Summary
Este protocolo describe un procedimiento para la generación y purificación de tipo salvaje y versiones mutantes del complejo de remodelación de la cromatina INO80 humano. Etiquetadas con epítopo versiones de subunidades INO80 se expresaron de manera estable en células HEK293, y los complejos completos y complejos que carecen de conjuntos específicos de subunidades se purifican mediante cromatografía de inmunoafinidad.
Abstract
Complejos remodeladores de cromatina INO80 regulan la dinámica de nucleosomas y la accesibilidad de ADN al catalizar la remodelación de nucleosomas dependiente de ATP. Ino80 Humanos constan de 14 subunidades de proteínas incluyendo Ino80, un SNF2-como ATPasa, que sirve tanto como la subunidad catalítica y el andamio para el ensamblaje de los complejos. Funciones de las otras subunidades y los mecanismos por los que contribuyen a la actividad de remodelación de la cromatina del complejo INO80 siguen siendo poco conocidos, en parte debido al desafío de generar subconjuntos INO80 en células humanas o sistemas de expresión heteróloga. Este protocolo JOVE describe un procedimiento que permite la purificación de subcomplexes remodelación de la cromatina INO80 humanos que carecen de una subunidad o un subconjunto de subunidades. N-terminal BANDERA epítopo etiquetados cDNA Ino80 se introducen de manera estable en el riñón embrionario humano (HEK) 293 líneas celulares que utilizan la recombinación mediada por FLP. En el caso de que un subconjunto de subunidades del complejo INO80 es abe borrado, uno expresa las proteínas mutantes Ino80 vez que carecen de la plataforma necesaria para el montaje de esas subunidades. En el caso de una subunidad individual es a agotarse, uno transfecta siRNAs dirigidos a esta subunidad en una línea celular HEK 293 que expresan establemente FLAG etiquetados Ino80 ATPasa. Nuclear extractos se preparan, e inmunoprecipitación FLAG se realiza para enriquecer las fracciones de proteínas que contienen derivados Ino80. Las composiciones de subcomplexes INO80 purificados a continuación, se pueden analizar utilizando métodos tales como la inmunotransferencia, la tinción con plata, y espectrometría de masas. Los subcomplexes INO80 y INO80 generados de acuerdo con este protocolo se pueden analizar posteriormente utilizando diversos ensayos bioquímicos, que se describen en el protocolo JOVE acompaña. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar para los estudios de las propiedades estructurales y funcionales de cualquier remodelación de la cromatina multi-subunidad de mamíferos y en complejos de modificadores.
Introduction
Complejos remodeladores de cromatina familiares SNF2 conservadas evolutivamente son reguladores clave de la organización de la cromatina y la accesibilidad de ADN 1. Estos complejos de remodelación siempre incluyen una subunidad ATPasa-SNF2 como central, que, en algunos casos, se reúne con diversas proteínas accesorias y forma de múltiples subunidades asambleas macromoleculares. Para estudiar los detalles moleculares del proceso de remodelación de la cromatina dependiente de ATP, es importante para entender las contribuciones de los subconjuntos dados de subunidades y / o estructuras de dominio a las actividades de los complejos. Tales análisis requieren la capacidad de generar complejos de mutantes altamente purificados que carecen de subunidades de proteínas particulares o estructuras de dominio.
Anteriores estudios de estructura-función de los complejos de remodelación de la cromatina dependientes de ATP han ampliamente centrado en el sistema modelo de levadura debido a la manipulabilidad superior del genoma de la levadura (véase, por ejemplo, refs 1-4). Dada la conservación de loscomposición de la subunidad y funcionalidad entre los complejos de remodelación de ortólogos, los estudios sobre la estructura y función de los complejos de remodelación de levadura han aportado importantes conocimientos sobre sus homólogos en eucariotas superiores. No obstante, existen especies específicas apreciables diferencias entre los complejos de remodelación, que resulta de la ganancia o pérdida de especies específicas de subunidades, la ganancia o pérdida de los dominios específicos de especies de subunidades conservados, y la secuencia de la variabilidad dentro de dominios conservados de subunidades conservados. Estas diferencias no pueden en principio ser impulsados por la necesidad de que las células eucarióticas superiores para adaptarse a nuevos entornos moleculares y celulares. Por lo tanto, la comprensión de cómo las subunidades de los complejos de remodelación de eucariotas superiores contribuyen al proceso de remodelación nucleosoma es valiosa, ya que no sólo arroja luz sobre los mecanismos básicos del proceso de remodelación de la cromatina dependiente de ATP, pero también puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos por los que la estructura de la cromatina y la expresión génica en higsus eucariotas están regulados.
