Summary
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til generering og oprensning af vildtype og mutant-versioner af humane INO80 kromatin remodellering kompleks. Epitop taggede versioner af INO80 underenheder stabilt udtrykt i HEK293-celler, og komplette komplekser og komplekser mangler specifikke sæt af underenheder oprenses ved immunaffinitetskromatografi.
Abstract
INO80 kromatin remodeling komplekser regulerer nukleosom dynamik og DNA tilgængelighed ved at katalysere ATP-afhængig nukleosom remodeling. Menneskelige INO80 komplekser består af 14 proteinunderenheder herunder Ino80, en SnF2-lignende ATPase, der tjener både som den katalytiske underenhed og stilladset til samling af komplekserne. Funktioner af de andre underenheder og de mekanismer, som de bidrager til INO80 kompleksets kromatin remodellering aktivitet forbliver dårligt forstået, delvis på grund af den udfordring, at skabe INO80 delkomponenter i humane celler eller heterolog ekspression systemer. Denne JOVE protokol beskriver en procedure, der tillader oprensning af humane INO80 kromatin remodeling subcomplexes, der mangler en underenhed eller en delmængde af underenheder. N-terminalt FLAG-epitop-tagget Ino80 cDNA stabilt indført i human embryonisk nyre (HEK) 293-cellelinjer under anvendelse Flp-medieret rekombination. I tilfælde af, at en delmængde af underenheder af INO80 komplekset er til be slettet, man udtrykker i stedet mutant Ino80 proteiner, der mangler platformen nødvendig til samling af disse underenheder. I tilfælde af en individuel underenhed er at være udtømt, én transfects siRNA'er målrettet mod denne subunit i en HEK 293 cellelinje stabilt udtrykker FLAG tagget Ino80 ATPase. Kerneekstrakter fremstilles, og FLAG immunoprecipitation udføres for at berige protein fraktioner indeholdende Ino80 derivater. Præparaterne rensede INO80 subcomplexes kan derefter analyseres under anvendelse af fremgangsmåder, såsom immunoblotting sølvfarvning og massespektrometri. De INO80 og INO80 subcomplexes tilvejebragt efter denne protokol kan analyseres yderligere ved anvendelse af forskellige biokemiske analyser, som er beskrevet i den ledsagende JOVE protokollen. De her beskrevne metoder kan tilpasses til studier af de strukturelle og funktionelle egenskaber ved et pattedyr multi-subunit kromatin remodellering og ændring komplekser.
Introduction
Evolutionært bevaret SnF2 familien kromatin remodeling komplekser er vigtige regulatorer af kromatin organisation og DNA tilgængelighed 1. Disse remodeling komplekser indbefatter altid en central SnF2-lignende ATPase-underenhed, som i nogle tilfælde samles med forskellige accessoriske proteiner og danner multi-subunit makro-molekylære samlinger. For at undersøge de molekylære detaljer af ATP-afhængig chromatin remodeling proces, er det vigtigt at forstå bidragene af givne delmængder af underenheder og / eller domænestrukturer aktiviteter af komplekserne. Sådanne analyser kræver evnen til at generere højt oprensede mutant komplekser, der mangler bestemte proteinunderenheder eller domæne strukturer.
Tidligere struktur-funktionsundersøgelser af ATP-afhængige chromatin remodeling komplekser har vidt fokuseret på gærmodel system på grund af den overlegne manipulabilitet af gær-genomet (se for eksempel ref 1-4). I betragtning af bevarelsen afunderenhed sammensætning og funktionalitet blandt ortologe remodeling komplekser, har undersøgelser af struktur og funktion af gær remodeling komplekser forudsat vigtig indsigt i deres modparter i højere eukaryoter. Ikke desto mindre mærkbare artsspecifikke forskelle blandt remodeling komplekser, der findes, som følge af gevinst eller tab af artsspecifikke subunits, gevinst eller tab af artsspecifikke domæner af konserverede underenheder, og sekvensvariabilitet inden konserverede domæner af bevarede underenheder. Sådanne forskelle kan i princippet være drevet af behovet for højere eukaryote celler til at tilpasse sig nye molekylære og cellulære miljøer. Således at forstå, hvordan underenheder af højere eukaryote remodeling komplekser bidrager til nukleosom remodeling processen er værdifuld, fordi det ikke kun kaster lys over de grundlæggende mekanismer i ATP-afhængig kromatin remodellering proces, men også kan give værdifuld indsigt i de mekanismer, som kromatin struktur og genekspression i highendes eukaryoter reguleres.
