Introduction
SNF2家族のクロマチンリモデリング複合体は、中央SNF2様ATPアーゼサブユニット1,2を含む。単一のサブユニットの酵素など、一部SNF2様ATPアーゼ機能、他の人がより大きなマルチサブユニット複合体の触媒サブユニットとして機能している。クロマチンリモデリング複合体のサブユニットのそれぞれが自分の活動に貢献する分子メカニズムを解明することリモデリングプロセスを分析生化学的アッセイを行う能力が必要です。
人間INO80複合体および他のクロマチンリモデリング酵素によるATP依存ヌクレオソームのリモデリングは、その、DNAおよび/またはヌクレオソーム依存ATPaseの活性化に続いて、ヌクレオソームのリモデリング酵素の結合で始まる多段階のプロセスとして考えることができるヌクレオソームDNA上のリモデリング酵素の転座、およびヌクレオソーム1,2の最終的な再配置。 ATP依存性クロマチンリモデリングプロセスrの分子の詳細を理解するその個別のステップや反応の各ステップにクロマチンリモデリング複合体の各サブユニットの寄与の定義にリモデリング反応の解剖をequires。このような分析は、 インビトロで規定された分子基質を用いてヌクレオソームのリモデリングおよび他の活動を分析する能力を必要とする。
以前JOVEプロトコルでは、定義されたサブユニット組成物3とINO80クロマチンリモデリング複合体とsubcomplexesを生成するために使用される手順を説明した。ここでは、3ヌクレオソーム結合、DNAおよびヌクレオソーム活性化ATPアーゼの定量分析を可能にする生化学的アッセイ、およびこのような複合体に関連したヌクレオソームのリモデリング活動を紹介します。
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Protocol
1 ATP依存性ヌクレオソームリフォームアッセイ
ATP依存性ヌクレオソームのリモデリング活性を測定するために、INO80またはINO80のsubcomplexesは、ATPおよび216塩基対、32 P-標識DNA断片の一端に配置された単一のヌクレオソームが含まmononucleosomal基質と共にインキュベートされる免疫精製。反応生成物は、ネイティブポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に供される。
- 32 P-標識された、「601」DNA断片を生成すること、などのオリゴヌクレオチド5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGGおよび5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAGを使用して、をpGEM-3Z-601 4から末端に位置する601ヌクレオソームの位置配列を含む216 bpのDNA断片を増幅フォワードおよびリバースプライマー。
- 表1に記載したように100μlのPCR反応をセットアップします。
- 以下のプログラムを使用して、サーマルサイクラー中でPCR反応を実行します。1分96℃、followeで94°C、57°Cで30秒、30サイクル、72℃で60秒で45秒間によってD; 72℃で7分で終わる。
- PCR反応が完了した後、ヌクレアーゼフリースピンカラムを二度反応生成物を通過させることによって、取り込まれなかったヌクレオチドを除去する。
- PCR反応は、所望の〜216 bpのDNA断片を生成したことを確認するために、1.2％アガロースゲル中で精製されたPCR産物5μlを実行する。
- 精製したPCR産物5μlの20倍に希釈し、UV分光光度計を用いてDNA濃度を測定する。平均収量は約40 ngの/μlです。
- シンチレーションカウンターでの精製したPCR産物1μlの放射能を測定します。 CPM / NGを算出することにより、標識効率を推定します。成功した標識反応は、601 DNA断片の〜15000のcpm / ngのをもたらすことが期待される。
- 連続希釈法5を用いて標識601のDNA上にHeLa細胞ヌクレオソームを転送します。
- の2ピコモルを混ぜる1.0 MのNaCl、10 mMトリス塩酸、pH 8.0、1 mMのEDTA、0.1mMのPMSF、及び1mMを含有する緩衝液50μl中のHelaヌクレオソーム（後述5のように調製した）6μgの32 P-標識された601のDNA断片DTTおよび30分間30℃でインキュベートする。
- 順次10mMトリス塩酸（pH8.0）を12.5μlの20.8μlを、および41.6μlを、、、1mMのEDTA、0.1mMのPMSFで希釈して0.8 M、0.6 M、0.4 MのNaClの混合物を希釈し、そして1mMのDTT、各希釈後、30℃で30分間のインキュベーションである。