Hasta el momento, sólo se han limitado los estudios estructurales y funcionales de los complejos de remodelación de la cromatina de mamíferos múltiples subunidades, debido en parte a las dificultades en la obtención de los complejos de remodelación de la cromatina bioquímicamente definidos y subcomplexes. Hemos eludido parcialmente estas dificultades con los procedimientos descritos a continuación, en el que la purificación de inmunoafinidad se utiliza para preparar INO80 o INO80 subcomplexes intactos de las células humanas que expresan establemente N-terminal FLAG epítopo etiquetado de tipo salvaje o versiones mutantes de Ino80 5-7 (Figura 1) . Para obtener complejos de INO80 intactos de las células humanas, la recombinación mediada por FLP se utiliza para generar líneas celulares transgénicas HEK293 que expresan de forma estable epítopo FLAG ADNc etiquetados que codifican subunidades de los complejos INO80 8-10. Debido a la sobre expresión de subunidades INO80 puede ser algo tóxicos, es necesario aislar y mantener líneas celulares clonales menores de co selectivanditions para asegurar la expresión transgénica estable durante los muchos pasajes necesarios para la expansión de los cultivos celulares a gran escala. Para obtener subcomplexes INO80 más pequeños que contienen solamente un subconjunto de subunidades, hemos utilizado con éxito dos enfoques (Figura 2A, B). En la primera, generamos líneas celulares HEK293 Flp-In que expresan de forma estable versiones mutantes de Ino80 que carecen de dominios requeridos para la interacción con las subunidades específicas 5. Alternativamente, mediada desmontables-siRNA se utiliza para agotar la subunidad deseada a partir de células que expresan una subunidad INO80 marcado con FLAG apropiado (datos no publicados). Por último, para purificar los complejos INO80 humanos, FLAG cromatografía basada agarosa 11 se utiliza para enriquecer la fracción que contiene INO80-a partir de extractos nucleares, lo que reduce de manera efectiva la presencia de proteínas contaminantes citosólicas en la fracción final que contiene INO80 o INO80 subcomplexes purificados.
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Protocol
1. Generación y Cultura de HEK293 líneas estables celulares que expresan versiones mutantes de la BANDERA de cuerpo entero o epítopo de etiquetado Ino80 o otras subunidades INO80 complejas
- Clon de ADNc de longitud completa que codifica o mutante humana Ino80 ATPasa u otra subunidad INO80 en el vector de expresión de mamífero pcADN5 / FRT con un terminal N etiqueta de epítopo FLAG en el marco.
- Confirme la secuencia de los ADNc insertados por secuenciación de ADN antes de proceder.
- Para realizar la transfección, Flp-In crecer células HEK293 en 10 cm de platos de cultivo de tejidos en un medio que contiene DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco), 5% de glutamina, y 10% de FBS (suero fetal bovino).
- Cuando las células alcanzan ~ 70% de confluencia, añadir a cada placa de cultivo tisular de una mezcla de 40 l de reactivo de transfección FuGENE6, 0,5 g del plásmido de expresión pcDNA5 / FRT adecuada, y 9,5 g de pOG44, que codifica la recombinasa Flp, en un volumen total de 800 l.
- 48 horas más tarde, y s trypsinizePlit células en una relación de 01:30 en 10 cm de platos, y hacerlas crecer en DMEM con 5% de glutamina, 10% de FBS y 100 g / ml de higromicina B para 3 - 4 semanas. Cambie el medio de cultivo cada vez que empieza a volverse amarilla (normalmente cada 3 - 5 días).
- Para identificar los clones positivos que expresan el nivel más alto de la proteína marcada con FLAG, seleccionar colonias higromicina B individuo resistente y transferirlos a un solo pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Una vez que las células alcanzan 80% de confluencia, las células de la cosecha de cada pocillo en ~ 1 ml de PBS y sedimento por centrifugación a 1000 xg durante 5 min.
- Después de retirar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 60 l de tampón de muestra de SDS-PAGE.
- Asunto medio del sedimento de células se resuspendió a la página SDS y Western Blot para controlar la expresión de la proteína marcada con FLAG cebo; guardar la otra mitad para análisis futuros.
- Si no se detecta una proteína humana Ino80 bandera de etiquetado en lisados celulares, expanda la popu inicial de células clonalmento más en placas células de los pocillos individuales de una placa de 24 pocillos en 15 cm de platos de cultivo de tejidos.
- Para cosechar las células de 15 cm de platos, resuspender cerca de las células confluentes en PBS enfriado con hielo y la transferencia a un tubo cónico de 50 ml.
- Llevar a un volumen final de 50 ml mediante la adición de PBS adicional.
- Precipitar las células a 1.000 g durante 5 min, y eliminar lo más posible del sobrenadante.
- Resuspender el sedimento celular en 1 ml de tampón de Lys450 (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, NaCl 450 mM, 0,5% Triton X-100, 10 mM de KCl, 4 mM de MgCl 2, EDTA 0,2 mM, glicerol al 10%, DTT 1 mM, 200 M PMSF y 1: 1000 cóctel inhibidor de proteasas).