Hidtil har der kun været begrænset strukturelle og funktionelle studier af multi-subunit pattedyr kromatin remodeling komplekser, dels på grund af de vanskeligheder med at opnå biokemisk definerede kromatin remodeling komplekser og subcomplexes. Vi har delvist omgået disse vanskeligheder med de procedurer, der er beskrevet nedenfor, hvor immunaffinitetsoprensning anvendes til at fremstille intakte INO80 eller INO80 subcomplexes fra humane celler stabilt udtrykker N-terminalt FLAG epitopmærket vildtype eller mutant versioner af Ino80 5-7 (figur 1) . For at opnå intakte INO80 komplekser fra humane celler, er Flp-medieret rekombination anvendes til at generere transgene HEK293 cellelinjer, der stabilt udtrykker FLAG epitop-tagget cDNA'er, der koder underenheder af INO80 kompleks 8-10. Da overekspression af INO80 underenheder kan være noget giftigt, er det nødvendigt at isolere og opretholde klonale cellelinjer under selektiv cold at sikre en stabil transgenekspression i løbet af de mange passager, der er nødvendige til ekspansion af store cellekulturer. For at opnå mindre INO80 subcomplexes, der kun indeholder en delmængde af underenheder, har vi med succes anvendt to fremgangsmåder (figur 2A, B). I den første, vi genererer HEK293 Flp-In-cellelinier stabilt udtrykker mutant versioner af Ino80 der mangler domæner, der kræves for samspil med specifikke underenheder 5. Alternativt er siRNA-medieret knockdown anvendes til at udtømme den ønskede subunit fra celler, der udtrykker en passende FLAG-mærkede INO80 underenhed (upublicerede data). Endelig, for at rense de menneskelige INO80 komplekser FLAG agarose baseret chromatografi 11 anvendes til at berige en brøkdel INO80 indeholdende fra kerneekstrakter, derved effektivt at reducere tilstedeværelsen af kontaminerende cytosolproteiner i den endelige fraktion med rensede INO80 eller INO80 subcomplexes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generation og kultur HEK293 Stabil cellelinjer, der udtrykker fuld længde eller Mutant versioner af FLAG Epitopmærket Ino80 eller andre INO80 Komplekse Underenheder
- Klon cDNA, der koder fuld længde eller mutant menneskelig Ino80 ATPase eller en anden INO80 underenhed i den mammale ekspressionsvektor pcDNA5 / FRT med en i-ramme, N-terminale FLAG-epitop-tag.
- Bekræft rækkefølgen af de indsatte cDNA'er ved DNA-sekventering, før du fortsætter.
- For at udføre transfektionen vokse Flp-in HEK293-celler i 10 cm vævskulturskåle i et medium indeholdende DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium), 5% glutamin og 10% FBS (føtalt bovint serum).
- Når cellerne når ~ 70% sammenflydning, tilsættes til hver vævsdyrkningsskål en blanding af 40 pi FuGENE6 transfektionsreagens, 0,5 ug af det passende pcDNA5 / FRT ekspressionsplasmid, og 9,5 ug af pOG44, der koder for Flp-rekombinase, i et samlet volumen 800 ul.
- 48 timer senere, Trypsinisér og filtreplit celler i et forhold på 1:30 i 10 cm skåle, og dyrke dem i DMEM med 5% glutamin, 10% FBS, og 100 ug / ml hygromycin B i 3 - 4 uger. Skift dyrkningsmediet, når det begynder at dreje gul (typisk hvert 3 - 5 dage).
- At identificere positive kloner, der udtrykker det højeste niveau af FLAG-mærkede protein, vælge individuelle hygromycin B-resistente kolonier og overføre dem til en enkelt brønd i en plade med 24 brønde.
- Når cellerne når 80% konfluens høst af celler fra hver brønd i ~ 1 ml PBS og pellet ved centrifugering ved 1000 x g i 5 min.
- Efter fjernelse af supernatanten, resuspender cellepelleten i 60 pi SDS-PAGE-prøvebuffer.
- Emne halvdel af resuspenderet cellepellet til SDS side og western blotting til at overvåge ekspression af FLAG mærkede agn protein; gemme den anden halvdel for fremtidige analyser.
- Hvis der ikke registreres nogen FLAG-tagget humant Ino80 protein i cellelysater, udvide den oprindelige klonal celle popuning yderligere ved udpladning celler fra enkelte brønde i en 24-brønds plade i 15 cm vævskulturskåle.
- At høste celler fra 15 cm skåle, resuspender nær sammenflydende celler i iskoldt PBS og overføres til en 50 ml konisk rør.
- Bring til et slutvolumen på 50 ml ved tilsætning af yderligere PBS.
- Pellet cellerne ved 1.000 xg i 5 min, og fjerne så meget som muligt af supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml af Lys450-buffer (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 450 mM NaCI, 0,5% Triton X-100, 10 mM KCI, 4 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM DTT, 200 uM PMSF og 1: 1.000 proteasehæmmer Cocktail).