- さらに0.2 Mに混合物を希釈した後、0.1MのNaClを125μlに添加することによって、その後、0.1％のNonidet P-40、30分のインキュベーションで20％グリセロール、および200μg/ mlのBSAを含有する同じ緩衝液を250μl最後の二つの希釈液は30℃で。最大3ヶ月間4℃でモノヌクレオソーム基質を保管してください。
- 総容量10μlでの反応をスライドATP依存性ヌクレオソームを実行します。レアINO80ヌクレオソームのリモデリング活性のための最適なNaCl濃度であるためctionコンポーネントは、〜50mMのNaCl（未発表の結果） 表2に記載されている、考慮中に含まれる食塩の量を考慮して、50 mMの各反応中のNaClの総濃度を調整するヌクレオソームと酵素の調製。
- アッセイをセットアップするために開始する前に、ネイティブのポリアクリルアミドゲル（18×16 cm）のキャスト。 5％のアクリルアミドを含む単一のゲルを調製するために（アクリルアミド：37.5ビスアクリルアミド：1）、0.5×TBE（45 mMトリス、ホウ酸、1mMのEDTA）、0.01％の過硫酸アンモニウム（APS）、および0.001％N、N、N'、 N'の -tetramethylethylenediamine（TEMED）、 表3に列挙した成分を混合する。ゲルは、室温で少なくとも2時間重合することができるようにします。
- EB100バッファの量がまた、各反応を実行するために、予備冷却シリコン処理1.5mlのマイクロチューブに組み合わせる〜20 nMのINO80またはINO80のサブコンプレックス（3記載のように調製した）（
- 'X'（ここで、X =反応3の合計数）倍にスケールアップ、食材の残りの部分とマスターカクテルを設定します。 1つの10μlの反応に必要な各成分の量を表5に記載されている。レシピは、実行される反応の数に応じてスケールアップされるべきである。チューブをタップして、またはピペッティングでよく混合し、ダウンピペットマンとし、卓上型微量数秒間チューブをスピン。
- ステップ1.3.2で設定反応管のそれぞれにマスターカクテルの5.25μLを分注する。ピペッティングでよく混ぜる。 30℃のヒートブロックまたはウォーターバスに反応管を転送することにより反応を開始し、2時間インキュベートする。
- 一方、競合DNAを含むカクテル」のミックスを削除する」の準備とX（X =反応+ 4の合計数）倍にスケールアップヌクレオソーム、。単一の反応用混合物を除去する1.5μlの準備に必要な各成分の量を表6に記載されている。レシピは、実行されるアッセイの数に応じてスケールアップされるべきである。
- 取り外しミックス1.5を添加することにより反応を終了します。よく混合し、スピンダウンし、そしてさらに30分間30℃でインキュベートする。
- 一方、定数バッファの循環を維持するために、下部チャンバー内の磁気攪拌棒をランニング緩衝液として0.5×TBEを使用して、4℃で30分間、100Vで垂直電気泳動装置におけるネイティブポリアクリルアミドゲルを予め実行します。
- サンプルをロードするには、3倍のTBE、30％グリセロール、0.25％ブロモフェノールブルー、0.25％キシレンシアノールFFを含むローディング色素の2.5μlを添加する。簡単にサンプルをスピン、よく混ぜ、ロードのヒントを使用してゲルにロードします。
- バッファーの循環で、4℃で4.5時間、200Vでゲルを実行します。
- 信号を検出するために、濾紙の二枚のスタックにゲルを移す。透明なプラスチックのラップを使用して、上にゲルをろ紙をラップしてから、所望の時間、4℃で貯蔵燐光体スクリーンに公開。
- 同位体イメージングスキャナシステムで画面をスキャンし、適切なソフトウェアを用いてデータを分析する。
2モノヌクレオソーム結合アッセイ
モノヌクレオソームの指定されたINO80複合体の結合親和性をアッセイするために、ステップ1.2で生成されたmononucleosomal基板を用いた電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を行う。
- セットアップ反応はヌクレオソームのリモデリングアッセイのために説明したが、ATPを省略して、反応からミックスを削除するなどの結合アッセイのためのミックス。 30分間30℃でインキュベートする。