NOTA: aquí y en otros lugares, siempre agregar la TDT, PMSF y cóctel inhibidor de la proteasa para tampones inmediatamente antes de comenzar un experimento. - Inmuno-precipitado proteínas del lisado de células enteras resultante FLAG-etiquetados utilizando 20 l de gel de agarosa anti-FLAG, y analizar los eluidos BANDERA de Western Blot. [Para más detalles sobre immunprocedimiento oprecipitation, ver paso 5]
- Preparar material congelado de líneas celulares clonales deseados 12 y almacenarlos en nitrógeno líquido hasta su uso.
2. Growing HEK293 líneas celulares en frascos rotatorios
Para la preparación a gran escala de complejos INO80, células de cultivo en 10 - 20 botellas de rodillos; un rendimiento típico de cada frasco rotativo es ~ 1 ml de concentrado de hematíes.
- Para cada botella rodillo, añadir 200 ml de DMEM, 5% de glutamina, y 10% de suero de ternera, sin higromicina B.
- Transferir todas las células de un solo cerca de 15 cm confluente plato en cada botella rodillo
- Botellas Lugar de rodillos en un 37 ° C rodillo botella incubadora y giran a 0,2 rpm.
- Una vez que las células alcanzan ~ 70% de confluencia, verter y desechar el medio.
- Añadir PBS ~ 50 ml de hielo frío a cada botella. La celebración de botellas en posición horizontal, homogeneizar suavemente para aflojar la monocapa celular.
- Transferir las células se volvieron a suspender a 250 ml plastbotellas cónicas ic y el lugar en el hielo.
- Enjuague las botellas de rodillos con PBS adicional, transfiriéndolo secuencialmente de botella a botella. Cuando la solución de enjuague ya no está claro (normalmente después de haber sido usada para enjuagar unos 5 botellas), añadir a la suspensión celular.
- Precipitar las células por centrifugación a 400 xg durante 10 min.
- Resuspender las células en PBS, combinarlos en un solo frasco cónico de 250 ml, y mantener en hielo hasta su posterior procesamiento.
3. siRNA mediada Derribo de INO80 Subunidades en células que expresan Otra bandera de etiquetado INO80 Subunidad
Para obtener subcomplexes INO80 que carecen de una única subunidad, uso FLAG-inmunopurificación para purificar Ino80 de células siRNA tratados o células que expresan establemente shRNA. El siRNA "marcha atrás" (pequeños ARN de interferencia) protocolo de transfección descrito aquí está optimizado para las células HEK293 que crecen en placas de 15 cm. El protocolo es para un solo plato de 15 cm de células y shoULD ser ampliado en consecuencia en función del número de células necesarias. Para preparar cantidades bioquímicamente útiles del complejo INO80 a partir de células tratadas con siRNA, se debe ampliar a las culturas crecido en 40 de 15 cm de platos; éstas producen aproximadamente el 2 - 4 ml de pellet hematocrito.
- Se cultivan las células HEK293 que expresan establemente la subunidad deseada del complejo INO80 hasta casi confluencia en placas de 15 cm.
- Añadir un volumen de tampón de resuspensión de siRNA (mM KCl 20 mM, HEPES 6-pH 7,5, y 0,2 mM de MgCl 2) suficiente para preparar una solución madre 50 mM de ARNsi a un tubo que contiene liofilizado siRNA. Pipetear la solución arriba y abajo un par de veces y se incuba en un nutator durante 30 minutos a temperatura ambiente para garantizar el siRNA se haya disuelto completamente.
- Preparar un cóctel de transfección que contiene siRNAs y reactivo de transfección. Mezclar 10 l de la solución madre 50 mM siRNA con 32 l Lipofectamine RNAiMAX y añadirlo a 4 ml de Opti-MEM medio de suero reducido con mezcla muy suave; albajo todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de su uso.
- Incubar la mezcla a TA durante 30 min.
- Preparar las células Flp-In HEK293 que expresan establemente la subunidad INO80 deseada para la transfección.
- Durante la incubación de la Etapa 3.4, lavar las células en las placas de 15 cm una vez con PBS RT.
- Después de la eliminación de PBS, el tratamiento de las células con 1 ml de tripsina hasta que empiecen a levantar la placa.
- Inmediatamente después, añadir 10 ml de medio completo (DMEM + 5% de glutamina + 10% de FBS) a las células se trataron con tripsina y mezclar suavemente. Recoger las células por centrifugación a 1000 xg durante 5 min a TA.
- Resuspender el sedimento celular en ~ 4 ml de medio completo, y contar el resuspensión de células usando un hemocitómetro.
- Diluir las células con medio completo a una concentración de ~ 5,4 x 10 6 / ml.
- Para cada plato 15 cm, añadir 15 ml de medio de cultivo completo seguido por 4 ml de cóctel de transfección. Agitar suavemente para asegurar el medio de transfección y cócteles son thoroughly mezclado. Por último, añadir un ml de suspensión de células y de nuevo agitar suavemente para dispersar las células de manera uniforme.