BEMÆRK: her og andre steder, altid tilføje DTT, PMSF og proteasehæmmer cocktail til buffere umiddelbart før du begynder et eksperiment. - Immuno-bundfald FLAG-mærkede proteiner fra den resulterende helcellelysat anvendelse af 20 pi anti-FLAG agarosegel, og analysere FLAG eluaterne ved Western blotting. [Yderligere oplysninger om Immunoprecipitation procedure, se trin 5.]
- Forbered frosne lagre af ønskede kloncellelinjer 12 og gemme dem i flydende kvælstof indtil brug.
2. Voksende HEK293 cellelinier rulleflasker
Til fremstilling af INO80 komplekser i stor skala, dyrkning af celler i 10 - 20 rulleflasker; et typisk udbytte fra hver rulleflaske er ~ 1 ml pakkede celler.
- Til hver rulleflaske, der tilsættes 200 ml DMEM, 5% glutamin og 10% kalveserum, uden hygromycin B.
- Overfør alle cellerne fra en enkelt næsten sammenflydende 15 cm skål i hver rulleflaske
- Sted rulleflasker i et 37 ° C rulleflaske inkubator og rotere ved 0,2 rpm.
- Når cellerne når ~ 70% konfluens, hæld og kassere mediet.
- Tilføj ~ 50 ml iskold PBS til hver flaske. Holding flasker horisontalt, forsigtigt hvirvel at løsne cellemonolaget.
- Overfør resuspenderede celler til 250 ml plastic koniske flasker og sted på is.
- Skyl rulleflasker med ekstra PBS, overføre det sekventielt fra flaske til flaske. Når skylleopløsning ikke længere er klar (typisk efter at være blevet anvendt til at skylle omkring 5 flasker), tilføje det til cellesuspensionen.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 400 xg i 10 min.
- Forsigtigt opblande cellerne i PBS, samler dem i en enkelt 250 ml konisk flaske og opbevar på is, indtil yderligere behandling.
3. siRNA-medieret Knockdown af INO80 Underenheder i celler, der udtrykker et andet flag-mærkede INO80 Subunit
For at opnå INO80 subcomplexes mangler en enkelt underenhed, til brug FLAG-immunrensning rense INO80 komplekser fra siRNA behandlede celler eller celler stabilt udtrykker shRNA. Den "omvendt" siRNA (lille interfererende RNA) transfektionsprotokol beskrevet her er optimeret til HEK293 celler, der vokser i 15 cm skåle. Protokollen er for en enkelt 15 cm skål af celler og shoULD skaleres op i overensstemmelse hermed afhængigt af antallet af celler, der er nødvendige. For at forberede biokemisk nyttige mængder af INO80 komplekset fra siRNA-behandlede celler, bør man skalere op til kulturer dyrket i 40 15 cm skåle; disse vil give cirka 2 - 4 ml pakket cellepellet.
- Grow HEK293 celler, der stabilt udtrykker det ønskede underenheden af INO80 kompleks til nær konfluens i 15 cm skåle.
- Tilføj et volumen af siRNA resuspensionsbuffer (20 mM KCI, 6 mM HEPES pH 7,5, og 0,2 mM MgCl2) er tilstrækkelig til at fremstille en 50 uM stamopløsning af siRNA til et rør indeholdende lyofiliseret siRNA. Pipette opløsningen op og ned nogle få gange, og der inkuberes i en nutator i 30 minutter ved stuetemperatur for at sikre siRNA er helt opløst.
- Forbered en transfektion cocktail indeholdende siRNA'er og transfektionsreagens. Bland 10 ul af 50 uM siRNA stamopløsning med 32 mikroliter Lipofectamin RNAiMAX og føje den til 4 ml Opti-MEM Reduceret Serum Mellem med meget forsigtig blanding; allave alle reagenser afbalancere til stuetemperatur før brug.
- Inkuberes blandingen ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Forbered Flp-In HEK293-celler, der stabilt udtrykker det ønskede INO80 underenheden til transfektion.
- Under inkuberingen i trin 3.4, vaskes celler i 15 cm skåle gang med RT PBS.
- Efter fjernelse PBS, behandle celler med 1 ml trypsin lige indtil de begynder at løfte pladen.
- Straks tilsættes 10 ml komplet medium (DMEM + 5% glutamin + 10% FBS) til trypsineret celler og bland forsigtigt. Indsamle cellerne ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender cellepelleten i ~ 4 ml komplet medium, og tælle cellen resuspension ved hjælp af et hæmocytometer.
- Fortynd celler med komplet medium til en koncentration på ~ 5,4 x 10 6 / ml.
- Til hver 15 cm skål, tilsæt 15 ml komplet dyrkningsmedium efterfulgt af 4 ml transfektion cocktail. Bland forsigtigt for at sikre, mellemlang og transfektion cocktail er THOROughly blandet. Endelig tilføje et ml cellesuspension og igen bland forsigtigt at sprede celler ensartet.
