Summary
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for generering og rensing av villtype og muterte versjoner av det menneskelige INO80 kromatin ombygging kompleks. Epitop merket versjoner av INO80 subenheter blir stabilt uttrykt i HEK293-celler og komplett komplekser og komplekser som mangler spesifikke sett av underenhetene blir renset ved immunoaffinitets-kromatografi.
Abstract
INO80 kromatin remodeling komplekser regulere nucleosome dynamikk og DNA tilgjengelighet ved katalyserende ATP-avhengige nucleosome remodeling. Menneske INO80 komplekser består av 14 protein subenheter inkludert Ino80, en SNF2-lignende ATPase, som serverer både som den katalytiske subenheten og stillaset for montering av kompleksene. Funksjoner av de andre underenhetene og de mekanismer som bidrar de til INO80 kompleksets kromatin remodeling aktivitet forblir dårlig forstått, delvis på grunn av utfordringen med å generere INO80 underenheter i menneskeceller eller heterologe ekspresjonssystemer. Dette Jove protokollen beskriver en prosedyre som tillater rensing av menneskelige INO80 kromatin remodeling subcomplexes som mangler en underenhet eller et delsett av subenheter. N-terminalt FLAG-epitopen kodet Ino80 cDNA blir stabilt innført i human embryonisk nyre (HEK) 293 cellelinjer ved hjelp av Flp-mediert rekombinasjon. I det tilfelle at et delsett av subenheter av INO80 komplekset er å be slettes, en uttrykker i stedet mutant Ino80 proteiner som mangler plattformen som trengs for montering av disse underenhetene. I tilfelle en person subenhet er å bli tømt, en transfects sirnas rettet mot dette underenhet til en HEK 293 cellelinje stabilt uttrykte FLAG tagget Ino80 ATPase. Atom ekstrakter er forberedt, og FLAG immunoprecipitation er utført for å berike proteinfraksjoner som inneholder Ino80 derivater. Blandingene av renset INO80 subcomplexes kan deretter bli analysert ved hjelp av metoder som immunoblotting, sølvfarging, og massespektrometri. De INO80 og INO80 subcomplexes genereres i henhold til denne protokollen kan bli ytterligere analysert ved hjelp av ulike biokjemiske analyser, som er beskrevet i den medfølgende Jove protokollen. Metodene som beskrives her kan tilpasses for studier av de strukturelle og funksjonelle egenskaper av ethvert pattedyr multi-subenhet kromatin remodellering og modifiserende komplekser.
Introduction
Evolusjonært konserverte SNF2 familie kromatin remodeling komplekser er viktige regulatorer av kromatin organisasjon og DNA tilgjengelighet en. Disse ombygging komplekser omfatter alltid en sentral SNF2 lignende ATPase-subenhet, noe som, i noen tilfeller, setter sammen med forskjellige aksessoriske proteiner og danner multi-subenheten makro-molekylære sammenstillinger. For å studere de molekylære detaljer av ATP-avhengige kromatin remodelleprosessen, er det viktig å forstå bidragene fra gitte undergrupper av underenheter og / eller domenestrukturer i aktiviteter av komplekser. Slike analyser krever evnen til å generere høy-rene mutante komplekser som mangler spesielle protein subenheter eller domenestrukturer.
Tidligere studier struktur-funksjon av ATP-avhengige kromatin remodeling komplekser har allment fokusert på gjær modellsystem på grunn av den overlegne manipulability av gjær-genomet (se, for eksempel, refs 1-4). Gitt bevaring avsubenheten sammensetning og funksjonalitet blant ortologe remodeling komplekser, har studier av struktur og funksjon av gjær remodeling komplekser gitt viktig innsikt i sine kolleger i høyere eukaryoter. Likevel betydelige artsspesifikke forskjeller mellom remodeling komplekser eksisterer, som følge av gevinst eller tap av artsspesifikke subenheter, gevinst eller tap av artsspesifikke domener av konserverte subenheter, og sekvens variasjon innenfor konserverte domener av konserverte subenheter. Slike forskjeller kan i prinsippet være drevet av behovet for høyere eukaryote celler til å tilpasse seg nye molekylære og cellulære miljøer. Dermed forstå hvordan subenheter av høyere eukaryote remodeling komplekser bidra til nucleosome remodeling prosessen er verdifull, fordi den ikke bare belyser grunnleggende mekanismene i ATP-avhengige kromatin remodeling prosessen, men også kan gi verdifull innsikt i de mekanismer som kromatinstruktur og genuttrykk i highennes eukaryoter er regulert.
