Generation och rening av mänskliga INO80 Chromatin Remodeling Komplex och subcomplexes

Summary

Detta protokoll beskriver ett förfarande för generering och rening av vild typ och muterade versioner av den mänskliga INO80 kromatin remodeling komplex. Epitopmärkt versioner av INO80 subenheter stabilt uttryckt i HEK293-celler, och komplett komplex och komplex som saknar specifika uppsättningar av subenheter renas genom immunoaffinitetskromatografi.

Abstract

INO80 kromatin remodeling komplex reglerar nukleosom dynamik och DNA tillgänglighet genom att katalysera ATP-beroende nukleosomen ombyggnad. Mänskliga INO80 komplex består av 14 proteinsubenheter inklusive Ino80, en SnF2 liknande ATPas, som fungerar både som den katalytiska subenheten och ställningen för montering av komplexen. Funktioner av andra subenheter och de mekanismer genom vilka de bidrar till INO80 komplexets kromatin remodeling aktivitet fortfarande dåligt kända, delvis på grund av utmaningen att generera INO80 underenheter i mänskliga celler eller heterologa expressionssystem. Denna JOVE protokoll beskriver ett förfarande som tillåter rening av mänskliga INO80 kromatin remodeling subcomplexes som saknas en underenhet eller en del av subenheter. N-terminalt FLAG-epitop taggade Ino80 cDNA stabilt införas i humana embryonala njur (HEK) 293-cellinjer med användning av Flp-medierad rekombination. I händelse av att en delmängd av subenheter av INO80 komplex är till be bort, man uttrycker istället muterade Ino80 proteiner som saknar plattformen som behövs för montering av dessa subenheter. I händelse en enskild subenhet är att vara uttömda, ett transfects siRNA riktar denna subenhet i en HEK 293 cellinje som stabilt uttrycker FLAG taggade Ino80 ATPas. Kärnextrakt är beredda, och FLAG immunfällning utförs för att berika proteinfraktioner som innehåller Ino80 derivat. Kompositionerna renade INO80 subcomplexes kan sedan analyseras med användning av metoder såsom immunblotting, silverfärgning, och masspektrometri. De INO80 och INO80 subcomplexes genereras enligt detta protokoll kan vidare analyseras med hjälp av olika biokemiska analyser, som beskrivs i den medföljande JOVE protokollet. De metoder som beskrivs här kan anpassas för studier av de strukturella och funktionella egenskaper hos alla däggdjur multi subenhet kromatin remodeling och modifierande komplex.

Introduction

Evolutionärt bevarade SnF2 familjen kromatin remodeling komplex är viktiga regulatorer av kromatin organisation och DNA tillgänglighet ^1. Dessa remodeling komplex innefattar alltid en central SnF2 liknande ATPas subenheten, som i vissa fall, monterar med olika accessoriska proteiner och bildar multi-subenheten makromolekylära aggregat. För att studera de molekylära detaljerna i ATP-beroende kromatin remodeling process är det viktigt att förstå bidragen från givna delmängder av subenheter och / eller domän strukturer för verksamheten i komplexen. Sådana analyser kräver förmågan att generera högt renade muterade komplex som saknar särskilda proteinsubenheter eller domänstrukturer.

Föregående struktur-funktionsstudier av ATP-beroende kromatin remodeling komplex har i stor utsträckning fokuserat på jäst modellsystem på grund av den överlägsna manipulability av jästgenomet (se till exempel ref ^1-4). Med tanke på bevarandet avsubenheten sammansättning och funktion bland ortologa remodeling komplex, har studier av struktur och funktion av jäst remodeling komplex gett viktiga insikter i sina motsvarigheter i högre eukaryoter. Ändå existerar märk artspecifika skillnader mellan remodeling komplex, till följd av vinst eller förlust av artspecifika subenheter, vinst eller förlust av arter-specifika domäner av konserverade subenheter och sekvensvariabilitet inom konserverade domäner konserverade subenheter. Sådana skillnader kan i princip drivas av behovet av högre eukaryota celler för att anpassa sig till nya molekylära och cellulära miljöer. Således förstå hur subenheter av högre eukaryota remodeling komplex bidrar till nukleosomen remodelleringsprocessen är värdefull, eftersom det inte bara belyser grundläggande mekanismerna i ATP-beroende kromatin remodeling process, men också kan ge värdefull insikt i de mekanismer genom vilka kromatinstruktur och genuttryck i highennes eukaryoter regleras.