- Efter 60 timer af kulturen i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator, forsigtigt fjerne medium, Resuspender cellerne i iskold PBS, og fortsæt straks at forberede kerneekstrakter.
4. Fremstilling af kerneekstrakter
Denne procedure er blevet ændret fra den protokol Dignam 13 og kan skaleres op eller ned afhængigt af størrelsen på start cellepellets. Typisk 1 ml pakket cellepellet udbytter 1 ml af den endelige kerneekstrakt. Alle buffere skal være iskold, og alle trin skal udføres i et kølerum eller på is, hvis et egnet kølerum er ikke tilgængelig.
- Isolering af kerner:
- Overføre forsigtigt celler til en passende størrelse (15 eller 50 ml) gradueret konisk rør og centrifugering ved 1.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Supernatanten fjernes, og måle mængden af den pakkede celler pellad. 1 ml pakkede celler svarer til ~ 3 x 10 8 HEK293-celler.
- Tilsæt 5 pakket celle volumen puffer A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCI og frisk tilsat 1 mM DTT, 200 uM PMSF og 1: 1.000 Protease Inhibitor Cocktail). Resuspender cellepelleten ved forsigtig pipettering.
- Der inkuberes på is i nøjagtig 10 minutter.
- Pelletere cellerne ved 1.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanten fjernes.
- Størrelsen af cellepelleten bør stige op til 2 gange under inkubation i puffer A.
- Cellerne i to pakkede cellevolumener puffer A og overføre cellesuspension til en passende størrelse Dounce-vævshomogenisator. Hvis man starter med mindre end 2 ml pakkede celler, skal du bruge et 7 ml homogenisator; for 2 - 4 ml pakkede celler, skal du bruge et 15 ml homogenisator; og for 10 eller flere ml pakkede celler, skal du bruge en 40 ml homogenisator.
- Homogeniser cellesuspensionen med den løse glas pistil af Dounce homogenisator unto 90% af cellerne farves positivt med 1% trypanblåt.
- Suspensionen overføres til et 45 ml høj hastighed centrifugeglas og centrifugering ved 25.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C i en JA-17 eller tilsvarende rotor (se tabel Materialer / udstyr).
- Fra kernepellet, supernatanten fjernes, som indeholder cytosoliske proteiner eller proteiner, som lækker ud af kernen under fraktionering.
- Udtrækning kerner med salt:
- Tilføj puffer C (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA og frisk tilsat 1 mM DTT, 200 uM PMSF og 1: 1.000 Protease Inhibitor Cocktail) til kernepellet; bruge 2,5 ml puffer C for hver 3 ml starte hæmatokrit (~ 1 x 10 9 celler).
- Ved hjælp af en glasstav eller en pipette, fjerne den nukleare pellet fra væggen af røret og overføre hele blandingen til en Dounce-homogenisator af passende størrelse.
- Resuspender kernerne ved homogenisering the blanding med to slag af en løs pistil.
- Overfør resuspenderet kernefraktionen i et afkølet bæger. Vælg et bæger sådan, at suspensionen vil fylde bægeret til mindst 0,5 cm dybe.
- At udtrække kerneproteiner fra kromatin eller andre uopløselige strukturer, gradvist øge saltkoncentrationen af suspensionen til 0,42 M NaCI ved dråbevis tilsætning af 5 M NaCl under forsigtig omrøring af suspensionen med en pipette eller glasstav på is; når alle af 5 M NaCI er blevet tilføjet, skal opløsningen bliver meget tyktflydende eller gellignende. Beregn rumfanget af 5 M NaCI er nødvendig for at bringe opløsningen til en slutkoncentration på 0,42 M NaCl i overensstemmelse med følgende formel:
- Overføre forsigtigt tyktflydende suspension i 10 ml polycarbonat rør til en type 70,1 Ti rotor (eller tilsvarende), eller 70 ml polycarbonat flasker til en type 45 Ti or lignende rotor (se tabel Materialer / udstyr). Slutter tæt med parafilm hvis du bruger 10 ml rør eller med hætte samling, hvis du bruger 70 ml flasker.
- Langsomt rocke de forseglede rør ved 4 ° C i 30 minutter ved hjælp af en nutator.
- Spin prøverne i et type 45 Ti eller 70.1 Ti-rotor i 30 minutter ved 120.000 xg ved 4 ° C.
- Supernatanten overføres til en enkelt plastrør eller en flaske. Denne supernatant er kerneekstrakten, og pelleten indeholder kromatin og andre nukleare snavs.
- Opdel kerneekstrakt i praktisk størrelse portioner, fryse det i flydende nitrogen, og opbevar den ved -80 ° C.
5. immunoaffinitetsoprensning af Human INO80 eller INO80 Subcomplexes
- At optø frosne kerneekstrakt, placere rør indeholdende ekstraktet på stationære eller roll rør mellem hænderne, indtil det frosne materiale bliver gylle. Derefter placere rørene på is eller i det kolde rum indtil ekstraktet er helt thawed.