- 各反応混合物にローディング色素の2.5μlを加えて、3.5％のアクリルアミド（アクリルアミドを含む未変性ポリアクリルアミドゲルに適用されます。3ビス7.5：1）、1％グリセロール、0.5×TBE、0.01％APS、および0.001％TEMED。
- ランニング緩衝液として0.5×TBEを使用して、バッファの循環で、4℃で2.5時間、200Vでゲルを実行し、ストレージ蛍光スクリーンに公開。
3 DNA-とヌクレオソーム依存ATPアーゼアッセイ
20mMトリス塩酸（pH7.5）、60mMのNaClを、6.6のMgCl 2、0.8mMのEDTA、0.015％のNonidet P-40、2.5％グリセロール、0.1 mg / mlのBSA、1を含む5μlの反応混合物中でATPアーゼアッセイを行うのDTT、0.1mMのPMSF、2mMのATP、[α-32 P] ATP（3,000 Ciを/ミリモル）の2μCiの。 INO80複合体の各INO80複合体または量は、3つの並列反応、DNA-またはヌクレオソームに依存しないATPアーゼを測定するための1を含むEB100バッファー、測定するために閉環状プラスミドDNA（5000塩基対、約30 nM）を含有するものを設定してアッセイするために、DNA依存ATPアーゼ、およびヌクレオソーム依存ATPアーゼを測定するために、ヒーラオリゴヌクレオソーム（〜185 nM）を含有するもの。全ての反応は氷上でセットアップします。
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Representative Results
図面は、ヌクレオソームスライド（ 図1）との結合（ 図2）アッセイおよびDNA-またはヌクレオソーム依存性ATPアーゼアッセイ（ 図3）を含むINO80活動を特徴付けるために使用される生化学アッセイの代表的結果を示す。
図1に示されている実験は、完全なINO80複合体の能力は、FLAG-Ies2またはFLAG-INO80Eを通して精製し、INO80が216塩基対、放射性標識されたDNA断片上に組み立てモノヌクレオソームのリモデリングを触媒するために、FLAG-Ino80ΔNまたはIno80ΔNΔHSAいずれかを介して精製しsubcomplexesで比較します。 DNA断片上のヌクレオソームの位置は、電気泳動移動度に影響を与えます。横方向に配置さヌクレオソームはより速く、より中央に位置するヌクレオソームよりもゲル中に実行。 INO80クロマチンリモデリング複合体を優先的にDNA 6,7,8の一片の中心に向かってモノヌクレオソームを移動するので、再構築活動はMONIです電気泳動移動度を減少させた展示ヌクレオソームの人口の出現によってtored。反応の終了時に、ヒーラオリゴヌクレオソーム及びサケ精子または他のDNAの過剰は、結合したリモデリング酵素はヌクレオソームの電気泳動移動度が変化しますので、任意の基板に結合したINO80またはINO80 subcomplexesを除去するために競争相手として反応混合物に添加する必要があります基板。 Ino80ΔNΔHSAを通して精製複合体はまたArp4、Arp8、およびYY1に欠けている間FLAGIno80ΔNを通して精製複合体は、後生動物特有のサブユニットINO80D、INO80E、阿弥陀、MCRS1、NFRKB、およびUCH37を欠いている。 FLAG-Ies2、FLAG-INO80E、およびFLAG-Ino80ΔNを通して精製複合体は、後生動物特有のサブユニットはINO80複合体によるヌクレオソームのリモデリングのために不要であることを示し、同様の活性を有している。リモデリング活性がINO80 ATPのHSAドメインに依存することを示し、対照的に、複合体は、FLAG-Ino80ΔNΔHSAを通して精製し、このアッセイにおいて不活性であるアーゼおよび/またはそれに関連するサブユニット。
図2の実験では、電気泳動移動度シフトアッセイを使用して、INO80とINO80 subcomplexesの結合活性をヌクレオソームを比較します。これらのアッセイは、ヌクレオソーム結合複合体を除去するための反応の終了時およびオリゴヌクレオソームDNA無添加がないことを除いて、ヌクレオソーム再構築アッセイと同様に行われる。したがって、無傷のINO80複合体の量の増加に伴ってヌクレオソームのインキュベーションはINO80Eサブユニットを通して精製は、無料のモノヌクレオソームおよびゲルの上部付近に移動し、種を新しい「シフト」の出現（レーンに対応するバンドの用量依存性の消失につながる6-8）。これとは対照的に、ときヌクレオソームは、シフトした種は、より迅速に移行するINO80サブユニットのサブセットを欠いIno80ΔNを通して精製されていたより小さな複合体とインキュベートする（レーン2-5および9-11）は、ことを示唆している相対的な暴徒スーパーシフトしたバンドのilityアッセイ複合体のサイズによって決定される。