- Después de 60 horas de cultivo en un 37 ° C, 5% de CO2, retire con cuidado medio, suspender las células en hielo frío PBS, y proceder de inmediato a preparar extractos nucleares.
4 Preparación de extractos nucleares
Este procedimiento se ha modificado desde el protocolo de Dignam 13 y se puede escalar hacia arriba o hacia abajo, dependiendo del tamaño de iniciar sedimentos celulares. Típicamente, 1 ml de concentrado de rendimientos sedimento celular 1 ml de extracto nuclear final. Todos los tampones deben ser fría como el hielo, y todos los pasos deben realizarse en una habitación fría o con hielo si una habitación fría conveniente no esté disponible.
- Aislamiento de los núcleos:
- Transferir suavemente las células de un tamaño adecuado (15 o 50 ml) se graduó tubo cónico y centrifugado a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante, y medir el volumen de la pel celular aglomeradodejar. 1 ml de concentrado de eritrocitos corresponde a ~ 3 x 10 8 células HEK293.
- Añadir 5 volúmenes envasados celulares de tampón A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM KCl y recién añadido DTT 1 mM, 200 mM PMSF y 1: 1000 de cóctel inhibidor de proteasa). Resuspender el sedimento celular por pipeteo suave.
- Incubar en hielo durante exactamente 10 min.
- Sedimentar las células a 1.000 xg durante 10 min a 4 ° C, y eliminar el sobrenadante.
- El tamaño del sedimento celular debería aumentar hasta 2 veces durante la incubación en tampón A.
- Resuspender las células en dos volúmenes de células empaquetadas de tampón A, y transferir la suspensión celular a un tamaño apropiado homogeneizador de tejidos Dounce. Si a partir de menos de 2 ml de concentrado de hematíes, utilizar un homogeneizador 7 ml; para 2 - 4 ml concentrado de hematíes, utilizar un homogeneizador 15 ml; y de 10 o más ml de concentrado de hematíes, utilizar un homogeneizador 40 ml.
- Homogeneizar la suspensión celular con la mano del mortero de vidrio sueltas del homogeneizador Dounce ONUhasta 90% de las células teñir positivamente con 1% de azul de tripano.
- Transferir la suspensión a un tubo de centrífuga de alta velocidad de 45 ml y centrifugar a 25.000 xg durante 20 min a 4 ° C en un rotor JA-17 o similar (véase la Tabla de Materiales / Equipos).
- Desde el sedimento nuclear, separar el sobrenadante, que contiene proteínas o proteínas que se filtran fuera del núcleo durante el fraccionamiento citosólicas.
- La extracción de núcleos con sal:
- Añadir Tampón C (HEPES 20 mM, pH 7,9, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM EDTA, y recién añadido DTT 1 mM, PMSF 200 mM, y 1: 1000 de cóctel inhibidor de la proteasa) al sedimento nuclear; utilizar 2,5 ml Tampón C por cada 3 ml de comenzar el hematocrito (~ 1 x 10 9 células).
- Usando una varilla de vidrio o una pipeta, desalojar el sedimento nuclear de la pared del tubo y transferir toda la mezcla a un homogeneizador Dounce de un tamaño apropiado.
- Resuspender los núcleos por homogeneización ªmezcla e con dos golpes de una mano de mortero suelto.
- Transferir la fracción nuclear se resuspendió en un vaso de precipitados enfriado. Elija un vaso de precipitados de tal modo que la suspensión se llenará el vaso de precipitados a por lo menos 0,5 cm de profundidad.
- Para extraer las proteínas nucleares de la cromatina o de otras estructuras insolubles, aumentar gradualmente la concentración de sal de la suspensión a NaCl 0,42 M mediante la adición gota a gota de NaCl 5 M mientras se agita suavemente la suspensión con una pipeta o varilla de vidrio en hielo; Una vez que todo el M NaCl 5 ha sido añadido, la solución debe ser muy viscoso o similar a un gel. Calcular el volumen de 5 M de NaCl necesaria para llevar la solución a una concentración final de NaCl 0,42 M de acuerdo con la siguiente fórmula:
- Transferir cuidadosamente la suspensión viscosa en 10 ml tubos de policarbonato para un tipo de 70,1 rotor Ti (o equivalentes) botellas de policarbonato o 70 ml para un tipo 45 Ti or rotor similar (véase la Tabla de Materiales / Equipos). Selle herméticamente con Parafilm si utiliza tubos de 10 ml o con el conjunto de la tapa si está utilizando 70 ml botellas.
- Roca lentamente los tubos sellados a 4 ° C durante 30 min usando un nutator.
- Haga girar las muestras de un tipo de 45 o 70.1 Ti Ti rotor durante 30 minutos a 120.000 xg a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante a un tubo de plástico simple o botella. Este sobrenadante es el extracto nuclear, y el sedimento contiene la cromatina nuclear y otros desechos.
- Dividir el extracto nuclear en alícuotas convenientemente dimensionados, congelar en nitrógeno líquido y almacenarlo a -80 ° C.