Så langt har det vært bare begrenset strukturelle og funksjonelle studier av multi-subenheten pattedyr kromatin remodeling komplekser, delvis på grunn av vanskelighetene med å skaffe biokjemisk definerte kromatin remodeling komplekser og subcomplexes. Vi har delvis omgå disse vanskelighetene med de prosedyrer som er beskrevet nedenfor, hvor immunoaffinitets-rensing blir anvendt for å frem intakte INO80 eller INO80 subcomplexes fra humane celler stabilt uttrykker N-terminalt FLAG-epitop merket villtype eller muterte versjoner av Ino80 5-7 (figur 1) . For å oppnå intakt INO80 komplekser fra humane celler, er Flp-mediert rekombinasjon brukes til å generere transgene HEK293-cellelinjer som uttrykker stabilt FLAG-epitop merket cDNA som koder subenheter av INO80 kompleks 8-10. Ettersom over-ekspresjon av INO80 subenheter kan være noe toksisk, er det nødvendig å isolere og opprettholde klonale cellelinjer i henhold til selektiv cold å sikre stabil transgene uttrykk i de mange passasjene som trengs for utvidelse av store cellekulturer. For å få mindre INO80 subcomplexes som bare inneholder et delsett av subenheter, har vi med hell brukt to tilnærminger (Figur 2A, B). I den første, genererer vi HEK293 Flp-I-cellelinjer stabilt uttrykker mutante versjoner av Ino80 som mangler domener som kreves for interaksjon med spesifikke subenheter 5. Alternativt siRNA-mediert knockdown brukes til å utarme den ønskede subenheten fra celler som uttrykker en passende FLAG-merket INO80 subenhet (upubliserte data). Til slutt, for å rense de humane INO80 komplekser, er FLAG agarose-basert kromatografi 11 benyttes for å berike en INO80-inneholdende fraksjon fra nukleære ekstrakter, for derved effektivt å redusere nærværet av forurensende cytosoliske proteiner i den endelige fraksjon inneholdende rensede INO80 eller INO80 subcomplexes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generasjon og kultur HEK293 Stable cellelinjer Uttrykke Full lengde eller Mutant Versjoner av FLAG Epitope-merket Ino80 eller andre INO80 Komplekse Underenheter
- Clone cDNA som koder for full lengde eller mutant menneskelige Ino80 ATPase eller annen INO80 subenheten inn i pattedyr ekspresjonsvektor pcDNA5 / FRT med en in-frame, N-terminal FLAG epitop tag.
- Bekreft sekvensen av de innsatte cDNAs ved DNA-sekvensering før du fortsetter.
- For å utføre transfeksjonen, vokser Flp-i HEK293-celler i 10 cm vevkulturskåler i et medium inneholdende DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), 5% glutamin og 10% FBS (føtalt bovint serum).
- Når cellene når ~ 70% konfluens, legge til hver vevskultur fatet en blanding av 40 pl av FuGENE6 transfeksjon reagens, 0,5 mikrogram av det passende pcDNA5 / FRT ekspresjonsplasmid, og 9,5 ug av pOG44, som koder Flp rekombinase, i et totalvolum på 800 pl.
- 48 hr senere, trypsinize og sPlit celler ved et forhold på 01:30 i 10 cm skåler og dyrke dem i DMEM med 5% glutamin, 10% FBS, og 100 ug / ml hygromycin B for 3 - 4 uker. Endre kulturen medium når det begynner å gulne (vanligvis hver 3 - 5 dager).
- Å identifisere positive kloner som uttrykker det høyeste nivået av FLAG-tagget protein, velger enkelte hygromycin B-resistente kolonier og overføre dem til en enkelt brønn i en 24-brønns plate.
- Når cellene når 80% konfluens, høste celler fra hver brønn i ~ 1 ml PBS og pelleten etter sentrifugering ved 1000 xg i 5 min.
- Etter fjerning av supernatanten, cellepelleten suspenderes i 60 ul SDS-PAGE prøvebuffer.
- Emne halvdel av cellepelleten resuspendert i SDS-side og western blotting for å overvåke ekspresjon av den kodede FLAG agn protein; lagre det andre halvparten for fremtidig analyse.
- Hvis det ikke registreres FLAG-merket menneskelig Ino80 protein i cellelysatene, utvide den innledende klonal celle befolkgen videre ved plating celler fra enkeltbrønner i en 24-brønns plate i 15 cm vevkulturskåler.
- Å høste celler fra 15 cm retter, resuspender nær konfluente celler i iskald PBS og overføring til en 50 ml konisk tube.
- Bring til et sluttvolum på 50 ml ved tilsetning av ytterligere PBS.
- Pellet cellene ved 1000 xg i 5 min, og fjerne så mye som mulig av supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml av Lys450-buffer (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 450 mM NaCl, 0,5% TritonX-100, 10 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 10% glyserol, 1 mM DTT, 200 mikrometer PMSF, og 1: 1000 proteasehemmer Cocktail).
MERK: her og andre steder, alltid legge DTT, PMSF, og proteasehemmer cocktail til buffere umiddelbart før du starter et eksperiment. - Immuno-bunnfall FLAG-merket proteiner fra den resulterende hele cellelysat bruker 20fil anti-FLAG agarosegel, og analysere flagget eluater av western blotting. [For detaljer om Immunoprecipitation prosedyre, se trinn 5.]