図 DNA- 2つの異なるINO80のsubcomplexesのヌクレオソーム活性化ATPアーゼ活性を比較するアッセイの結果を図3に示す。よりゆっくりと移動するスポットが開始α-32 Pに対応してATPを標識し、より迅速に移行する種は、ADPの反応生成物である;矢印は、溶媒の移動の方向を示す。
ここでアッセイした複合体の一つは、INO80ΔNは、他の、INO80ΔNCながら、INO80 C末端領域を欠いている、タンパク質の通常のC末端にまで及ぶINO80 ATPアーゼサブユニットが含まれています。これら2つの複合体は、他の点では同一であるが、（ADPへの放射標識ATPの変換によって測定される）ATP加水分解の速度は、INO80 ATPアーゼのC末端は負にその活性を調節することが示唆INO80ΔNCの存在下でより大きい。尚、ATPのhydr率両方の複合体によるolysisは複合体がATP加水分解のためのヌクレオソームの基質を好む改造INO80のヌクレオソームを示唆し、DNAよりもヌクレオソームの存在が大きい。
図に示されるアッセイでは、DNAのみ、または（検出不可能からDNA /ヌクレオソームの存在下で観察されるの<5％の範囲）ヌクレオソームを欠く反応でATP加水分解の非常に低いレベルがある。 INO80およびその他SNF2ファミリークロマチンリモデリング酵素のATPase活性が強く、DNAまたはヌクレオソームによって刺激されるので、INO80複合体の精製調製物の実質的なDNA-および/またはヌクレオソーム非依存ATPアーゼ活性の存在は、細胞の夾雑物の存在を示唆しているDNA、またはその代わりに、成功した精製の間に除去されなかった非INO80 ATPアーゼを汚染する。いくつかのステップは、精製中に、不要なDNAおよび/またはATPアーゼを導入最小限にするために撮影することができます。
1）■を増やす精製中の結合および洗浄工程におけるALT濃度（NaCl）を。結合および洗浄工程中の200mM未満のNaClの使用は、通常、DNAおよび/またはATPアーゼの混入許容できないレベルでモデリング複合体の調製物をもたらす。私たちは、日常的に（3を参照）の汚染物質を最小限に抑えるために450mMのNaClを含む緩衝液を用いてINO80複合体を精製する。私たちは、アクティブINO80複合体を精製するほど1とM NaClを含む緩衝液を使用した。しかし、私たちはこれらの条件下で活性錯体の減少収率を得る;
2）アガロース免疫精製中の細胞溶解液にFLAGの比率を下げる。 FLAG-アガロースの最適量は、滴定によって決定されるべきである。
3）ATP依存性シャペロンは、免疫精製中にFLAGタグタンパク質に結合したままになることがあります。これらは、しばしば免疫精製の間に、洗浄緩衝液中1mMのATPを含むことによって除去することができる。
4）私たちは、successfullを持っているyのFLAG-アガロースビーズと抽出物のインキュベーション中25単位/ mlの濃度でベンゾナーゼを含めることにより、DNAを汚染除去された。注意：これは、残留アーゼはINO80活性についてのアッセイの間、基質DNAまたはヌクレオソームが低下しますように、ベンゾナーゼが、後続の洗浄工程の間に除去されていることを確認することが不可欠である。
これらのATPアーゼアッセイの解釈は、原則として、INO80クロマチンリモデリング複合体はSNF2状コアATPアーゼINO80、アクチン様タンパク質Arp5、Arp8、Baf53a、アクチン、およびAAA +を含むいくつかの潜在的なATPアーゼを含むという事実によって複雑にすることができたATPアーゼTip49aとTip49b。複数ATPアーゼの物理的な存在にもかかわらず、しかし、以前の研究では、触媒活性INO80を含む唯一の複合体は、DNAまたはヌクレオソーム活性化ATP加水分解をサポートできることを示している。 INO80 ATPaseの触媒的に不活性なE653Qフォームを含む複合体は、検出可能な、DNAまたはヌクレオソーム刺激されたATPアーゼACTIを示すことができないいかなる条件の下でVITY 8をテストした。このように、DNA-および/またはINO80またはINO80のsubcomplexesのヌクレオソーム刺激されたATPase活性は、主にINO80 ATPアーゼサブユニットによって寄与される。