5. Inmunoafinidad Purificación del INO80 humano o INO80 Subcomplejos
- Para descongelar el extracto nuclear congelada, coloque los tubos que contienen el extracto de los tubos de sobremesa o rollo entre las manos hasta que el material congelado se convierte en una suspensión. A continuación, coloque los tubos en hielo o en la cámara frigorífica hasta que el extracto es completamente thawed.
- Transferir el extracto nuclear descongelado a tubos de ultracentrífuga de policarbonato de 10 ml, y centrifugado a 100.000 xg durante 20 min a 4 ° C en un rotor Ti Tipo 70.1 o equivalente para eliminar cualquier precipitado que se pueden haber formado durante el ciclo de congelación-descongelación.
- Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 15 ml. Añadir fresco cóctel TDT, PMSF, y inhibidor de proteasa a concentraciones finales de 1 mM DTT, 200 mM PMSF y 1: 1000 cóctel inhibidor de proteasas.
- Para preparar agarosa anti-FLAG para la inmunopurificación, transferir 200 l de suspensión al 50% de perlas de agarosa anti-FLAG a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml usando una pipeta P200 o similar con una punta de la que el extremo se ha cortado con un escalpelo limpio o cuchilla de afeitar.
- Sedimentar las perlas por centrifugación en una microcentrífuga de sobremesa a 8.000 xg durante 30 seg. Eliminar el sobrenadante y lavar las perlas mediante resuspensión de las perlas en 1 ml de tampón de Lys450, y sedimentar las perlas a 8.000 xg durante 30 seg. Lave la bEADS dos veces más.
- Resuspender las perlas de agarosa anti-FLAG lavadas en aproximadamente 100 l de extracto nuclear usando un P200 o una pipeta de volumen ajustable similar con una punta de la que el extremo se ha cortado con un escalpelo limpio o cuchilla de afeitar y, empleando la misma punta, la transferencia las perlas se resuspendieron en el tubo cónico de 15 ml que contiene el extracto. Repita varias veces hasta que todas las cuentas han sido transferidas al tubo de 15 ml.
- Incubar la mezcla de extracto / perlas durante 4 horas a 4 ° C con rotación lenta en un rotor de laboratorio. OPCIONAL: Incluir benzonasa a una concentración de 25 unidades / ml para eliminar la contaminación de ADN.
- Recoge la agarosa FLAG por centrifugación a 1000 × g durante 5 min a 4 ° C.
- Volver a suspender en 10 ml Lys450 para lavar, incubar 5 min a 4 ° C con agitación suave en un nutator. Sedimentar las cuentas a 1.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender en 100 - 150 l de Lys450 y transferencia de cuentas a un tubo de 1.5 ml. Continue para enjuagar el tubo cónico de 15 ml con 100 - 150 l de Lys450 hasta que todos los granos se han transferido al tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar las cuentas a 8.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C en una microcentrífuga. Lavar tres veces más con 1 ml Lys450 y una vez con 1 ml de tampón EB100 (10 mM HEPES pH 7,9, 10% de glicerol, NaCl 100 mM, 1,5 mM de MgCl 2, 0,05% Triton X-100, y recién añadió DTT 1 mM, PMSF 200 mM , y 1: 1000 cóctel inhibidor de proteasas).
- Para eluir las proteínas unidas, añadir tampón EB100 200 l que contiene 0,25 mg ml 1x péptido / FLAG. Incubar 30 min a 4 ° C cada uno en una nutator.
- Sedimentar las cuentas a 8.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C en una microcentrífuga. Transferir el sobrenadante, que contiene el complejo INO80 eluido, a un tubo de microcentrífuga fresco.
- Repetir la elución cuatro veces más, y poner en común todos los sobrenadantes en un solo tubo.
- Para eliminar las cuentas residual FLAG-agarosa de la fracción de proteína eluida,pasar el eluato a través de una columna de centrifugación vacío.
- Se concentra la fracción de proteína se eluyó ~ 10 veces usando un dispositivo de filtro centrífugo de ultra (corte de peso molecular 50.000).
- Para eliminar el péptido FLAG, pasar la fracción de proteína concentrada secuencialmente a través de dos columnas de desalación.
- Divida la fracción de proteína purificada, desalado en 20 alícuotas, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C.
- Analizar la composición de la subunidad de INO80 o subcomplexes INO80 en geles teñidos con plata o por el Western Blot, y estimar su concentración por el Western Blot semi-cuantitativo utilizando preparaciones de subunidades INO80 recombinantes de concentración conocida como estándares.
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Representative Results
La figura 1 muestra un diagrama de flujo que resume los procedimientos que se utilizan para generar, purificar y caracterizar los complejos de remodelación de la cromatina INO80 ATP-dependientes humanos.