- Forbered frosne bestander av ønskede klonal cellelinjer 12 og lagre dem i flytende nitrogen inntil bruk.
2. Økende HEK293 cellelinjer i rulleflasker
For storskala utarbeidelse av INO80 komplekser, kultur celler i 10 - 20 roller flasker; et typisk utbytte fra hver valse flasken er ~ 1 ml pakkede celler.
- Til hver valse flaske, tilsett 200 ml DMEM, 5% glutamin og 10% kalveserum, uten hygromycin B.
- Overfør alle cellene fra en enkelt nær-konfluent 15 cm plate i hver valse flaske
- Monter hjul flasker i en 37 ° C roller flaske inkubator og rotere på 0.2 rpm.
- Når cellene nå ~ 70% konfluens, hell av og kast medium.
- Legg til ~ 50 ml av iskald PBS til hver flaske. Holder flasker horisontalt, forsiktig virvel å løsne cellemonolag.
- Overfør de resuspenderte celler til 250 ml plaic koniske flasker og legg på is.
- Skyll rulleflasker med ekstra PBS, overføre det sekvensielt fra flaske til flaske. Når skylle løsningen er ikke lenger klar (vanligvis etter å ha blitt brukt til å skylle ca 5 flasker), legge den til cellesuspensjonen.
- Pellet celler ved sentrifugering ved 400 xg i 10 min.
- Forsiktig resuspender cellene i PBS, kombinere dem i en eneste 250 ml konisk flaske og hold på is inntil videre behandling.
3. siRNA-mediert knockdown av INO80 Underenheter i celler uttrykker annen FLAG-merket INO80 Subunit
For å få INO80 subcomplexes mangler en enkelt subenhet, til bruk FLAG-immunorensing rense INO80 komplekser fra siRNA behandlede celler eller celler stabilt uttrykker shRNA. Den "omvendt" siRNA (liten interfering RNA) transfeksjon protokollen beskrevet her er optimalisert for HEK293 celler vokser i 15 cm retter. Protokollen er for en enkelt 15 cm skål med celler og shoUld bli skalert opp tilsvarende, avhengig av antallet celler som trengs. For å forberede biokjemisk nyttige mengder INO80 kompleks fra siRNA-behandlede celler, bør man skalere opp til kulturer dyrket i 40 15 cm retter; disse vil gi omtrent 2 - 4 ml av pakkede cellepelleten.
- Dyrk HEK293-celler stabilt uttrykte den ønskede subenhet av INO80 komplekset til nær konfluens i 15 cm skåler.
- Legg til et volum på fra siRNA resuspensjon buffer (20 mM KCl, 6 mM HEPES-pH 7,5, og 0,2 mM MgCl 2) tilstrekkelig til å fremstille en 50 mM stamløsning av siRNA til et rør inneholdende lyofilisert siRNA. Pipettere løsningen opp og ned noen ganger og inkuberes på en nutator i 30 minutter ved RT for å sikre at siRNA er fullstendig oppløst.
- Forbered en transfeksjon cocktail som inneholder sirnas og transfeksjon reagens. Bland 10 mL av 50 mikrometer siRNA stamløsning med 32 mL Lipofectamine RNAiMAX og legge den til 4 ml Opti-MEM Redusert Serum Medium med svært forsiktig omrøring; allave alle reagenser til likevekt ved romtemperatur før bruk.
- Inkuber blandingen ved RT i 30 min.
- Forbered Flp-In HEK293 celler stabilt uttrykker ønsket INO80 subenheten for transfeksjon.
- Under inkuberingen i trinn 3.4, vask celler i 15 cm skåler en gang med PBS RT.
- Etter å ha fjernet PBS, behandle celler med ett ml trypsin like før de begynner å løfte av platen.
- Umiddelbart tilsett 10 ml komplett medium (DMEM + 5% glutamin + 10% FBS) til cellene trypsinisert og bland forsiktig. Samle-celler ved sentrifugering ved 1000 xg i 5 min ved RT.
- Resuspender cellepelleten i ~ 4 ml fullstendig medium, og telle celle resuspendering ved hjelp av en haemocytometer.
- Fortynn cellene med komplett medium til en konsentrasjon på 5,4 x 10 ~ 6 / ml.
- Til hver 15 cm tallerken, legg 15 ml komplett kultur medium etterfulgt av 4 ml transfeksjon cocktail. Virvle forsiktig for å sikre de mellomstore og transfeksjon cocktail er thoroughly blandet. Til slutt legger du en ml cellesuspensjon og igjen virvle forsiktig å spre cellene jevnt.
- Etter 60 timer med kultur i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator, forsiktig fjerne medium, resuspender celler i iskald PBS, og fortsette umiddelbart å forberede atom ekstrakter.