Hittills har det varit endast begränsade strukturella och funktionella studier av multi subenheten däggdjurs kromatin remodeling komplex, delvis beroende på svårigheterna att få biokemiskt definierade kromatin remodeling komplex och subcomplexes. Vi har delvis kringgått dessa svårigheter med de förfaranden som beskrivs nedan, där immunoaffinitetsrening används för att framställa intakta INO80 eller INO80 subcomplexes från mänskliga celler stabilt uttrycker N-terminalt FLAG epitopmärkt vildtyp eller muterade versioner av Ino80 ^5-7 (figur 1) . För att erhålla intakta INO80 komplex från humana celler, är Flp-medierad rekombination användas för att generera transgena HEK293-cellinjer som stabilt uttrycker FLAG-epitop taggade cDNA som kodar subenheter av INO80 komplex ^8-10. Eftersom överuttryck av INO80 subenheterna kan vara något giftig är det nödvändigt att isolera och bibehålla klonala cellinjer vid selektiv conditions att säkerställa stabil transgenexpression under de många passager som behövs för utbyggnaden av storskaliga cellkulturer. För att få mindre INO80 subcomplexes som bara innehåller en delmängd av subenheter har vi framgångsrikt använt två metoder (Figur 2A, B). I det första, vi skapar HEK293 Flp-In cellinjer stabilt uttrycker muterade versioner av Ino80 som saknar domäner som krävs för interaktion med specifika subenheter ^5. Alternativt siRNA-medierad knockdown som används för att tömma den önskade subenheten från celler som uttrycker en lämplig FLAG-märkt INO80 subenhet (opublicerade data). Slutligen, för att rena mänskliga INO80 komplex de är FLAG agaros baserad kromatografi ¹¹ används för att berika ett INO80 fraktion från kärnextrakt, vilket gör att den närvaron av förorenande cytosoliska proteiner i slutfraktion innehållande renade INO80 eller INO80 subcomplexes.

Protocol

1 Generation och kultur i HEK293 Stabil cellinjer som uttrycker full längd eller Mutant versioner av FLAG epitopmärkta Ino80 eller andra INO80 Komplexa Subenheter

1. Klon cDNA kodande fullängd eller mutant human Ino80 ATPas eller annat INO80 subenheten i däggdjursexpressionsvektom pcDNA5 / FRT med en in-frame, N terminal FLAG epitoptag.
2. Bekräfta sekvensen av de insatta cDNAs genom DNA-sekvensering innan du fortsätter.
3. För att utföra transfektionen, växa Flp-ln-HEK293-celler i 10 cm vävnadsodlingsskålar i ett medium innehållande DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium), 5% glutamin och 10% FBS (fetalt bovint serum).
4. När cellerna når ~ 70% konfluens, tillfoga till varje vävnadsodlingsskål av en blandning av 40 pl av FuGENE6 transfektionsreagens, 0,5 | ig av den lämpliga pcDNA5 / FRT-expressionsplasmid, och 9,5 | ig av pOG44, vilken kodar Flp-rekombinas, i en total volym av 800 | il.
5. 48 h senare, trypsinize och sPlit celler vid ett förhållande av 1:30 till 10 cm skålar och odla dem i DMEM med 5% glutamin, 10% FBS och 100 ^ g / ml hygromycin B för 3-4 veckor. Ändra odlingsmedium när den börjar gulna (typiskt var 3 - 5 dagar).
6. För att identifiera positiva kloner som uttrycker den högsta nivån av FLAG-märkt protein väljer individuella hygromycin B-resistenta kolonier och överföra dem till en enda brunn på en 24-brunnar.
   1. När cellerna når 80% konfluens, skörd av celler från varje brunn i ~ 1 ml PBS och pellet genom centrifugering vid 1000 xg under 5 min.
   2. Efter avlägsnande av supernatanten, resuspendera cellpelleten i 60 | il SDS-PAGE-provbuffert.
   3. Ämne halvan av suspenderades cellpelleten till SDS sidan och Western blotting för att övervaka uttryck av FLAG taggade bete protein; spara den andra hälften för framtida analyser.
7. Om ingen FLAG-märkt humant Ino80 proteinet detekteras i cellysat, utöka det ursprungliga kloncell befolkning ytterligare genom utstrykning av celler från enskilda brunnar i en 24-brunnsplatta i 15 cm vävnadsodlingsskålar.
   1. Att skörda celler från 15 cm skålar, resuspendera nära sammanflytande celler i iskall PBS och överför till en 50 ml koniska rör.
   2. Ta till en slutlig volym av 50 ml genom tillsats av ytterligare PBS.
   3. Pellets celler vid 1000 xg under 5 minuter och ta bort så mycket som möjligt av det översta.
   4. Resuspendera cellpelleten i 1 ml Lys450-buffert (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 450 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 10 mM KCl, 4 mM _MgCl2, 0,2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM DTT, 200 | iM PMSF, och 1: 1000 proteasinhibitorcocktail).
      OBS: här och på andra ställen, alltid lägga DTT, PMSF och proteashämmare cocktail till buffertar omedelbart innan ett experiment.
   5. Immuno-fällning FLAG-märkta proteiner från den resulterande helt cellysat med användning av 20 | il av anti-FLAG-agarosgel, och analysera FLAG eluaten genom Western blotting. [För detaljer om Immunoprecipitation förfarande, se steg 5]
8. Förbered frysta lager av önskade klonala cellinjer ¹² och lagra dem i flytande kväve fram till användning.