- Overfør den optøede kerneekstrakt til 10 ml polycarbonat ultracentrifugerør, og centrifugering ved 100.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C i en type 70.1 Ti rotor eller tilsvarende at fjerne eventuelt bundfald, som kan være dannet under fryse-tø-cyklus.
- Supernatanten overføres til et 15 ml konisk rør. Tilføj frisk DTT, PMSF og proteasehæmmer Cocktail til endelige koncentrationer på 1 mM DTT, 200 uM PMSF og 1: 1.000 proteasehæmmer cocktail.
- For at forberede anti-FLAG agarose for immunrensning overføre 200 pi 50% opslæmning af anti-FLAG agarosekugler til et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved hjælp af en P200 eller lignende pipette med et tip fra hvilken enden er blevet skåret af med en ren skalpel eller barberblad.
- Pellet perlerne ved centrifugering i en benchtop mikrocentrifuge ved 8.000 x g i 30 sek. Fjern supernatanten og vaske perlerne ved at resuspendere perlerne i 1 ml Lys450 buffer og pelletere kuglerne ved 8.000 x g i 30 sek. Vask Beads to gange mere.
- Resuspender vaskede anti-FLAG agaroseperler i omkring 100 ul af nukleare ekstrakt ved hjælp af en P200 eller lignende justerbar volumen pipette med et tip fra hvilken enden er blevet skåret af med en ren skalpel eller barberblad og ved hjælp af den samme spids, overførsel Det resuspenderede perler til 15 ml koniske rør indeholdende ekstraktet. Gentag et par gange, indtil alle perlerne er blevet overført til 15 ml rør.
- Inkuber ekstrakten / perle-blanding i 4 timer ved 4 ° C med langsom rotation på et laboratorium rotator. EKSTRA: Medtag Benzonase i en koncentration på 25 enheder / ml for at fjerne kontaminerende DNA.
- Saml FLAG agarose ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspender i 10 ml Lys450 at vaske, inkuberes i 5 minutter ved 4 ° C med blid vuggende på en nutator. Pellet perlerne ved 1.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender i 100-150 ul Lys450 og transfer perler til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Continue at skylle 15 ml konisk rør med 100-150 ul Lys450 indtil alle perlerne er blevet overført til mikrocentrifugerør.
- Spin ned perlerne ved 8.000 xg i 30 sekunder ved 4 ° C i en mikrocentrifuge. Der vaskes tre gange mere med 1 ml Lys450 og en gang med 1 ml EB100-buffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10% glycerol, 100 mM NaCI, 1,5 mM MgCl2, 0,05% Triton X-100, og frisk tilsat 1 mM DTT, 200 uM PMSF , og 1: 1.000 proteasehæmmer Cocktail).
- For at eluere bundne proteiner, tilsættes 200 ul EB100 buffer indeholdende 0,25 mg / ml 1x FLAG peptid. Der inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C hver på en nutator.
- Pellet perlerne ved 8.000 xg i 30 sekunder ved 4 ° C i en mikrocentrifuge. Overfør supernatanten, som indeholder det eluerede INO80 kompleks, til et frisk mikrocentrifugerør.
- Gentag elueringen fire gange, og samle alle supernatanterne i et enkelt rør.
- At fjerne eventuelle FLAG-agaroseperler fra den eluerede fraktion proteinpassere eluatet gennem en tom spinkolonne.
- Koncentrer den eluerede proteinfraktion ~ 10-fold under anvendelse af en ultra centrifugal filterindretning (50.000 molekylvægtafskæring).
- For at fjerne FLAG-peptidet, passerer den koncentrerede proteinfraktion sekventielt gennem to afsaltningen afdrypper kolonner.
- Divider oprensede afsaltede proteinfraktion i 20 portioner ul, frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C.
- Analyser underenhed sammensætning INO80 eller INO80 subcomplexes på sølvfarvede geler eller Western blotting, og estimere koncentrationerne ved semikvantitativ western blotting under anvendelse af præparater af rekombinante INO80 underenheder af kendt koncentration som standarder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et rutediagram, der sammenfatter de procedurer, der anvendes til at generere, rense og karakterisere humane INO80 ATP-afhængige kromatin remodeling komplekser.