4. Utarbeidelse av Nuclear Ekstrakter
Denne fremgangsmåten har blitt forandret fra protokollen for Dignam 13 og kan skaleres opp eller ned, avhengig av størrelsen av startcellepellets. Vanligvis 1 ml pakkede cellepelleten gir 1 ml endelig atom ekstrakt. Alle buffere bør være iskald, og alle trinn skal utføres i et kaldt rom eller på is hvis en egnet kjølerom er ikke tilgjengelig.
- Isolering av kjerner:
- Forsiktig overføre cellene til en egnet størrelse (15 eller 50 ml) gradert konisk rør og sentrifugering ved 1000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og måle volumet av de pakkede celle pelutleid. 1 ml pakkede celler tilsvarer ~ 3 x 10 8 HEK293 celler.
- Tilsett 5 pakket cellevolum av Buffer A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl og ferskt tilsatt 1 mM DTT, 200 mM PMSF og 1: 1000 proteaseinhibitor cocktail). Resuspender cellepelleten ved forsiktig pipettering.
- Inkuber på is i nøyaktig 10 min.
- Pelletere cellene ved 1000 xg i 10 min ved 4 ° C, og fjerne supernatanten.
- Størrelsen av cellepelleten bør øke opp til 2 ganger under inkubering i buffer A.
- Resuspender cellene i to pakket cellevolum av buffer A, og overføre cellesuspensjonen til en passe stor Douce-vevshomogenisator. Hvis du starter med mindre enn 2 ml pakket celler, bruker en 7 ml homogenisator; for 2 - 4 ml pakket celler, bruker en 15 ml homogenisator; og for 10 eller flere ml pakket celler, bruker en 40 ml homogenisator.
- Homogenisere cellesuspensjon med LØSE glass stampe av Douce-homogenisator unTil 90% av cellene flekken positivt med 1% trypanblått.
- Overfør blandingen til en 45 ml høyhastighets-sentrifuge-rør, og sentrifugering ved 25.000 xg i 20 min ved 4 ° C i en JA-17 rotor eller lignende (se tabell of Materials / Equipment).
- Fra den nukleære pelleten, fjernes supernatanten, som inneholder cytosoliske proteiner eller proteiner som lekker ut av kjernen under fraksjonering.
- Trekke ut kjerner med salt:
- Legg buffer C (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% glyserol, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, og ferskt tilsatt 1 mM DTT, 200 uM PMSF og 1: 1000 proteaseinhibitor cocktail) til det nukleære pellet; bruke 2,5 ml Buffer C for hver 3 ml utgangs pakket cellevolum (~ 1 x 10 9 celler).
- Ved hjelp av en glasstav eller en pipette, løsne den nukleære pelleten fra veggen av røret, og overfører hele blandingen til en Douce-homogenisator av en passende størrelse.
- Suspender atomkjerner ved homogenisering the blanding med to slag av en løs stampe.
- Overfør resuspendert atom brøkdel i et avkjølt begerglass. Velg et begerglass, slik at suspensjonen vil fylle begeret til minst 0,5 cm dyp.
- For å trekke ut kjerneproteiner fra kromatin eller andre uoppløselige strukturer, gradvis øke saltkonsentrasjonen i suspensjonen til 0,42 M NaCl ved dråpevis tilsetning av 5 M NaCl mens forsiktig omrøring av suspensjonen med en pipette eller glasstav på is; Når alle de 5 M NaCl ble tilsatt, bør oppløsningen blir svært viskøs eller gel-lignende. Beregn volum av 5 M NaCl nødvendig for å bringe løsningen til en sluttkonsentrasjon på 0,42 M NaCl i henhold til følgende formel:
- Overføre forsiktig tyktflytende suspensjon i 10 ml polykarbonat rør for en Type 70.1 Ti rotor (eller tilsvarende) eller 70 ml polykarbonat flasker for en Type 45 Ti or lignende rotor (se tabell av materiell / utstyr). Slutter tett med parafilm hvis du bruker 10 ml rør eller med cap montering hvis du bruker 70 ml flasker.
- Sakte gynge de forseglede rørene ved 4 ° C i 30 min ved hjelp av en nutator.
- Spin prøvene i en type 45 Ti eller 70,1 Ti rotor i 30 minutter ved 120000 x g ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten til et enkelt plastrøret eller flasken. Denne supernatant er den kjernefysiske ekstrakt, og pelleten inneholder kromatin og andre atom rusk.
- Dele atom ekstrakt i praktisk størrelse porsjoner, fryse den i flytende nitrogen, og lagre det ved -80 ° C.
5. immunoaffinitetskolonnerensing Rensing av Human INO80 eller INO80 Subcomplexes
- Å tine frosne atom ekstrakt, blir sted rør som inneholder ekstrakt på stasjonære eller roll rør mellom hendene til den frosne materialet en slurry. Deretter plasserer rørene på is eller i det kalde rom inntil ekstraktet er fullstendig thawed.