2. Växande HEK293 cellinjer i rullflaskor

För storskalig framställning av INO80 komplex, kulturceller i 10-20 rullflaskor; ett typiskt utbyte från varje rullflaska är ~ 1 ml packade celler.

1. Till varje rullflaska, tillsätt 200 ml DMEM, 5% glutamin och 10% kalvserum, utan hygromycin B.
2. Överför alla cellerna från en enda nära-konfluent 15 cm skål i varje rullflaska
3. Placera rullflaskor i en 37 ° C rullflaska inkubator och rotera vid 0,2 rpm.
4. När cellerna når ~ 70% confluency, häll av och kassera mediet.
5. Lägg ~ 50 ml iskall PBS till varje flaska. Innehav flaskor horisontellt, snurra försiktigt för att lossa encellsskiktet.
6. Överför resuspenderade cellerna till 250 ml plastic koniska flaskor och placera på is.
7. Skölj rullflaskor med ytterligare PBS, överföra det sekventiellt från flaska till flaska. När sköljlösning inte längre är klar (vanligtvis efter att ha använts för att skölja ca 5 flaskor), lägg till den cellsuspension.
8. Pelletera celler genom centrifugering vid 400 xg under 10 min.
9. Försiktigt resuspendera cellerna i PBS, kombinera dem till en enda 250 ml E flaska, och hålla på is tills vidare behandling.

3 siRNA-medierad Knockdown av INO80 subenheter i celler som uttrycker en annan FLAG-taggade INO80 subenhet

För att få INO80 subcomplexes saknar en enda subenhet, för att använda FLAG-immunorening rena INO80 komplex från siRNA behandlade celler eller celler som stabilt uttrycker shRNA. Den "omvända" siRNA (små störande RNA) transfektion protokoll som beskrivs här är optimerad för HEK293 celler som växer i 15 cm skålar. Protokollet är för en enda 15 cm skål av celler och shoULD skalas upp i enlighet därmed, beroende på det antal celler, som behövs. För att förbereda biokemiskt användbara mängder INO80 komplex från siRNA-behandlade celler, ska man skala upp till kulturer som odlas i 40 15 cm rätter; Dessa kommer att ge ca 2-4 ml packad cellpellet.

1. Väx HEK293-celler som stabilt uttrycker den önskade subenheten av INO80 komplex till nära sammanflytning i 15 cm skålar.
2. Lägg till en volym av av siRNA resuspensionsbuffert (20 mM KCl, 6 mM HEPES-pH 7,5, och 0,2 mM _MgCl2) tillräcklig för att framställa en 50 ^ iM förrådslösning av siRNA till ett rör innehållande lyofiliserad siRNA. Pipettera lösningen upp och ner några gånger och inkubera på en nutator för 30 min vid RT för att säkerställa att siRNA är helt upplöst.
3. Förbered en transfektion cocktail med siRNA och transfektionsreagens. Blanda 10 ìl av 50 ^ M siRNA stamlösning med 32 ul Lipofectamine RNAiMAX och lägga till 4 ml Opti-MEM Reducerat Serum Medium med mycket varsam blandning; fllåg alla reagenser till jämvikt till RT före användning.
4. Inkubera blandningen vid RT under 30 min.
5. Förbered Flp-ln-HEK293-celler som stabilt uttrycker den önskade INO80 subenheten för transfektion.
   1. Under inkubationen i steg 3.4, tvätta celler i cm skålar 15 en gång med RT PBS.
   2. Efter att PBS, behandla celler med 1 ml trypsin bara tills de börjar lyfta av plattan.
   3. Omedelbart tillsätt 10 ml komplett medium (DMEM + 5% glutamin + 10% FBS) för att trypsinbehandlades celler och blanda försiktigt. Samla cellerna genom centrifugering vid 1000 xg under 5 min vid RT.
   4. Resuspendera cellpelleten i ~ 4 ml komplett medium, och räkna cell resuspension med hjälp av en hemocytometer.
   5. Späd celler med komplett medium till en koncentration av ~ 5,4 x 10 ⁶ / ml.
6. Till varje 15 cm skål, tillsätt 15 ml komplett odlingsmedium följt av 4 ml transfektion cocktail. Snurra försiktigt så att mediet och transfektion cocktail är thoroughly blandade. Slutligen till en ml cellsuspension och återigen snurra försiktigt för att skingra celler jämnt.
7. Efter 60 timmar av kultur i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator, försiktigt bort medium, resuspendera cellerna i iskall PBS, och omedelbart gå att förbereda kärnextrakt.

4 Beredning av kärnextrakt

Detta förfarande har modifierats protokollet av Dignam ¹³ och kan skalas upp eller ner beroende på storleken av startcellpellets. Typiskt 1 ml packade cellpellets ger 1 ml av den slutliga kärnextrakt. Alla buffertar bör vara iskall och alla steg bör utföras i ett kylrum eller på is, om en lämplig kylrum är inte tillgänglig.