Som illustreret i figur 2 og 3, disse procedurer giver genereringen af både vildtype INO80 og INO80 subcomplexes der mangler forskellige underenheder, hvorved efterfølgende biokemiske analyser af bidrag af disse manglende underenheder til INO80 største enzymaktiviteter. Figur 2 beskriver to strategier har vi bruges til at definere arkitekturen i INO80 kompleks og til at generere INO80 subcomplexes. I den første, der er vist i figur 2A, er intakte INO80 komplekser renset gennem FLAG-mærkede versioner af vild type underenheder (Ies2 eller INO80E). Subcomplexes kan oprenses via epitop-mærkede versioner af mutante Ino80 proteiner, der mangler individuelle domæner som forskellige sæt af underenheder ASSEMble. Som vist i figur 3A, er renheden af de resulterende komplekser bedømmes ved hjælp af sølvfarvet SDS-polyacrylamidgeler, mens sammensætningen af komplekserne vurderes ved hjælp af Western blotting med antistoffer mod forskellige INO80 underenheder (figur 3B) eller ved massespektrometri (data ikke vist). Ved hjælp af denne fremgangsmåde, fandt vi, at underenhederne er vist i rødt i figur 2A blev tabt ved deletion af Ino80 NTD (N-terminale domæne); underenheder vist i blåt gik tabt ved sletning af Ino80 HSA (Helicase SANT Associated) domæne; og at SnF2 ATPase domæne, der består af SNF2N og HelicC regioner (lilla) adskilt af en lang indsættelse region (hvid), var nødvendige og tilstrækkelige for binding til underenheder vist i lilla. Således INO80 subcomplexes (INO80ΔN.com eller INO80ΔNΔHSA.com), der mangler enten underenhedeme vist i rødt eller underenheder vist i rød og blå kan renses gennem FLAG-Ino80ΔN eller FLAG-INO80ΔNΔHSEn henholdsvis 5.
Det er også muligt at generere subcomplexes ved at nedbryde de enkelte underenheder fra celler, der udtrykker en passende FLAG-mærkede INO80 underenhed (upublicerede resultater). I den første er vist i figur 2B eksempel siRNA-medieret knockdown af underenhed X udtømmer kun X fra INO80 kompleks, hvilket tyder på X er ikke nødvendig for samling af andre underenheder i INO80. I andet og tredje eksempler siRNA knockdown enten Y eller Z medfører co-udtømning af både Y og Z-underenheder, hvilket tyder på Y og Z samle i INO80 kompleks i en gensidigt afhængig måde.
. Figur 1. Flowdiagram beskriver procedurer, der anvendes til at generere, oprense og karakterisere humane INO80 ATP-afhængige chromatin remodeling komplekser F, en N-terminal i ramme FLAG-epitopmærke; Indiens regering, Gene-af-irenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Diagram over de to strategier anvendes til at generere INO80 subcomplexes der indeholder en delmængde af underenheder. (A) Ino80 ATPase indeholder regioner, der fungerer som modulære stilladser, som de øvrige INO80 underenheder samles. (B) siRNA-medieret knockdown kan anvendes til at udtømme den ønskede underenhed (X eller Y eller Z) fra celler, der udtrykker en passende flag- tagged INO80 underenhed (fx FLAG-Ino80ΔN). Klik her for at se en større version af dette tal.
![Figur 3]("/files/ftp_upload/51720/51720fig3highres.jpg")
Figur 3. Analyse af sammensætningen af immunorenset INO80 komplekser og subcomplexes. (A) INO80 komplekser eller subcomplexes blev oprenset fra celler, der stabilt udtrykker de angivne FLAG-mærkede proteiner, der udsættes for SDS-polyacrylamidgel-elektroforese og visualiseret ved sølvfarvning. Prøven i den yderste højre vognbane blev fremstillet ud fra forældrenes 293 celler, der udtrykker ingen FLAG-mærkede protein; proteiner, der vises i denne kontrol bane er forurenende stoffer, der binder ikke-specifikt til FLAG-agarose. Etiketter til venstre angiver bånd svarende til flere INO80 underenheder, og dem til højre mobiliteterne af molekylvægtsmarkører. Positionen af vildtype Ino80 er angivet ved den sorte rektangel, og positioner Ino80 mutanter er angivet med åbne cirkler. Banerne er adskilt af den sorte linje er fra separate geler. (B) INO80 komplekser og subcomplexes blev analyseret ved western-blottinganvendelse af antistoffer mod repræsentative underenheder af NTD, HSA og SnF2 moduler. Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i The Journal of Biological Chemistry. Chen et al, Subunit Organisationen af Human INO80 Kromatin- Remodeling Complex. En konserveret evolutionært Core Complex katalyserer ATP-afhængig nukleosom remodeling. The Journal of Biological Chemistry Vol 286: s. 11.283-11.289. © 2011, ved American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strukturelle og funktionelle studier af multi-subunit pattedyr kromatin remodeling komplekser fra højere eukaryoter er blevet vanskeliggjort af vanskeligheden ved at fremstille biokemisk nyttige mængder af sådanne komplekser, der indeholder mutant underenheder eller mangler visse underenheder helt. Der er en række tekniske forhindringer: For det første har genmanipulation i pattedyrceller været teknisk udfordrende og tidskrævende. I modsætning gærceller, hvis genom kan let redigeres og målrettet anvendelse af recombineering teknikker pattedyrsgenomet er mere strukturelt komplekse og mindre modtagelige over for recombineering interventioner. Således sletning eller ændring af pattedyrsgener i dyrkede celler eller dyr er mere tidskrævende og kræver mere specialiseret ekspertise. Som følge heraf er dannelsen af mutante pattedyr komplekser bærer strukturelle mutationer eller mangler undergrupper af underenhed (er) været hastighedsbegrænsende. For det andet, biokemisk rekonstitution nærmer hjælp heterologous protein ekspressionssystemer er ofte anvendt til at generere definerede multi-protein-aggregater. Dog bliver teknisk udfordrende for meget store komplekser, hvis underenheder kan være nødvendigt at samtidig udtrykkes i korrekt støkiometri og / eller at blive samlet i en bestemt rækkefølge, med hjælp fra specifikke chaperoner eller cofaktorer sådanne tilgange. Disse problemer er især alvorligt i tilfælde af INO80 kompleks, fordi dens Ino80 ATPase underenhed er særligt vanskeligt at udtrykke i insekt eller E. coli-celler i biokemisk nyttige mængder. I undersøgelser af INO80 chromatin remodeling komplekse, har det været muligt at omgå nogle af disse udfordringer ved hjælp af de strategier, der er beskrevet i denne protokol.