図1 INO80ヌクレオソームのリモデリング活動はINO80 HSAドメインおよび/ または関連するサブユニットに依存するが、INO80 NTDと後生動物特有のサブユニットから独立しています。ヌクレオソーム改造アッセイはFLAGを発現する細胞株から調製した核抽出物からFLAG-免疫精製複合体を用いて実施した野生型または変異INO80サブユニットのタグ付きバージョン。無傷INO80複合体はFLAG-Ies2またはFLAG-INO80Eを発現する細胞株から精製した。 INO80のsubcomplexesはFLAG-Ino80ΔNまたはFLAG-Ino80ΔNΔHSAを発現する細胞株から精製した。 1の相対濃度（相対濃が。）〜10 nMのINO80複合体に対応している。
INO80複合体によって結合図2ヌクレオソームはINO80 NTDと後生動物特有のサブユニットから独立しています。ヌクレオソーム結合アッセイは、指示されたFLAG-免疫精製INO80複合体のさまざまな量の存在下で実施した。安定的にINO80またはINO80のsubcomplexesによって拘束モノヌクレオソームに対応する低速の移行「スーパーシフト」バンドの出現で結果をモノヌクレオソームするINO80またはINO80のsubcomplexesの結合。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 51721 / 51721fig3highres.jpg "/>
図3 DNA-とヌクレオソーム依存ATPアーゼアッセイ。TLC（薄層クロマトグラフィー）は、ATPアーゼアッセイを通して精製subcomplexes INO80によるATP加水分解の速度を測定するために実施されたベースのFLAG-Ino80ΔN（ΔN）またはFLAG-Ino80ΔNC（ΔNC）でのDNAまたはヌクレオソームの飽和量の存在。アッセイは、各複合体（5および10nM）の3つの異なる反応時間のための2つの異なる濃度を用いて行った。反応で（ピコモルで）加水分解されたATPの量は、各パネルの下に表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 67.5μlの | H 2 O |
| 10μlの | 10×PCR反応緩衝液（材料リストを参照してください） | </ TR>
| 1μlの | をpGEM-3Z-601（10 ngの/μL） |
| 5μlの | フォワードプライマー（10μM） |
| 5μlの | リバースプライマー（10μm程度） |
| 0.5μlの | 10 mMの4種のdNTPを含むdNTPの各ストック溶液 |
| 1μlの | Taq DNAポリメラーゼ（5ユニット/μl） |
| 10μlの | [α-32 P] dCTPを（6,000 CI /ミリモル、3.3μM） |
放射性標識された「601」DNA断片のPCR増幅のための表1の反応混合物。
| 20 nMの | INO80またはINO80 subcomplexes |
| 2.8 nMの | ヌクレオソーム（32 P-標識したDNA断片601及びヒーラ細胞のヌクレオソームにモノヌクレオソームの混合物からなる） |
| 1 mMの | 超高純度のATP |
| 20 mMの | HEPES-NaOHを（pHは7.9） |
| 50 mMの | NaClを |
| 5 mMの | のMgCl 2 |
| 1 mMの | ジチオスレイトール（DTT） |
| 0.1 mMの | フェニルメタンスルホニルフルオライド（PMSF） |
| 0.1 mg / mlの | ウシ血清アルブミン（BSA） |
| 5％ | グリセロール |
| 0.02％ | ノニデットP-40 |
| 0.02％ | トリトンX-100 |
ATP依存性ヌクレオソームのリモデリング検定の表2のコンポーネント。
| 32.6ミリリットル | H 2 O |
| 5ミリリットル | 40％アクリルアミド/ビス（37.5：1） |
| 2ミリリットル | 10×TBE（900 mMのトライのホウ酸、20mMのEDTA） |
| ゲルを注ぐ前に、すぐに次の成分を追加します。 | |
| 0.4ミリリットル | 10％過硫酸アンモニウム |
| 0.1ミリリットル | TEMED |
ATP依存性ヌクレオソームのリモデリングアッセイのための未変性ポリアクリルアミドゲルの表3の準備。
| 10 mMの | のHEPES 7.9 |
| 10％ | グリセロール |
| 100 mMの | NaClを |
| 1.5 mMの | のMgCl 2 |
| 0.05％ | トリトンX-100 |
| 使用直前に追加します。 | |
| 1 mMの | DTT |
| 200μMの | PMSF |
| 1：1,000希釈 | プロテアーゼ阻害コックktail（材料リストを参照してください） |