- Overfør den tinte atom ekstrakt til 10 ml polykarbonat ultrasentrifuge-rør, og sentrifugering ved 100.000 xg i 20 min ved 4 ° C i en type 70.1 Ti rotor eller lignende for å fjerne eventuelt bunnfall som kan ha blitt dannet under fryse-tine syklus.
- Overfør supernatanten til et 15 ml konisk rør. Legg frisk DTT, PMSF, og proteasehemmer Cocktail til sluttkonsentrasjoner av 1 mM DTT, 200 mikrometer PMSF, og 1: 1000 proteasehemmer Cocktail.
- For å fremstille anti-FLAG agarose for immunorensing, overfør 200 pl av 50% suspensjon av anti-FLAG agarosekuler til et 1,5 ml mikrosentrifugerør ved hjelp av en pipette P200 eller lignende med en spiss hvorfra enden er kuttet med en skalpell ren eller barberblad.
- Pellet perlene ved sentrifugering i en bordmikrosentrifuge ved 8000 x g i 30 sek. Fjern supernatanten og vasking av perlene ved å oppslemme perlene i 1 ml av Lys450-buffer, og pellet perlene ved 8000 xg i 30 sek. Vask bEADS to ganger til.
- Suspender vasket Anti-Flag agarosekuler i ca 100 mL av atom ekstrakt med en P200 eller lignende justerbart volum pipette med et tips som til slutt har blitt kuttet med en ren skalpell eller barberblad og, med samme tips, transfer de resuspenderte perler til 15 ml konisk rør inneholdende ekstrakt. Gjenta et par ganger før alle perlene har blitt overført til 15 ml tube.
- Inkuber ekstrakt / perleblandingen i 4 timer ved 4 ° C med langsom rotasjon på en laboratorie-rotator. Valgfritt: Benzonase ved en konsentrasjon på 25 enheter / ml for å fjerne kontaminerende DNA.
- Samle FLAG agarose ved sentrifugering ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspender i 10 ml Lys450 å vaske, inkuber i 5 min ved 4 ° C med forsiktig vuggende på en nutator. Pellet perlene ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspender i 100 - 150 mL av Lys450 og overføre perler til en 1,5 ml mikro tube. Continue å skylle 15 ml konisk rør med 100 - 150 mL av Lys450 til alle perlene har blitt overført til mikrorøret.
- Spinn ned perlene ved 8000 xg i 30 sekunder ved 4 ° C i en mikrosentrifuge. Vask tre ganger med 1 ml Lys450 og en gang med 1 ml EB100 buffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10% glyserol, 100 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,05% TritonX-100, og ferskt tilsatt 1 mM DTT, 200 uM PMSF , og 1: 1000 proteasehemmer Cocktail).
- For å eluere bundet proteiner, tilsett 200 pl EB100 buffer inneholdende 0,25 mg / ml 1x FLAG-peptid. Inkuber i 30 min ved 4 ° C på et hvert nutator.
- Pellet perlene ved 8000 xg i 30 sekunder ved 4 ° C i en mikrosentrifuge. Overfør supernatanten, som inneholder det eluerte INO80 kompleks, til en frisk mikrosentrifugerør.
- Gjenta eluering fire ganger til, og samle alle supernatantene inn i et enkelt rør.
- For å fjerne eventuelle gjenværende FLAG-agarosekuler fra elueres proteinfraksjon,passere eluatet gjennom en tom sentrifugekolonne.
- Konsentrer den eluerte proteinfraksjon ~ 10 ganger ved hjelp av en ultra sentrifugal filteranordning (50,000 molekylvekt cutoff).
- For å fjerne FLAG-peptid, passerer den konsentrerte proteinfraksjon sekvensielt gjennom to avsaltings kolonner.
- Del den rensede, avsaltet proteinfraksjon inn i 20 pl aliquoter, frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C.
- Analyser subenheten sammensetningen av INO80 eller INO80 subcomplexes på sølv-farget gels eller ved western blotting, og anslår deres konsentrasjoner av semi-kvantitativ western blotting ved hjelp av preparater av rekombinante INO80 subenheter med kjent konsentrasjon som standarder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et flytdiagram som oppsummerer fremgangsmåten som brukes til å generere, rense og karakterisere humane INO80 ATP-avhengige kromatin remodeling komplekser.