1. Isolering av kärnor:
   1. Överföra försiktigt celler till en lämplig storlek (15 eller 50 ml) graderad koniskt rör och snurra vid 1000 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
   2. Avlägsna supernatanten och mäta volymen av den packade cell pellåt. 1 ml packade celler motsvarar ~ 3 x 10 ⁸ HEK293 celler.
   3. Lägg 5 packade cellvolymer av Buffert A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM _MgCl2, 10 mM KCl och färskt tillsatt 1 mM DTT, 200 | iM PMSF och 1: 1000 proteasinhibitorcocktail). Resuspendera cellpelleten genom försiktig pipettering.
   4. Inkubera på is under exakt 10 min.
   5. Pellets cellerna vid 1000 xg under 10 min vid 4 ° C och avlägsna supernatanten.
   6. Storleken på cellpelleten bör öka upp till 2-faldigt under inkubation i buffert A.
   7. Resuspendera cellerna i två packade cellvolymer buffert A, och överföra cellsuspensionen till en lämplig storlek Dounce vävnadshomogenisator. Om att börja med mindre än 2 ml packade celler, använd en 7 ml sator; för 2 - 4 ml packade celler, använd en 15 ml sator; och för 10 eller fler ml packade celler, använd en 40 ml homogenisator.
   8. Homogeni cellsuspensionen med LOOSE glasmortelstöt av Dounce homogenisator until 90% av cellerna färgas positivt med 1% trypanblått.
   9. Flytta suspensionen till en 45 ml höghastighetståg centrifugrör och centrifugera vid 25.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C i en JA-17 eller liknande rotor (se tabell för material / utrustning).
   10. Från den nukleära pelleten, avlägsna supernatanten, som innehåller cytosoliska proteiner eller proteiner som läcker ut ur kärnan under fraktionering.
2. Extrahera kärnor med salt:
   1. Lägg buffert C (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% glycerol, 1,5 mM _MgCl2, 0,2 mM EDTA och färskt tillsatt 1 mM DTT, 200 | iM PMSF, och 1: 1000 proteasinhibitorcocktail) till den nukleära pelleten; Använd 2,5 ml buffert C för varje 3 ml start packad cellvolym (~ 1 x 10 ⁹ celler).
   2. Med hjälp av en glasstav eller en pipett, rubba den nukleära pelleten från väggen av röret och överför hela blandningen till en Dounce homogenisator av lämplig storlek.
   3. Resuspendera kärnor genom homogenisering the blandning med två slag av en lös mortelstöt.
   4. Överför återsuspenderades nukleära fraktionen i ett kylt bägare. Välj en bägare, så att suspensionen kommer att fylla bägaren till minst 0,5 cm djup.
   5. För att extrahera nukleära proteiner från kromatin eller andra olösliga strukturer, gradvis öka saltkoncentrationen av suspensionen till 0,42 M NaCl genom droppvis tillsats av 5 M NaCl under lätt omröring suspensionen med en pipett eller glasstav på is; en gång alla av 5 M NaCl har tillsatts bör lösningen blivit mycket viskös eller gel-liknande. Beräkna volymen av 5 M NaCl som krävs för att bringa lösningen till en slutkoncentration av 0,42 M NaCl i enlighet med följande formel:
      
   6. Försiktigt överföra viskösa suspensionen i 10 ml polykarbonatrör för en typ 70,1 Ti rotor (eller motsvarande) eller 70 ml polykarbonatflaskor för en typ 45 Ti or liknande rotor (se tabell för material / utrustning). Täta ordentligt med parafilm om du använder 10 ml rör eller med lockenhet om du använder 70 ml flaskor.
   7. Långsamt rocka de förseglade rören vid 4 ° C under 30 minuter med hjälp av en nutator.
   8. Spin proverna i en typ 45 Ti eller 70,1 Ti-rotor under 30 min vid 120.000 xg vid 4 ° C.
   9. Överför supernatanten till ett enda plaströr eller flaska. Denna supernatant är kärnextrakt, och pelleten innehåller kromatin och annan kärnteknisk skräp.
   10. Dela upp kärnextrakt i bekvämt dimensionerade portioner, fryser den i flytande kväve, och förvara den vid -80 ° C.