Generering humane cellelinier stabilt udtrykker epitopmærket underenheder af INO80 komplekset er et vigtigt skridt i denne procedure, da den giver oprensningen af veldefinerede kromatin remodeling komplekser, der kan testes ved hjælp af forskellige biokemiske enssays. Selv om det i princippet er mere tidskrævende at generere stabile cellelinjer end at bruge transient transfektion til at levere manipulerede cDNA'er i mammale cellelinjer til produktion af rekombinant protein, transient transfektion lider af flere ulemper. Første DNA-i form af en transient transficeret ekstra-kromosomal vektor-er kortvarig og kan normalt ikke selv formere under cellecyklussen. For det andet, transfektionseffektivitet varierer meget afhængigt af celletype og vækstbetingelser. Heterogen transfektion kan forårsage en mosaik udtryk mønster, som giver en selektiv vækst fordel eller ulempe i cellen befolkning. Således indføres transient transgener tendens til at gå tabt i løbet af de mange cellepassager kræves til den store mængde af celler, der er nødvendige til oprensning af biokemisk anvendelige mængder af protein. Stabile cellelinjer er mest almindeligt genereres ved hjælp af metoder, der resulterer i tilfældig integration af cDNA'er, der koder for et proteinaf interesse. Dog kan tilfældigt integrerede cDNA'er afbryde ekspression af endogene gener og er underlagt gendæmpning med flere cellepassager. Af disse grunde har vi typisk indfører Ino80 cDNA'er i celler ved hjælp af Flp-medieret rekombination teknologi, hvor cDNA'et stabilt inkorporeret i en specifik kromosomal placering via Flp-rekombinase-medieret indsættelse i en enkelt FRT-sekvens stabilt integreret i genomet.
Under udvælgelsen af stabile cellelinjer, er det vigtigt at være i stand til at opdage eksogent udtrykte, FLAG-mærkede, vildtype eller mutant Ino80 proteiner. Fordi FLAG-tagget Ino80 proteinet udtrykkes ofte i meget lave niveauer og er derfor vanskeligt eller umuligt at påvise ved western blotting i rå lysater af celler dyrket i en enkelt brønd i en plade med 24 brønde, er det ofte nødvendigt at udvide den oprindelige klonale cellepopulation før screening for ekspression af Ino80 proteinet. FLAG-tagget Ino80 protein kan derefter renses og concentrated af FLAG immunrensning før analyse ved Western blotting.
Effektiviteten af siRNA-medieret knockdown er ganske følsom over for celletæthed ved transfektion; fandt vi, at knockdown effektivitet reduceres, når transfektioner blev udført med celler på andre end det, der anbefales i protokollen tætheder. Den optimale varighed for siRNA transfektion er variabel og skal bestemmes empirisk for hvert mål protein, da det afhænger af stabiliteten af målproteinet, omsætningshastigheden af den målrettede protein i protein-komplekser, og i hvilken grad proteinet er afgørende for cellelevedygtighed. Som et alternativ til anvendelse af forbigående transfektion af siRNA'er til nedbryder individuelle underenheder, kan man overveje at generere cellelinier, der stabilt udtrykker shRNAs under selektivt pres, da det kan være lettere og mere omkostningseffektivt at vokse biokemisk nyttige mængder af sådanne cellelinjer. Imidlertid kan det vise sig vanskeligtat opnå tilstrækkelig knockdown hjælp shRNA-medieret knockdown i stabile cellelinjer.