Som illustrert i figurene 2 og 3, er disse fremgangsmåter muliggjøre generering av både villtypen INO80 og INO80 subcomplexes som mangler forskjellige subenheter, og dermed muliggjør etterfølgende biokjemiske analyser av bidraget av disse mangler subenheter til INO80 sin enzymatiske aktivitet. Figur 2 beskriver to strategier har vi brukes til å definere arkitekturen i INO80 komplekse og til å generere INO80 subcomplexes. I det første, vist i figur 2A, er hele INO80 komplekser renset gjennom FLAG-merkede versjoner av villtype-underenheter (Ies2 eller INO80E). Subcomplexes kan renses gjennom epitop-merket versjoner av muterte Ino80 proteiner som mangler enkelte domener hvor ulike sett av subenheter Assemgjengelig. Som vist i figur 3A, er renheten av de resulterende kompleksene vurdert ved hjelp av sølvfarget SDS-polyakrylamidgeler, mens sammensetningen av kompleksene er vurdert ved hjelp av Western blotting med antistoffer mot forskjellige INO80 subenheter (figur 3B), eller ved massespektrometri (data ikke vist). Ved hjelp av denne tilnærmingen, har vi funnet at de underenhetene som vises i rødt i figur 2A gikk tapt ved sletting av Ino80 NTD (N-terminal domene); subenheter vist i blått gikk tapt ved sletting av Ino80 HSA (helicase SANT Associated) domene; og at SNF2 ATPase-domenet, sammensatt av SNF2N og HelicC regioner (purpur) adskilt av en lang innsetting region (hvit), var nødvendig og tilstrekkelig for binding til underenheter som er vist i purpur. Dermed, INO80 subcomplexes (INO80ΔN.com eller INO80ΔNΔHSA.com) som mangler enten de underenhetene som vises i rødt eller subenheter vist i rødt og blått kan bli renset gjennom FLAG-Ino80ΔN eller FLAG-INO80ΔNΔHSA, henholdsvis 5.
Det er også mulig å generere subcomplexes ved tappe individuelle subenheter fra celler som uttrykker en passende FLAG-merket INO80 subenhet (upubliserte resultater). I det første eksempel som er vist i figur 2B, siRNA-mediert knockdown av subenheten X tapper bare X fra INO80 komplekset, noe som tyder X ikke er nødvendig for montering av andre underenheter i INO80. I det andre og tredje eksempler, siRNA knockdown av enten Y eller Z fører til co-uttømming av både Y og Z underenheter, noe som tyder Y og Z sammen inn i INO80 kompleks i et innbyrdes avhengig måte.
. Figur 1. Flytskjema som beskriver fremgangsmåter som brukes til å generere, rense og karakterisere humane INO80 ATP-avhengige kromatin remodeling komplekser F, et N-terminalt i-ramme FLAG-epitop tag; GOI, Gene-of-ininteresse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Diagram som viser de to strategier som brukes til å generere INO80 subcomplexes som inneholder et undersett av subenheter. (A) Det Ino80 ATPase inneholder regioner som fungerer som modulære stillasene på hvilke de andre INO80 subenheter montere. (B) siRNA-mediert knockdown kan benyttes for å tømme den ønskede subenhet (X eller Y eller Z) fra celler som uttrykker et passende FLAG- tagget INO80 subenhet (f.eks FLAG-Ino80ΔN). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
![Figur 3]("/files/ftp_upload/51720/51720fig3highres.jpg")
Figur 3. Analyse av sammensetningen av immunopurified INO80 komplekser og subcomplexes. (A) INO80 komplekser eller subcomplexes ble renset fra celler stabilt uttrykker de angitte FLAG-merkede proteiner, utsatt for SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese, og visualisert ved sølvfarging. Prøven i det lengst til høyre felts ble fremstilt fra foreldre 293-celler som uttrykker ikke FLAG-merket protein; proteiner som vises i denne kontrollen kjørefelt er forurensninger som binder ikke-spesifikt til FLAG-agarose. Etiketter på venstre side indikerer bånd svarende til flere INO80 subenheter, og de til høyre på mobilitet av molekylvektmarkører. Posisjonen til villtype Ino80 er indikert ved det sorte rektangelet, og posisjoner av Ino80 mutantene er angitt med åpne sirkler. Banene atskilt av den svarte linjen er fra separate gels. (B) INO80 komplekser og subcomplexes ble analysert ved Western blottingved hjelp av antistoffer mot representative subenheter av NTD, HSA og SNF2 moduler. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i The Journal of Biological Chemistry. Chen et al, Subunit Organisering av Human INO80 Kromatin Remo Complex. Et evolusjonært konservert Kjerne Complex katalyserer ATP-avhengige nucleosome ombygging. The Journal of Biological Chemistry Vol 286:. Pp 11283-11289. © 2011, av American Society for biokjemi og molekylær biologi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strukturelle og funksjonelle studier av multi-subenheten pattedyr kromatin remodeling komplekser fra høyere eukaryoter har vært hemmet av vanskeligheten med å forberede biokjemisk nyttige mengder av slike komplekser som inneholder mutant underenheter eller mangler visse subenheter helt. Det finnes en rekke tekniske hindringer: For det første har genetisk manipulering i pattedyrceller har vært teknisk krevende og tidkrevende. I motsetning til gjærceller, hvis genom lett kan redigeres og målrettet ved hjelp recombineering teknikker, er den pattedyrgenomet strukturelt mer komplekse og mindre mottagelige for recombineering intervensjoner. Således er sletting eller modifikasjon av pattedyrgener i dyrkede celler eller dyr mer tidkrevende og krever mer spesialisert kunnskap. Som en konsekvens, har dannelsen av mutante pattedyr-komplekser som bærer mutasjoner eller strukturelle mangler undergrupper av subenhet (e) har vært hastighetsbegrensende. For det andre tilnærminger biokjemiske rekonstituering bruker heteroautologe protein uttrykk systemer er ofte brukt til å generere definerte multi-protein forsamlinger. Men slike tilnærminger bli teknisk utfordrende for svært store komplekser, hvis subenheter kan måtte samtidig uttrykt i riktig støkiometri og / eller å bli satt sammen i en bestemt rekkefølge, med hjelp fra bestemte anstand eller kofaktorer. Disse problemer er spesielt alvorlige i tilfelle av INO80 komplekse, fordi dens Ino80 ATPase-subenhet er særlig vanskelig å uttrykke i insekt eller E. coli-celler i biokjemisk nyttige mengder. I studier av INO80 kromatin ombygging komplekset, har det vært mulig å omgå noen av disse utfordringene ved hjelp av de strategier som er beskrevet i denne protokollen.