5. immunoaffinitetsrening av Human INO80 eller INO80 subcomplexes

1. För att tina frysta kärnextrakt, placera rör innehållande extraktet på stationär eller rullrören mellan händerna tills det frusna materialet blir en slurry. Placera sedan rören på is eller i kylrummet tills extraktet är helt thawed.
2. Överför den tinade nukleära extraktet till 10 ml polykarbonat ultracentrifugrör, och centrifugera vid 100.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C i en typ 70,1 Ti-rotor eller motsvarande för att avlägsna eventuell utfällning som kan ha bildats under frysnings-upptiningscykel.
3. Överför supernatanten till ett 15 ml koniskt rör. Lägg färsk DTT, PMSF, och proteasinhibitorcocktail till slutkoncentrationer av 1 mM DTT, 200 | iM PMSF, och 1: 1000 proteasinhibitorcocktail.
4. För att framställa anti-FLAG agaros för immunorening, överför 200 pl 50% slurry av anti-FLAG agarospärlor till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med hjälp av en P200 eller liknande pipett med ett tips från vilken ände har skurits av med en ren skalpell eller rakblad.
5. Pellets pärlorna genom centrifugering i en bänk mikro vid 8000 xg under 30 sek. Avlägsna supernatanten och tvätta pärlorna genom att återsuspendera pärlorna i 1 ml Lys450 buffert och pelletera pärlorna vid 8000 x g under 30 sek. Tvätta bEADS två gånger till.
6. Resuspendera tvättade anti FLAG agarospärlor i ca 100 l av det nukleära extraktet med hjälp av en P200 eller liknande justerbar volym pipett med ett tips från vilken ände har skurits av med en ren skalpell eller rakblad och med samma spets, överföring de återsuspenderade kulorna till 15 ml koniska rör som innehåller extraktet. Upprepa några gånger tills alla pärlorna har överförts till de 15 ml tub.
7. Inkubera extraktet / kornsblandningen i 4 h vid 4 ° C med långsam rotation på en laboratorie rotator. VALFRITT: Include Benzonase vid en koncentration av 25 enheter / ml för att avlägsna kontaminerande DNA.
8. Samla FLAG agarosen genom centrifugering vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C.
9. Återsuspendera i 10 ml Lys450 att tvätta, inkubera 5 min vid 4 ° C med försiktig skakning på en nutator. Pellets pärlor vid 1000 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
10. Resuspendera i 100-150 l av Lys450 och överföra pärlor till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Continue att skölja 15 ml koniska rör med 100-150 pl av Lys450 tills alla pärlorna har överförts till mikrocentrifugrör.
11. Centrifugera ner pärlorna vid 8000 x g under 30 sek vid 4 ° C i en mikrocentrifug. Tvätta tre gånger mer med 1 ml Lys450 och en gång med 1 ml EB100 buffert (10 mM HEPES pH 7,9, 10% glycerol, 100 mM NaCl, 1,5 mM _MgCl2, 0,05% Triton X-100, och färskt tillsatt 1 mM DTT, 200 | iM PMSF , och 1: 1000 proteasinhibitorcocktail).
12. För att eluera bundna proteiner, tillsätt 200 | il EB100 buffert innehållande 0,25 mg / ml 1x FLAG-peptiden. Inkubera 30 min vid 4 ° C vardera på en nutator.
13. Pellets pärlor vid 8000 xg under 30 sek vid 4 ° C i en mikrocentrifug. Överför supernatanten, vilken innehåller den eluerade INO80 komplex, till ett färskt mikrocentrifugrör.
14. Upprepa eluering fyra gånger, och slå samman alla supernatanterna till ett enda rör.
15. För att avlägsna eventuella kvarvarande FLAG-agarospärlor från den eluerade proteinfraktionen,passera eluatet genom ett tomt spinnkolonn.
16. Koncentrera den eluerade proteinfraktionen ~ 10-faldigt med användning av en ultracentrifugeringsfilteranordning (50.000 molekylviktsgräns).
17. För att ta bort FLAG-peptiden, passera den koncentrerade proteinfraktionen i följd genom två avsaltningskolonner.
18. Dividera det renade, avsaltade proteinfraktion till 20 | il alikvoter, frystes i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C.
19. Analysera subenheten sammansättning INO80 eller INO80 subcomplexes på silverfärgade geler eller genom western blotting, och uppskatta deras koncentrationer av semikvantitativ western blotting med hjälp av preparat av rekombinanta INO80 subenheter av känd koncentration som standarder.

Representative Results

Figur 1 visar ett flödesschema som sammanfattar de metoder som används för att generera, rena och karakterisera mänskliga INO80 ATP-beroende kromatin remodeling komplex.

Såsom illustreras i figurerna 2 och 3, är dessa förfaranden möjliggör alstringen av både vilda typen INO80 och INO80 subcomplexes som saknar olika subenheter, vilket därigenom möjliggör efterföljande biokemiska analyser av bidraget av dessa saknade subenheterna till INO80 s enzymatiska aktiviteter. Figur 2 beskriver två strategier som vi har används för att definiera strukturen för INO80 komplex och att generera INO80 subcomplexes. I det första, som visas i figur 2A, är intakta INO80 komplexen renades genom FLAG-taggade versioner av vildtyp subenheter (Ies2 eller INO80E). Subcomplexes kan renas genom epitop-märkta versioner av mutanta Ino80 proteiner som saknar enskilda domäner på vilka olika uppsättningar av underenheter ASSEMble. Såsom visas i figur 3A, är renheten hos de resulterande komplexen bestämdes med användning av silverfärgad SDS-polyakrylamidgeler, medan sammansättningen av komplexen bedöms med användning av western blotting med antikroppar mot olika INO80 subenheter (Figur 3B) eller genom masspektrometri (data ej visad). Genom att använda denna metod, fann vi att de subenheter som visas i rött i figur 2A förlorades vid radering av Ino80 NTD (N-terminal domän); subenheter som visas i blått förlorades vid radering av Ino80 HSA (Heli SANT Associated) domän; och att SnF2 ATPas-domänen, som består av SNF2N och HelicC regioner (lila) åtskilda av en lång insättnings region (vit), var nödvändig och tillräcklig för att binda till subenheter som visas i lila. Sålunda INO80 subcomplexes (INO80ΔN.com eller INO80ΔNΔHSA.com) som saknar antingen underenheterna som visas i rött eller subenheter som visas i rött och blått kan renas genom FLAG-Ino80ΔN eller FLAG-INO80ΔNΔHSA, respektive ^5.