Como se ilustra en las figuras 2 y 3, estos procedimientos permiten la generación de ambos tipo INO80 y INO80 subcomplexes salvajes que carecen de varias subunidades, permitiendo así que los análisis bioquímicos posteriores de la contribución de estas subunidades que faltan a las actividades enzimáticas de INO80. Figura 2 describe dos estrategias que tenemos utilizado para definir la arquitectura del complejo INO80 y generar subcomplexes INO80. En la primera, que se muestra en la Figura 2A, complejos INO80 intactos se purifican a través de versiones Bandera de etiquetado de las subunidades de tipo salvaje (NIF N ° 2 o INO80E). Subcomplexes pueden purificarse a través de las versiones etiquetadas con epítopo de las proteínas Ino80 mutantes que carecen de dominios individuales en los que diferentes conjuntos de subunidades ASAMble. Como se muestra en la Figura 3A, la pureza de los complejos resultantes se evaluó mediante teñido con plata de geles de SDS-poliacrilamida, mientras que la composición de los complejos se evaluó mediante Western Blot con anticuerpos contra diversas subunidades INO80 (Figura 3B) o por espectrometría de masas (datos no se muestra). Con este enfoque, se encontró que las subunidades que aparecen en rojo en la Figura 2A se perdieron debido a la supresión de la Ino80 NTD (dominio N-terminal); subunidades que se muestran en azul se perdieron debido a la supresión de la Ino80 HSA (helicasa SANT Asociado) de dominio; y que el dominio SNF2 ATPasa, compuesto por SNF2N y HELICc regiones (púrpura) separados por una región larga de inserción (blanco), era necesaria y suficiente para la unión a las subunidades que se muestran en púrpura. Así, subcomplexes INO80 (INO80ΔN.com o INO80ΔNΔHSA.com) que carecen de cualquiera de las subunidades que se muestran en rojo o subunidades que se muestran en rojo y azul se pueden purificar mediante FLAG-Ino80ΔN o FLAG-INO80ΔNΔHSA, respectivamente 5.
También es posible generar ozono subcomplexes por subunidades individuales de células que expresan una subunidad INO80 marcado con FLAG apropiado (resultados no publicados). En el primer ejemplo se muestra en la Figura 2B, desmontables ARNsi mediada por la subunidad X agota sólo X del complejo INO80, lo que sugiere X no se requiere para el montaje de cualquier otras subunidades en INO80. En el segundo y tercer ejemplos, siRNA desmontables de Y o Z conduce a la co-agotamiento tanto de la Y y Z subunidades, lo que sugiere Y y Z se ensamblan para formar el complejo INO80 de una manera mutuamente dependientes.
. Figura 1 Diagrama de flujo que describe los procedimientos utilizados para generar, purificar y caracterizar los complejos de remodelación de la cromatina INO80 ATP-dependientes humanos F, un N-terminal en fase etiqueta epítopo FLAG; GOI, Gene-de-eninterés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 Diagrama que muestra las dos estrategias que se utilizan para generar subcomplexes INO80 que contienen un subconjunto de subunidades. (A) El Ino80 ATPasa contiene regiones que funcionan como andamios modulares en el que las otras subunidades INO80 montar. (B) siRNA mediada desmontables se puede utilizar para agotar la subunidad deseada (X o Y o Z) a partir de células que expresan un FLAG- apropiada etiquetados subunidad INO80 (por ejemplo, FLAG-Ino80ΔN). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
![Figura 3]("/files/ftp_upload/51720/51720fig3highres.jpg")
Figura 3. Análisis de la composición de los complejos INO80 inmunopurificados y subcomplexes. (A) Ino80 o subcomplexes se purificaron a partir de células que expresan de forma estable las proteínas Bandera de etiquetado indicados, sometidos a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, y se visualizaron por tinción con plata. La muestra en el carril de más a la derecha se prepara a partir de 293 células parentales que expresan ninguna proteína marcada con FLAG; proteínas que aparecen en este carril de control son los contaminantes que se unen de forma no específica a FLAG-agarosa. Las etiquetas de la izquierda indican las bandas correspondientes a varias subunidades INO80, y los de la derecha las movilidades de los marcadores de peso molecular. La posición de tipo salvaje Ino80 está indicada por el rectángulo negro, y las posiciones de los mutantes Ino80 se indican mediante círculos abiertos. Los carriles separados por la línea de negro son de geles separados. (B) Ino80 subcomplexes y se analizaron por Western Blotutilizando anticuerpos contra las subunidades representativos de la NTD, HSA, y los módulos de SNF2. Esta investigación fue publicado originalmente en The Journal of Biological Chemistry. Chen et al, Organización subunidad del complejo INO80 Humano remodelación de la cromatina. Un Complejo conservado evolutivamente Core Cataliza ATP-dependiente Nucleosome Remodelación. El Journal of Biological Chemistry Vol 286: pp. 11.283-11.289. © 2011, por la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los estudios estructurales y funcionales de múltiples subunidades complejos de remodelación de la cromatina de mamíferos a partir de eucariotas superiores se han visto obstaculizados por la dificultad de preparar bioquímicamente cantidades útiles de tales complejos que contienen subunidades mutantes o que carecen de ciertas subunidades completo. Hay un número de obstáculos técnicos: En primer lugar, la manipulación genética en células de mamíferos ha sido técnicamente difícil y consume mucho tiempo. A diferencia de las células de levadura, cuyo genoma puede ser editada y dirigida fácilmente usando técnicas recombinería, el genoma de mamífero es estructuralmente más complejo y menos susceptible a intervenciones recombinería. Por lo tanto, la supresión o la modificación de genes de mamíferos en células cultivadas o animales es más tiempo y requiere conocimientos más especializados. Como consecuencia, la generación de complejos de mamíferos mutantes que llevan mutaciones estructurales o que carecen de subconjuntos de subunidad (s) ha sido limitante de la velocidad. En segundo lugar, la reconstitución bioquímica se acerca usando heterosistemas de expresión de proteínas logous se utilizan a menudo para generar conjuntos de múltiples proteínas definidas. Sin embargo, estos enfoques se vuelven un reto técnico para los muy grandes complejos, cuyas subunidades pueden necesitar ser expresado de manera simultánea en estequiometría adecuada y / o para ser ensamblado en un orden en particular, con la ayuda de chaperones o cofactores específicos. Estos problemas son especialmente graves en el caso del complejo INO80, porque su subunidad Ino80 ATPasa es particularmente difícil de expresar en insectos o E. células de E. coli en cantidades bioquímicamente útiles. En los estudios de la compleja remodelación de la cromatina INO80, ha sido posible sortear algunos de estos desafíos mediante las estrategias descritas en este protocolo.
Generación de líneas celulares humanas que expresan de forma estable epítopo etiquetado subunidades del complejo INO80 es un paso clave en este proceso, ya que permite la purificación de los complejos de remodelación de la cromatina bien definidas que pueden ser probados utilizando varios un bioquímicossays. Aunque es en principio más tiempo para generar líneas celulares estables que utilizar la transfección transitoria para entregar ADNc ingeniería genética en líneas celulares de mamíferos para la producción de proteína recombinante, la transfección transitoria sufre de varios inconvenientes. En primer lugar, el ADN en la forma de un extra-cromosómica transitoriamente transfectadas por vectores es de corta duración y por lo general no puede auto-propagar durante el ciclo celular. En segundo lugar, la eficacia de transfección varía en gran medida dependiendo del tipo de célula y condiciones de crecimiento. Transfección heterogénea puede causar un patrón de expresión mosaico que confiere una ventaja de crecimiento selectiva o desventaja dentro de la población celular. Por lo tanto, los transgenes introducidos transitoriamente tienden a perderse durante los muchos pases celulares requeridos para generar la gran cantidad de células necesarias para la purificación de cantidades útiles de la proteína bioquímicamente. Las líneas celulares estables se generan más comúnmente utilizando métodos que resultan en la integración aleatoria de ADNc que codifica una proteínade interés. Sin embargo, los ADNc integrados al azar pueden interrumpir la expresión de genes endógenos y están sujetos a silenciamiento de genes con múltiples pases celulares. Por estas razones, típicamente introducimos Ino80 ADNc en las células usando la tecnología de recombinación mediada por FLP, en el que el ADNc se incorpora de manera estable en una ubicación cromosómica específica a través de Flp recombinasa mediada por la inserción en un único sitio de FRT integrado de forma estable en el genoma.
Durante la selección de líneas celulares estables, es esencial para ser capaz de detectar de forma exógena expresada, marcado con FLAG, proteínas de tipo salvaje o mutantes Ino80. Puesto que la proteína Ino80 marcado con FLAG se expresa a menudo en niveles muy bajos y, por tanto, es difícil o imposible de detectar por transferencia Western en lisados crudos de células cultivadas en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos, a menudo es necesario ampliar el clonal inicial población de células antes de la detección de la expresión de la proteína Ino80. Marcado con FLAG proteína Ino80 puede entonces ser purificado y concentrated por inmunopurificación FLAG antes del análisis por transferencia Western.
La eficiencia de la caída siRNA mediada es bastante sensible a la densidad celular en el momento de la transfección; encontramos que la eficiencia caída disminuyó cuando transfecciones se realizaron con células en densidades distintas de las recomendadas en el protocolo. La longitud óptima de tiempo para siRNA transfección es variable y debe determinarse empíricamente para cada proteína diana, ya que depende de la estabilidad de la proteína diana, la tasa de rotación de la proteína objetivo en complejos de proteínas, y el grado en que la proteína es esencial para la viabilidad celular. Como alternativa a la utilización de la transfección transitoria de siRNAs para agotar subunidades individuales, se puede desear para considerar la generación de líneas celulares que expresan establemente shRNAs bajo presión selectiva, ya que puede ser más fácil y más rentable para crecer cantidades bioquímicamente útil de tales líneas celulares. Sin embargo, puede resultar difícilpara obtener suficiente caída usando mediada desmontables shRNA-en líneas celulares estables.