Generering av humane cellelinjer som stabilt uttrykker epitop merket subenheter av INO80 komplekset er et viktig trinn i denne fremgangsmåten, som gjør det mulig for rensing av veldefinerte kromatin remodeling komplekser som kan bli testet ved hjelp av en rekke biokjemiske enssays. Selv om det i prinsippet mer tidkrevende å generere stabile cellelinjer enn å bruke transient transfeksjon for å gi modifiserte cDNA inn i pattedyrcellelinjer for produksjon av rekombinant protein, lider transient transfeksjon av flere ulemper. For det første DNA-i form av en forbigående transfektert ekstra-kromosomal vektor-er kortvarig og kan vanligvis ikke av seg selv forplante under cellesyklusen. Sekund, transfeksjon effektivitet varierer sterkt avhengig av celletype og vekstvilkår. Heterogen transfeksjon kan forårsake en mosaikk uttrykksmønster som ensidige selektiv vekst fordeler eller ulemper innenfor cellepopulasjonen. Således, forbigående transgener innført en tendens til å gå tapt i løpet av de mange cellepassasjer som kreves for å generere den store mengden av celler som er nødvendig for rensing av biokjemisk nyttige mengder protein. Stabile cellelinjer er oftest generert ved hjelp av fremgangsmåter som fører til tilfeldig integrasjon av cDNA'ene som koder for et proteinav interesse. Imidlertid kan tilfeldig integrerte cDNAs forstyrre uttrykk for endogene gener og er underlagt genet Slå med flere celle passasjer. Av disse grunner, vi vanligvis innføre Ino80 cDNA inn i celler ved hjelp av Flp-mediert rekombinasjon teknologi, hvori cDNA er stabilt inkorporert i en bestemt kromosomal plassering via Flp rekombinase-mediert innføring i en enkelt FRT side stabilt integrert i genomet.
Under valg av stabile cellelinjer, er det viktig å være i stand til å oppdage eksogent uttrykt, FLAG-merket, villtype eller mutant Ino80 proteiner. Fordi FLAG-merket protein Ino80 er ofte uttrykt ved svært lave nivåer, og er derfor vanskelig eller umulig å påvise ved western blotting i rå lysater av celler dyrket i en enkelt brønn av en 24-brønns plate, er det ofte nødvendig for å ekspandere den første klonale cellepopulasjonen før screening for ekspresjon av Ino80 protein. FLAG-merket Ino80 protein kan da bli renset og concentrated av FLAG immunorensing før analyse av Western blotting.
Effektiviteten av siRNA-mediert knockdown er ganske følsomme for celletetthet på tidspunktet for transfeksjon; vi fant ut at knockdown effektivitet redusert når transfections ble utført med celler på andre enn det som anbefales i protokollen tettheter. Det optimale tidsrom for siRNA transfeksjon er variabelt og må bestemmes empirisk for hver target protein, da det avhenger av stabiliteten av målproteinet, omløpshastighet av den målrettede protein i proteinkomplekser, og i hvilken grad proteinet er nødvendig for celle-levedyktighet. Som et alternativ til bruk av transient transfeksjon av sirnas å utarme individuelle underenheter, kan det være ønskelig å vurdere generere cellelinjer stabilt uttrykker shRNAs henhold selektivt press som det kan være lettere og mer kostnadseffektivt å vokse biokjemisk nyttige mengder av slike cellelinjer. Imidlertid kan det vise seg vanskeligå skaffe tilstrekkelig knockdown ved hjelp shRNA-mediert knockdown i stabile cellelinjer.
Også nøkkelen til suksess for vår fremgangsmåte er bruken av nukleære ekstrakter som utgangsmateriale for rensing av INO80 komplekser. Vi har funnet at immunopurified INO80 komplekser fra hele celleekstrakter blir ofte forurenset med ATPase og / eller nucleosome remodeling aktiviteter som er uavhengige av Ino80 ATPase; slik forurensning er i stor grad unngås når komplekser blir renset fra atom ekstrakter.
Utarbeidelse av atom ekstrakter og isolering av intakte INO80 komplekser avhenger av en rekke kritiske faktorer. Først bør cellene brukes til å forberede atom ekstrakter være intakt og sunn. Den vaskede cellepelleten ventes å svelle opp til to ganger etter inkubasjon i hypoton buffer A. Dersom cellene ikke svelle og / eller supernatanten blir turbid på dette trinnet kan utgangs populasjon av celler kan ha vært usunn. Alternativt, Celler kan ha blitt håndtert altfor hardhendt under innhøsting eller resuspensjon trinn, eller de kan ha blitt inkubert for lenge i Buffer A. For det andre er det viktig å ikke over-homogen cellene eller atom pellet, da dette vil skjære kromatin og slipper DNA inn i den oppløselige fraksjonen. DNA i den oppløselige fraksjonen kan interferere med etterfølgende rensing og analyse av INO80 komplekser. Spesielt kan kontaminerende DNA føre til økt dannelse av bunnfall i løpet av inkubasjon av ekstrakten med anti-FLAG agarose, og dermed redusere effektiviteten av vasking og eluering trinn og / eller kan øke overflod av kontaminerende DNA-bindende proteiner i det endelige rensede fraksjon . I tillegg kan det nedstrøms biokjemiske analyser måler aktiviteter som er avhengig av DNA, og dermed potensialet overhenget av DNA fra ekstrakten komplisere tolkningen av disse assays. For å unngå over-homogenisering, under cellelyse er det tilrådelig å kontrollere prosenten trypanblått-positiv celles etter hvert slag av homogenisatoren; for HEK293 celler, nær komplett cellelyse krever vanligvis 4 - 6 slag av homogenisering. Det er også viktig å unngå innføring av luftbobler under homogenisering. Supernatanten fra det 120000 xg spinn i trinn 4.2.8 bør være en klar, ikke-viskøs oppløsning, med bare en minimal mengde av regn eller viskøst materiale i nærheten av kromatin pellets eller flytende på toppen. Ved innsamling av supernatanten, bør man passe på å ikke samle noen av skyet eller tyktflytende materiale, som det kan omfatte kromatin og / eller DNA. Endelig, er det bedre å unngå frysing celler før fremstilling av atom ekstrakter, siden kompleksene fremstilt fra frosne celler har en tendens til å oppvise lavere spesifikk aktivitet, og å inkludere mer forurensende DNA og proteiner.
Det optimale forholdet mellom mengden av utgangsekstrakt og anti-FLAG agarose avhenger av konsentrasjonen av FLAG agn protein til stede i ekstraktene og accessibiheten av FLAG epitop og må bestemmes empirisk. Vi begynner vanligvis immunorensing med 100 ul seng volumet av Anti-Flag agarosekuler og 3 - 14 ml av atom ekstrakt; mengden ekstrakt brukes, avhenger av målene for forsøket og tilgjengelighet av ekstrakt. En enkelt trinn immunorensing ved hjelp av anti-FLAG agarose er vanligvis tilstrekkelig til å rense INO80 eller INO80 subcomplexes til en viss grad tilstrekkelig for pålitelige analyser av deres aktiviteter; imidlertid kan ytterligere rensetrinn (e), slik som gelfiltrering, densitetsgradient sedimentering, eller ionebytterkromatografi være nødvendig for rensing av andre komplekser, eller for å fjerne kontaminerende aktiviteter som kan komplisere tolkningen av biokjemiske analyser.
Strategiene beskrevet her bør generelt være mer nyttig for studier av andre kromatin remodeling enzymer, så vel som andre store multiprotein komplekser. Vellykket anvendelse av disse strategiene til analysen av andre multiprotein kompleksene er avhengig av (i) identifisering av et individ subenhet eller subenhet (er) som tjener som stillas (e) der andre subenheter montere og (ii) definisjonen av bestemte domener eller områder med hvilke spesifikke undergrupper av subenheter montere. Definisjonen av slike domener kan forenkles ved analyse av den primære sekvens av kjernen stillaset subenhet (er) for evolusjonært konserverte regioner eller områder som svarer til kjente strukturelle domener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Arbeid i forfatternes laboratorium er støttet av et stipend fra National Institute of General Medical Sciences (GM41628) og ved en bevilgning til Stowers Institute for Medical Research fra Helen Nelson Medical Research Fund i Greater Kansas City Community Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | |||
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).
- Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).
- Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5 (5), 521-527 (1994).
- Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).
- Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).
- Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).
- Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16 (4), 730-735 (1994).
- Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 207-245 (2005).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).