Det är också möjligt att generera subcomplexes genom nedbrytande enskilda subenheter från celler som uttrycker ett lämpligt FLAG-märkt INO80 subenhet (opublicerade resultat). I det första exemplet som visas i fig 2B, siRNA-förmedlad knockdown av subenhet X utarmar endast X från INO80 komplex, vilket antyder X krävs inte för montering av andra subenheter i INO80. I den andra och tredje exemplen, leder siRNA knockdown av antingen Y eller Z till co-utarmning av både Y och Z-subenheter, vilket tyder på Y och Z montera in den INO80 komplex i ett ömsesidigt beroende sätt.

. Figur 1 flödesschema som beskriver förfaranden som används för att generera, rena och karakterisera mänskliga INO80 ATP-beroende kromatin remodeling komplex F, en N-terminal in-frame FLAG-epitop tag; Indiens myndigheter, Gene-of-intresse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 Diagram som visar de två strategier som används för att generera INO80 subcomplexes som innehåller en delmängd av subenheter. (A) Den Ino80 ATPas innehåller regioner som fungerar som modulära byggnadsställning på vilken de andra INO80 subenheter montera. (B) siRNA-förmedlad knockdown kan användas för att utarma den önskade subenheten (X eller Y eller Z) från celler som uttrycker ett lämpligt FLAG- taggade INO80 subenhet (t.ex. FLAG-Ino80ΔN). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 Analys av sammansättningen av immunrenat INO80 komplex och subcomplexes. (A) INO80 komplex eller subcomplexes renades från celler som stabilt uttrycker de indikerade FLAG-taggade proteinerna, utsattes för SDS-polyakrylamidgelelektrofores och visualiserades genom silverfärgning. Provet i den högra körfältet framställdes från parentala 293-celler som uttrycker ingen FLAG-märkt protein; proteiner som förekommer i denna styr körfält är föroreningar som binder ospecifikt till FLAG-agaros. Etiketter på vänster indikerar band motsvarande flera INO80 subenheter, och de till höger mobilitet för molekylviktsmarkörer. Positionen för vildtyp Ino80 indikeras av den svarta rektangeln och positionerna för Ino80 mutanter anges med öppna cirklar. Banorna åtskilda av den svarta linjen är från separata geler. (B) INO80 komplex och subcomplexes analyserades genom western blottinganvändning av antikroppar mot representativa subenheter av NTD, HSA och SnF2 moduler. Denna forskning publicerades ursprungligen i The Journal of Biological Chemistry. Chen m.fl., Subunit organisation Human INO80 Chromatin Remodeling Complex. Ett evolutionärt bevarat Kärna Complex katalyserar ATP-beroende nukleosomen remodeling. The Journal of Biological Chemistry Vol 286: pp. 11.283-11.289. © 2011, av American Society for biokemi och molekylärbiologi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Strukturella och funktionella studier av multi subenheten däggdjurs kromatin remodeling komplex från högre eukaryoter har hindrats av att det är svårt att förbereda biokemiskt användbara mängder av sådana komplex som innehåller muterade subenheter eller saknar vissa subenheter helt och hållet. Det finns ett antal tekniska hinder: det första har genmanipulation i däggdjursceller varit tekniskt utmanande och tidskrävande. Till skillnad från jästceller, vars genom kan lätt redigeras och målinriktad användning av recombineering tekniker är däggdjursgenomet mer strukturellt komplexa och mindre mottagliga för recombineering interventioner. Således är strykning eller ändring av däggdjursgener i odlade celler eller djur mer tidskrävande och kräver mer specialistkompetens. Som en konsekvens, har genereringen av mutanta däggdjurskomplex bär strukturella mutationer eller saknar delmängder av subenhet (er) varit hastighetsbegränsande. För det andra närmar biokemiska beredning med hjälp heterologous proteinuttryckssystem används ofta för att alstra definierade flerproteinaggregaten. Men sådana tillvägagångssätt blivit tekniskt utmanande för mycket stora komplex, vars subenheter kan behöva samtidigt uttryckt i korrekt stökiometri och / eller för att monteras i en viss ordning, med hjälp av specifika kaperoner eller kofaktorer. Dessa problem är särskilt allvarligt när det gäller den INO80 komplex, eftersom dess Ino80 ATPas subenhet är särskilt svårt att uttrycka i insekt eller E. coli-celler i biokemiskt användbara mängder. I studier av INO80 kromatin remodeling komplex, har det varit möjligt att kringgå vissa av dessa utmaningar genom att använda de strategier som beskrivs i detta protokoll.