También es clave para el éxito de nuestro procedimiento es el uso de extractos nucleares como material de partida para la purificación de complejos de INO80. Hemos encontrado que los complejos INO80 inmunopurificados a partir de extractos de células enteras a menudo están contaminados con ATPasa y / o actividades de remodelación de nucleosomas que son independientes de la Ino80 ATPasa; tal contaminación se evita en gran medida cuando los complejos se purifican a partir de extractos nucleares.
Preparación de extractos nucleares y el aislamiento de los complejos INO80 intactas depende de un número de factores críticos. En primer lugar, las células utilizadas para preparar extractos nucleares deben estar intacto y sano. Se espera que el sedimento celular se lavó a hincharse hasta dos veces después de la incubación en el tampón hipotónico A. Si las células no se hinchan y / o el sobrenadante se vuelve turbia en este paso, la población inicial de células puede haber sido poco saludable. Como alternativa, Las células pueden haber sido manipulados demasiado áspero durante la cosecha o de resuspensión pasos, o pueden haber sido incubadas demasiado tiempo en Tampón A. En segundo lugar, es importante no sobre-homogeneizar las células o el sedimento nuclear, ya que esto cizallar la cromatina y liberar el ADN en la fracción soluble. ADN en la fracción soluble puede interferir con la purificación y el ensayo de los complejos INO80 posterior. En particular, la contaminación de ADN puede conducir a aumento de la formación de precipitados durante la incubación del extracto con anti-FLAG agarosa, reduciendo así la eficiencia de las etapas de lavado y de elución y / o puede aumentar la abundancia de proteínas contaminantes de unión a ADN en la fracción final purificado . Además, las actividades bioquímicas ensayos miden aguas abajo que son dependientes de ADN, por lo tanto el potencial de arrastre de ADN a partir del extracto pueden complicar la interpretación de estos ensayos. Para evitar el exceso de homogeneización, durante la lisis celular, es aconsejable comprobar el porcentaje de células azul de tripano-positivos después de cada carrera del homogeneizador; para células HEK293, cerca de la lisis celular completa requiere típicamente 4 - 6 golpes de homogeneización. Es también es importante para evitar la introducción de burbujas de aire mientras que se homogeneiza. El sobrenadante de 120.000 xg el giro en el Paso 4.2.8 debe ser una solución clara, no viscoso, con sólo una cantidad muy mínima de material viscoso turbio o cerca de la pastilla de la cromatina o flotando en la parte superior. Al recoger el sobrenadante, se debe tener cuidado de no recoger cualquier material turbio o viscoso, ya que puede incluir la cromatina y / o ADN. Por último, es mejor evitar la congelación de las células antes de preparar extractos nucleares, ya que los complejos preparados a partir de células congeladas tienden a exhibir una menor actividad específica y para incluir ADN contaminante y más proteínas.
La relación óptima entre la cantidad de extracto de partida y anti-FLAG agarosa depende de la concentración de la proteína cebo FLAG presente en los extractos y la accessibidad del epítopo FLAG y necesidades a ser determinada empíricamente. Por lo general empezamos inmunopurificación con 100 l de volumen de lecho perlas de agarosa anti-FLAG y 3-14 ml de extracto nuclear; la cantidad de extracto utilizado depende de los objetivos del experimento y la disponibilidad de extracto. Un paso sencillo inmunopurificación usando agarosa anti-FLAG es generalmente suficiente para purificar INO80 o INO80 subcomplexes a un grado adecuado para los ensayos de fiabilidad de sus actividades; sin embargo, puede ser necesaria la etapa (s) de purificación adicional, tal como filtración en gel, sedimentación en gradiente de densidad, o cromatografía de intercambio iónico para la purificación de otros complejos o para eliminar las actividades contaminantes que podrían complicar la interpretación de los ensayos bioquímicos.
Las estrategias descritas aquí deben ser más útil en general para los estudios de otras enzimas remodelación de la cromatina, así como otros grandes complejos multiproteicos. La aplicación exitosa de estas estrategias para el análisis de otros mucomplejos ltiprotein depende de (i) la identificación de un individuo o subunidad subunidad (s) que sirven de andamiaje (s) en el que se reúnen otras subunidades y (ii) la definición de determinados dominios o regiones con los principales subtipos de subunidades ensamblan. La definición de tales dominios se puede facilitar mediante el análisis de la secuencia primaria de la subunidad (s) núcleo andamio para las regiones conservadas evolutivamente o regiones que corresponden a dominios estructurales conocidos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
El trabajo en el laboratorio de los autores es apoyada por una subvención del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (GM41628) y con una donación al Instituto Stowers de Investigación Médica de la Fundación para la Investigación Médica Nelson Helen en la Fundación de la Comunidad metropolitana de Kansas City.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | |||
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
References
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