表4 EB100バッファ。
| 3.9μlの | H 2 O |
| 1μlの | 10×リフォームバッファー（200mMのHEPES-NaOH水溶液（pH値7.9）、0.2％NP-40、0.2％トリトンX-100、50％グリセロール、50mMのMgCl 2、1 mg / mlのBSA） |
| 0.1μlの | 100のATP |
| 0.01μlの | 1 M DTT |
| 0.01μlの | 100のPMSF |
| 0.25μlの | ステップ1.2から再構成されたモノヌクレオソーム基質 |
表検定改造ATP依存性ヌクレオソームのマスターカクテル5。コンポーネント。
| 0.33μlの | 400 nMのヒーラヌクレオソーム |
| 0.75μlの | 100 nMの超音波処理サケ精子DNAを |
| 0.01μlの | 1 M DTT |
| 0.01μlの | 100のPMSF |
表6ミックスカクテルを取り外す。
| 2μlの | H 2 O |
| 0.25μlの | 400 mMトリス塩酸（pH7.5）、200mMのNaClを含有する20×ATPアーゼ緩衝液、132のMgCl 2、16mMのEDTA、0.3％のNonidet P-40、50％グリセロール、2 mg / mlのBSA |
| 0.1μlの | 100μMのATP |
| 0.005μlの | 1 M DTT |
| 0.005μlの | 100のPMSF |
| 0.1μlの | [α-32 P] ATP（3,000 Ciを/ミリモル） |
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Discussion
確実にするために私たちはアッセイで観察することがヌクレオソームのリモデリングおよびATPアーゼ活性はINO80複合体の触媒活性にではなく、中で精製INO80複合体の触媒的に不活性なバージョンの改造を汚染し、および/またはATPアーゼの酵素、私たちは日常的にアッセイヌクレオソームのリモデリングとATPase活性に依存同じ手順を使用して、野生型INO80と平行である。 INO80複合体またはsubcomplexesの異なる調製物の活性を比較した実験の解釈を複雑にし得るATPおよび/またはATP非依存性リモデリング活性を汚染の存在について試験するためにヌクレオソームのリモデリング活性をアッセイする際にATPを欠いたネガティブコントロール反応もまた実行されるべきである。 INO80またはINO80のsubcomplexesの触媒的に不活性なバージョンは、ヌクレオソームのリモデリングまたはATPアーゼ活性を示すべきではない。また、DNA-またはヌクレオソーム非依存ATPase活性の検出はenzymにATPアーゼ（単数または複数）を、混入の存在を示すE分画。活動はまだ触媒的に不活性INO80の存在下で検出された場合、実質的な、DNAまたはヌクレオソーム非依存ATPase活性があってもで説明したように、精製を最適化した後に存在する場合に「代表的な結果、 '複合体は、さらに、イオン交換または追加のステップを用いて精製することができるゲル濾過クロマトグラフィー又は勾配沈降。
ヌクレオソームのリモデリングおよびATPアーゼ活性を測定すると、製品時間および用量応答曲線が線形であるときに測定が行われていることを確認するための時間の長さを変化させるため、およびINO80またはINO80のsubcomplexesつ以上の濃度でアッセイを実施することが望ましい。同様に、ヌクレオソーム結合アッセイはINO80複合体（複数可）のいくつかの濃度を使用して実行されるべきである。そうでなければ、人は確実に異なるINO80製剤の活性を比較することはできません。
ヌクレオソームのスライドと結合アッセイは、常にコントロール反応を含むべきであるそれは、出発ヌクレオソーム人口の電気泳動移動度を示すためのマーカーとしてだけではモノヌクレオ基板を含む。このように、人は簡単に特異的酵素画分の存在による変化を識別することができる。このような制御反応も再構成されたモノヌクレオソームの完全性を評価。
摺動結合アッセイを容易に解釈ヌクレオソームを行うためには、均質なmononucleosomal基質を生成するのに有用である。その理由のため、このプロトコルに記載されるアッセイは、強力なヌクレオソームの位置配列を含むDNA断片上に組み立てられたヌクレオソームを使用する。 INO80複合体がDNA断片上の中央位置に横方向に配置さヌクレオソームの位置を変更する傾向があるが、このようなISWI含有NURF錯体9のような他のクロマチンリモデリング酵素は、DNA断片の末端に向かって複数の中央位置からヌクレオソームを移動させる。したがって、任意のクロマチンリモデリングの特性評価中にエンそれはヌクレオソーム位置決めシーケンスが異なる位置にある、モノヌクレオソームの基質を調製するために有用であるザイム。あるいは、ヌクレオソームは、ヌクレオソームの位置配列を含まないDNA断片上に組み立てられている基板を用いることができる。この場合、出発ヌクレオソーム集団は、中央に横方向に配置ヌクレオソームの混合物が含まれる。