Generera humana cellinjer stabilt uttrycker epitopmärkt subenheter av INO80 komplex är ett viktigt steg i detta förfarande, eftersom den möjliggör rening av väldefinierade kromatin remodeling komplex som kan testas med hjälp av olika biokemiska enssays. Även om det i princip är mer tidskrävande att generera stabila cellinjer än att använda transient transfektion för att leverera manipulerade cDNA i däggdjurscellinjer för produktion av rekombinant protein, lider transient transfektion av flera nackdelar. Först-in DNA i form av en transient extrakromosomal vektor är kortlivad och oftast kan inte självpropagerar under cellcykeln. För det andra, transfektionseffektiviteten varierar kraftigt beroende på celltyp och odlingsbetingelser. Heterogena transfektion kan orsaka en mosaik uttrycksmönster som ger en selektiv tillväxt fördelar eller nackdelar inom cellpopulationen. Sålunda transient introducerade transgener tenderar att gå vilse under de många cellpassager som krävs för att generera den stora mängden av celler som behövs för rening av biokemiskt användbara mängder av proteinet. Stabila cellinjer är vanligast genereras med användning av förfaranden som resulterar i slumpmässig integration av cDNA som kodar för ett proteinav intresse. Emellertid kan slumpmässigt integrerade cDNAs störa uttrycket av endogena gener och är föremål för geners uttryck med flera cellpassager. Av dessa skäl, introducerar vi typiskt Ino80 cDNA in i celler med användning av Flp-förmedlad rekombination-teknik, i vilken cDNA är stabilt införlivad i en specifik kromosomal plats via Flp-rekombinas-förmedlad insättning i en enda FRT-säte integreras stabilt i genomet.

Under valet av stabila cellinjer, är det viktigt att kunna detektera exogent uttryckt, FLAG-märkt, vildtyp eller muterade Ino80 proteiner. Eftersom FLAG-märkt Ino80 proteinet uttrycks ofta på mycket låga nivåer och är därför svårt eller omöjligt att detektera med western blotting i råa lysat av celler som odlas i en enda brunn i en 24-brunnars platta, är det ofta nödvändigt att utvidga det ursprungliga klon cellpopulationen före screening för uttryck av Ino80 proteinet. FLAG-märkt Ino80 proteinet kan sedan renas och concentrated av FLAG immunorening före analys med Western blotting.

Effektiviteten av siRNA-förmedlad knockdown är ganska känslig för celltäthet vid tiden för transfektion; Vi fann att knockdown effektiviteten minskade vid transfektioner utfördes med celler på andra platser än som rekommenderas i protokollet tätheter. Den optimala tid för siRNA transfektion är rörlig och måste bestämmas empiriskt för varje målprotein, eftersom det beror på stabiliteten i målproteinet, omsättningshastigheten av riktade protein i proteinkomplex, och i vilken grad proteinet är väsentligt för cellviabilitet. Som ett alternativ till användningen av övergående transfektion av siRNA till bryter individuella subenheter, kan man önska att överväga att generera cellinjer som stabilt uttrycker shRNAs under selektivt tryck som det kan vara enklare och mer kostnadseffektivt att växa biokemiskt användbara mängder av sådana cellinjer. Det kan emellertid visa sig vara svårtatt få tillräcklig knockdown använder shRNA-medierad knockdown i stabila cellinjer.

Också nyckeln till framgång för vårt förfarande är användning av nukleära extrakt som utgångsmaterial för rening av INO80 komplex. Vi har funnit att immunrenat INO80 komplex från helcellextrakt ofta förorenade med ATPas och / eller nukleosomen remodeling aktiviteter som är oberoende av Ino80 ATPas; sådan förorening är till stor del undvikas när komplex renas från kärnextrakt.

Framställning av kärnextrakt och isolering av intakta INO80 komplex beror på ett antal kritiska faktorer. För det första bör de celler som används för att framställa kärnextrakt vara intakt och frisk. Den tvättade cellpelleten förväntas att svälla upp till två-faldigt efter inkubation i hypoton buffert A. Om celler inte sväller och / eller supernatanten blir grumlig vid detta steg, utgångs population av celler kan ha varit ohälsosamt. Alternativt, Celler kan ha hanterats alltför grovt under skörd eller resuspension steg, eller de kan ha odlades för länge i buffert A. För det andra är det viktigt att inte över-homogenisera cellerna eller kärn pellets, eftersom detta kommer att skjuva kromatin och frigöra DNA i den lösliga fraktionen. DNA i den lösliga fraktionen kan störa efterföljande rening och analys av INO80 komplex. I synnerhet kan kontaminerande DNA leder till ökad bildning av fällningar under inkubering av extraktet med anti-FLAG agaros, och därigenom minska effektiviteten av tvätt-och eluerings-steg och / eller kan öka förekomst av kontaminerande DNA-bindande proteiner i den slutliga renade fraktionen . Dessutom kan nedströms biokemiska analyser mäter verksamheter som är beroende av DNA, alltså den potentiella överföring av DNA från extraktet vårar tolkningen av dessa analyser. För att undvika över homogenisering, är det lämpligt under cellysis att kontrollera hur många procent av trypanblått-positiv cells efter varje slag av homogenisator; för HEK293 celler, kräver nästan fullständig cellysering normalt 4-6 slag av homogenisering. Det är också viktigt att undvika att införa luftbubblor under homogenisering. Supernatanten från 120.000 xg spin i steg 4.2.8 bör vara en tydlig, icke-viskös lösning, med endast en mycket liten mängd grumlig eller viskösa material i närheten av kromatin pellet eller flytande ovanpå. När samla supernatanten bör man se till att inte samla in några av grumlig eller trögflytande material, eftersom det kan innehålla kromatin och / eller DNA. Slutligen är det bättre att undvika frostceller innan du förbereder kärnextrakt, eftersom komplex framställda från frusna celler tenderar att uppvisa lägre specifik aktivitet och att inkludera mer förorenande DNA och proteiner.

Det optimala förhållandet mellan mängden utgångs extrakt och anti-FLAG agaros beror på koncentrationen av den FLAG betesprotein närvarande i extrakten och accessibihet av FLAG-epitopen och behov som skall bestämmas empiriskt. Vi börjar oftast immunorening med 100 ul bäddvolym av anti-FLAG agaroskulor och 3-14 ml kärnextrakt; mängden extrakt som används beror på målen för försöket och tillgången på extrakt. Ett enda steg immunorening användning av anti-FLAG agaros är vanligtvis tillräckligt för att rena INO80 eller INO80 subcomplexes till en grad tillräcklig för tillförlitlig analys av deras verksamhet; emellertid kan ytterligare reningssteg (n), såsom gelfiltrering, densitetsgradient sedimentering, eller jonbyteskromatografi behövas för rening av andra komplex eller för att avlägsna kontaminerande aktiviteter som kan komplicera tolkningen av biokemiska analyser.

Strategierna beskrivs här bör vara mer generellt användbara för studier av andra kromatin remodeling enzymer och andra stora multiproteinkomplex. Framgångsrik tillämpning av dessa strategier för analys av andra multiprotein komplex beror på (i) identifiera enskilda underenhet eller underenhet (er) som fungerar som klätterställning (er) på vilken andra subenheter montera och (ii) definitionen av specifika domäner eller regioner med vilka specifika undergrupper av subenheter samlas. Definitionen av sådana domäner kan underlättas genom att analysera den primära sekvensen av kärnan schavotten subenhet (er) för evolutionärt konserverade regioner eller regioner som motsvarar kända strukturella domäner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cellgro	10-013-CV
Glutamax-I (stablized glutamine)	Life Technologies	35050-079
Fetal Bovine Serum	SAFC	12176C
FuGENE6 transfection reagent	Promega	E2312
Hygromycin B, sterile in PBS	AG Scientific	H-1012-PBS
pcDNA5/FRT vector	Life Technologies	V6010-20
Flp-In HEK293 cells	Life Technologies	R780-07
pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector	Life Technologies	V600520
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	F2426
calf serum	SAFC	12138C
TARGETplus SMARTsiRNA pool	Dharmacon / Thermo Scientific	various
5x siRNA resuspension buffer	Dharmacon / Thermo Scientific	#B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Life Technologies	51985-091
PBS	Cellgro	45000	VWR
TrypLE (trypsin)	Life Technologies	12604
1x FLAG Peptide	Sigma	F3290
Micro Bio-Spin Chromatography Column	Bio-Rad	737-5021
Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)	Amicon	UFC805024	Fisher Scientific
Zeba Desalting Columns	Thermo Scientific	89882
Anti-FLAG M2 antibody, mouse	Sigma	F3165
Anti-FLAG M2 antibody, rabbit	Sigma	F7425
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340
benzonase	Novagen	70664
Equipment
JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge	Beckman-Coulter	339080
JA-17 rotor	Beckman-Coulter	369691
10 ml polycarbonate tubes	Beckman-Coulter	355630
70 ml polycarbonate bottles	Beckman-Coulter	355655
Type 45 Ti rotor	Beckman-Coulter	339160
Type 70.1 Ti rotor	Beckman-Coulter	342184
BD Clay Adams Nutator Mixer	BD Diagnostics	15172-203	VWR
Glas-Col Tube/Vial Rotator	Glas-Col	099A RD4512
PCR thermal cycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
roller bottle incubator	Bellco biotechnology	353348
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes	Costar	3207