Også nøglen til succes for vores fremgangsmåde er brugen af kerneekstrakter som udgangsmateriale til oprensning af INO80 komplekser. Vi har fundet, at immunooprenset INO80 komplekser fra helcelleekstrakter ofte er forurenet med ATPase og / eller nukleosom remodeling aktiviteter, som er uafhængige af Ino80 ATPase; sådan forurening er i vid udstrækning undgås, når komplekser oprenses fra kerneekstrakter.
Fremstilling af nukleart ekstrakter og isolering af intakte INO80 komplekser afhænger af en række kritiske faktorer. For det første skal de celler, der anvendes til fremstilling af kerneekstrakter være intakt og sund. Forventes vasket cellepellet til at svulme op til to gange efter inkubation i hypotonisk puffer A. Hvis celler ikke svulmer op og / eller supernatanten bliver uklar på dette trin begynder population af celler kan have været usundt. AlternativtCeller kan have været håndteret for groft under høst eller resuspension trin, eller de kan være blevet inkuberet for længe i Buffer A. For det andet er det vigtigt ikke at over-homogenisere cellerne eller det kernepellet, da dette vil forskyde kromatin og frigive DNA i den opløselige fraktion. DNA i den opløselige fraktion kan interferere med efterfølgende rensning og analyse af INO80 komplekser. Især kan kontaminerende DNA føre til øget dannelse af bundfald under inkubation af ekstrakten med anti-FLAG-agarose, hvorved effektiviteten af vask og elueringstrin og / eller øge overflod af kontaminerende DNA-bindende proteiner i den endelige oprensede fraktion . Desuden kan downstream biokemiske assays måler aktiviteter, der er afhængige af DNA, og dermed den potentielle overførsel af DNA fra ekstraktet komplicere fortolkningen af disse analyser. For at undgå over-homogenisering under cellelyse er det tilrådeligt at kontrollere andelen af trypanblåt-positive cellers efter hvert slag af homogenisator; til HEK293 celler, kræver næsten fuldstændig cellelyse typisk 4 - 6 slag af homogenisering. Det er også vigtigt at undgå at der dannes luftbobler under homogenisering. Supernatanten fra 120.000 xg spin i trin 4.2.8 bør være en klar, ikke-viskøs opløsning, med kun en meget minimal mængde uklar eller viskost materiale i nærheden af kromatin pellet eller flydende på toppen. Ved afhentning af supernatanten, skal man passe på ikke at samle noget af det uklar eller tyktflydende materiale, da det kan indeholde kromatin og / eller DNA. Endelig er det bedre at undgå frysning celler, før forberede kerneekstrakter, da komplekser fremstillet fra frosne celler tendens til at udvise lavere specifik aktivitet og til at omfatte mere forurenende DNA og proteiner.
Det optimale forhold mellem mængden af udgangsmateriale ekstrakt og anti-FLAG-agarose afhænger af koncentrationen af FLAG agn protein til stede i ekstrakterne og accessibiheden af FLAG epitop og behov, der skal bestemmes empirisk. Vi begynder typisk immunrensning med 100 ul bedvolumen af anti-FLAG agaroseperler og 3 - 14 ml kerneekstrakt; mængden af ekstrakt anvendes, afhænger af de mål af forsøget og tilgængeligheden af ekstrakt. Et enkelt skridt immunrensning anvendelse af anti-FLAG agarose er normalt tilstrækkeligt at oprense INO80 eller INO80 subcomplexes i en grad tilstrækkelig for pålidelige analyser af deres aktiviteter; dog kan yderligere oprensningstrin (r), såsom gelfiltrering, densitetsgradient sedimentering eller ionbytterkromatografi være nødvendige til oprensning af andre komplekser eller for at fjerne kontaminerende aktiviteter, som kunne komplicere fortolkningen af biokemiske analyser.
De her beskrevne strategier bør være mere generelt anvendelige til studier af andre kromatin remodeling enzymer samt andre store multiprotein komplekser. Vellykket anvendelse af disse strategier til analysen af andre multiprotein komplekser afhænger (i) identifikation af en individuel underenhed eller underenhed (er), der fungerer som stillads (er), som andre underenheder samle og (ii) definition af specifikke områder eller regioner, med hvilke specifikke delmængder af underenheder samle. Definitionen af sådanne domæner kan lettes ved at analysere den primære sekvens af kernen stillads underenhed (er) for evolutionært konserverede eller regioner, der svarer til kendte strukturelle domæner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Arbejde i forfatternes laboratorium er støttet af en bevilling fra National Institute of General Medical Sciences (GM41628) og et tilskud til Stowers Institut for Medicinsk Forskning fra Helen Nelson Medical Research Fund ved Greater Kansas City Community Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | |||
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).
- Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).
- Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5 (5), 521-527 (1994).
- Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).
- Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).
- Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).
- Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16 (4), 730-735 (1994).
- Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 207-245 (2005).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).