ATP依存性ヌクレオソームのリモデリングプロセスは、反応が平衡に達するとヌクレオソームの位置の変化につながらない可能性DNAからの完全なヌクレオソームの変位、DNA上のヌクレオソームの動き、またはヌクレオソーム構造の過渡的な変化を含め、さまざまな改造の成果につながる可能性それにもかかわらず、機能的に重要である。ヌクレオソームスライディングアッセイは、最初の2つの反応を監視することができる説明するが、ヌクレオソーム構造中に一過性の変化を検出することができないかもしれない。このようないくつかの過渡的なALTを検出することができる一つのアッセイみようスライドまたはヌクレオソームDNAの部分的な巻き戻しが切断に感受性であるヌクレオソームによって八量体表面から変位されたリンカーDNAのに対し、ヌクレオソーム八量体の表面上のヌクレオソームDNAの制限酵素による切断の大部分はアクセス不能であるという事実を利用する10,11,12。このようなアッセイはまた、ヌクレオソームのリモデリング酵素は、それが競合他社13によって除去することができないことをその基質に非常に緊密に結合した場合に特に有用であり得る。
私たちのヌクレオソーム摺動結合アッセイは、ネイティブヒーラ細胞ヒストンを用いて調製mononucleosomal基板を用いINO80活動を測定する。しかし、INO80または他のクロマチンリモデリング酵素のリモデリング活性は、原理的には、特定の翻訳後修飾またはヒストン変異体の存在または非存在によって影響され得る。また、モノヌクレオソームはジ - ヌクレオソームとは異なるINO80複合体の活動を刺激することができる、またはヌクレオソームの配列。従って、より複雑で多様なヌクレオソーム基板を用いINO80複合体の活性を測定するINO80クロマチンリモデリング複合体が調節されるメカニズムへの洞察を提供してもよい。
ヌクレオソームのリモデリングおよび結合アッセイにおける放射性標識されたDNA断片を使用する代わりに、一部の研究者は、エチジウムブロマイド14とヌクレオソームDNAを染色することによってヌクレオソームおよび/ またはDNAを可視化;しかしながら、アッセイは、典型的には、かなり多くの酵素の使用を必要とし、このプロトコルに記載されたものよりもかなり敏感であることができる非放射性検出方法を使用して行った。
ここで説明する32 P-ベースのアッセイを使用して時間の関数としてのATPアーゼ反応の進行を監視する各時点での試料の取り扱い及び分析の個別のラウンドを必要とする。別のアプローチとして、ATPアーゼ活性は、蛍光に基づくアッセイを用いて測定することができる 私たちはこのJOVE論文に記載された手順は、ATP依存性ヌクレオソームのリモデリングの過程でINO80またはINO80 subcomplexes三つの異なる生化学的性質を特徴付けるために使用されてきた。これらのアッセイにおいて、さまざまなINO80 subcomplexesまたはINO80変異体を用いることにより、INO80のヌクレオソームのリモデリング活性に対するさまざまなINO80サブユニットおよび/またはドメイン構造の機能的寄与を分析し、INO80サブユニットにおけるリモデリング反応工程（s）を定義することができるおよび/またはドメインは、重要であり得る。これらの手順は、他のヌクレオソームのリモデリングの研究と結合酵素およびATPアーゼワットに適合させることができるi番目DNA-とヌクレオソーム依存性または非依存性活性の両方。私たちは別のクロマチンリモデリング酵素は人間INO80複合体よりも高いか低い内因性ATPaseまたはヌクレオソームのリモデリング活性を有し得ることに注意してください。リモデリング酵素の他のクロマチンの解析のためにこれらのプロトコルを適応させる際従って、一つが検討されている特定の酵素についてのアッセイを最適化するために酵素、ATP、DNAまたはヌクレオソームの濃度、および反応時間および/または温度を変化させるべきである。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
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