכת על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי רפואה כלליים (GM41628) ועל ידי מענק למכון Stowers למחקר רפואי מהלן נלסון רפואי קרן המחקר בקרן קהילת קנזס רבתי העיר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Cellgro 10-013-CV
Glutamax-I (stablized glutamine) Life Technologies 35050-079
Fetal Bovine Serum SAFC 12176C
FuGENE6 transfection reagent Promega E2312
Hygromycin B, sterile in PBS AG Scientific H-1012-PBS
pcDNA5/FRT vector Life Technologies V6010-20
Flp-In HEK293 cells Life Technologies R780-07
pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector Life Technologies V600520
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma F2426
calf serum SAFC 12138C
TARGETplus SMARTsiRNA pool Dharmacon / Thermo Scientific various
5x siRNA resuspension buffer Dharmacon / Thermo Scientific #B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAX Life Technologies 13778
Opti-MEM Reduced Serum Medium Life Technologies 51985-091
PBS Cellgro 45000 VWR
TrypLE (trypsin) Life Technologies 12604
1x FLAG Peptide Sigma F3290
Micro Bio-Spin Chromatography Column Bio-Rad 737-5021
Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) Amicon UFC805024 Fisher Scientific
Zeba Desalting Columns Thermo Scientific 89882
Anti-FLAG M2 antibody, mouse Sigma F3165
Anti-FLAG M2 antibody, rabbit Sigma F7425
Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8340
benzonase Novagen 70664
Equipment
JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge Beckman-Coulter 339080
JA-17 rotor Beckman-Coulter 369691
10 ml polycarbonate tubes Beckman-Coulter 355630
70 ml polycarbonate bottles Beckman-Coulter 355655
Type 45 Ti rotor Beckman-Coulter 339160
Type 70.1 Ti rotor Beckman-Coulter 342184
BD Clay Adams Nutator Mixer BD Diagnostics 15172-203 VWR
Glas-Col Tube/Vial Rotator Glas-Col 099A RD4512
PCR thermal cycler PTC 200 MJ Research PTC 200
roller bottle incubator Bellco biotechnology 353348
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 Millipore IPFL07810
lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes Costar 3207

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
  2. Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15, (5), 469-476 (2008).
  3. Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406, (6795), 541-544 (2000).
  4. Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
  5. Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286, (13), 11283-11289 (2011).
  6. Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5, (5), 521-527 (1994).
  7. Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251, (4999), 1351-1355 (1991).
  8. Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280, (50), 41207-41212 (2005).
  9. Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14, (9), 872-874 (2007).
  10. Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31, (6), 909-917 (2008).
  11. Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16, (4), 730-735 (1994).
  12. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 207-245 (2005).
  13. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11, (5), 1475-1489 (1983).
דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, R. C., Conaway, J. W. Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes. J. Vis. Exp. (92), e51720, doi:10.3791/51720 (2014).More

Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, R. C., Conaway, J. W. Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes. J. Vis. Exp. (92), e51720, doi:10.3791/51720 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter