Introduction
Complejos remodeladores de cromatina familia SNF2 incluyen una SNF2 como ATPasa subunidad central de 1,2. Algunos ATPasas función como SNF2 como enzimas de subunidades individuales, mientras que otros funcionan como la subunidad catalítica de complejos de múltiples subunidades más grandes. Dilucidar los mecanismos moleculares por los cuales cada una de las subunidades de la cromatina complejos remodeladores de contribuir a sus actividades requiere la capacidad de realizar ensayos bioquímicos que diseccionan el proceso de remodelación.
Remodelación nucleosoma dependiente de ATP por el complejo INO80 humana y otras enzimas remodelación de la cromatina puede ser concebido como un proceso de múltiples pasos que comienza con la unión de la enzima a la remodelación nucleosomas, seguido por la activación de su ADN y / o nucleosoma-ATPasa dependiente, translocación de la enzima sobre el ADN nucleosomal remodelación, y la eventual reposicionamiento de los nucleosomas 1,2. La comprensión de los detalles moleculares de la ATP-dependiente proceso de remodelación de la cromatina requiere disección de la reacción de remodelación en sus pasos individuales y definición de las contribuciones de las subunidades individuales del complejo de remodelación de la cromatina a cada etapa de la reacción. Tales análisis requieren la capacidad de analizar la remodelación nucleosoma y otras actividades utilizando sustratos moleculares definidos in vitro.
En un protocolo JOVE anterior, describimos los procedimientos utilizados para generar complejos remodeladores de cromatina INO80 y subcomplexes con composiciones de subunidades definidas 3. A continuación, presentamos tres ensayos bioquímicos que permiten el análisis cuantitativo de la unión, ADN y-nucleosoma activado ATPasa, y actividades de remodelación de nucleosomas asociados con tales complejos de nucleosomas.
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Protocol
1. ATP-dependientes Nucleosome Remodelación ensayos
Para medir las actividades de remodelación nucleosoma dependiente de ATP, inmunopurificado INO80 o subcomplexes INO80 se incuban con ATP y un sustrato mononucleosomal, que contiene un único nucleosoma posicionado en un extremo de un fragmento de ADN de 216 pb, marcado con P 32. Los productos de reacción se someten después a electroforesis en geles de poli-acrilamida nativos.
- Para generar el fragmento de ADN marcado con 32P '601', amplificar de pGEM-3Z-601 4 un fragmento de ADN de 216 pb que contiene una secuencia de 601 el posicionamiento de nucleosomas final ubicado, utilizando los oligonucleótidos 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG y 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG como adelante y atrás primers.
- Configurar una reacción de PCR 100 l como se describe en la Tabla 1.
- Lleve a cabo las reacciones de PCR en un termociclador con el siguiente programa: 1 min a 96 ° C, followed por 45 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 57 ° C, 60 segundos a 72 ° C durante 30 ciclos; terminando con 7 min a 72 ° C.
- Después de que se terminó la reacción de PCR, eliminar los nucleótidos no incorporados haciendo pasar los productos de reacción dos veces a través de columnas de centrifugado sin nucleasa.
- Ejecutar 5 l de producto de PCR purificado en un gel de agarosa al 1,2% para confirmar que la reacción de PCR generó el fragmento de ADN de ~ 216 pb deseado.
- Diluir 5 l de producto de PCR purificado de 20 veces, y medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro UV. El rendimiento promedio es de ~ 40 ng / l.
- Medir la radiactividad de 1 l de producto de PCR purificado en un contador de centelleo. Estimar el etiquetado de eficiencia mediante el cálculo de la cpm / ng. Se espera una reacción de marcado con éxito para producir ~ 15.000 cpm / ng de fragmento de ADN de 601.
- Transferencia de células HeLa nucleosomas en el ADN marcado 601 utilizando un método de dilución en serie 5.
- Mezclar 2 pmol de32 P-etiquetados 601 fragmento de ADN con 6 g de nucleosomas Hela (preparado como se describe 5) en 50 l de un tampón que contenía NaCl 1,0 M, Tris-HCl 10, pH 8,0, EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, y 1 mM TDT y se incuba a 30 ° C durante 30 min.
- Secuencialmente se diluye la mezcla a 0,8 M, 0,6 M y NaCl 0,4 M por dilución con 12,5 l, 20,8 l, y 41,6 l, respectivamente, de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, y DTT 1 mM, con una incubación de 30 min a 30 ° C después de cada dilución.
- Además se diluye la mezcla a 0,2 M y luego a NaCl 0,1 M mediante la adición de 125 l y luego 250 l de la misma solución tampón que contiene 0,1% de Nonidet P-40, 20% de glicerol, y 200 mg / ml de BSA, con una incubación de 30 min a 30 ° C entre las dos últimas diluciones. Almacenar el sustrato mononucleosome a 4 ° C durante un máximo de 3 meses.
- Realizar reacciones nucleosoma deslizamiento dependientes de ATP en un volumen total de 10 l. El reaction componentes se enumeran en la Tabla 2. Puesto que la concentración de NaCl óptima para INO80 actividad de remodelación nucleosoma es de ~ 50 mM de NaCl (resultados no publicados), ajustar la concentración total de NaCl en cada reacción a 50 mM, teniendo en cuenta la cantidad de contenido en NaCl preparaciones de nucleosomas y enzima.
- Antes de comenzar a configurar los ensayos, emitidos geles poli-acrilamida nativos (18 x 16 cm). Para preparar un solo gel que contiene 5% de acrilamida (acrilamida: bisacrilamida 37.5: 1), TBE 0,5 x (Tris 45 mM borato, EDTA 1 mM), persulfato de amonio 0,01% (APS), y 0,001% de N, N, N ', N 'tetrametiletilendiamina (TEMED), mezclar los ingredientes enumerados en la Tabla 3. Deje que el gel se polimerice por lo menos durante 2 horas a RT.
- Mientras tanto, para que se realice cada reacción, se combinan en un tubo de 1.5 ml con silicona previamente enfriado ~ 20 nM INO80 o subcomplejo INO80 (preparada como se describe 3) con una cantidad de tampón EB100 (
- Establecer un cóctel principal con el resto de los ingredientes, la ampliación por un factor de 'X' (donde X = número total de reacciones 3). La cantidad de cada ingrediente necesario para una sola reacción de 10 l se enumera en la Tabla 5; la receta debe ampliarse de acuerdo con el número de reacciones a realizar. Mezclar bien tocando el tubo o pipeta hacia arriba y hacia abajo con un Pipetman y hacer girar el tubo durante unos segundos en una microcentrífuga de sobremesa.
- Dispensar 5,25 l de cóctel de maestro a cada uno de los tubos de reacción preparada en el paso 1.3.2. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo. Iniciar las reacciones mediante la transferencia de los tubos de reacción a un baño de 30 ° C o bloque de calor de agua y se incuba durante 2 hr.
- Mientras tanto, preparar 'la eliminación de mezcla' cóctel que contiene ADN competidory nucleosomas, la ampliación por un factor de X (X = número total de reacciones + 4). La cantidad de cada ingrediente necesario para preparar 1,5 l de la mezcla para la eliminación de una sola reacción se enumera en la Tabla 6; la receta debe ser ampliado en función del número de ensayos a realizar.
- Terminar reacciones mediante la adición de 1,5 l de la mezcla de la eliminación. Mezclar bien, girar hacia abajo, y se incuba a 30 ° C durante 30 min.
- Mientras tanto, pre-ejecutar el gel de poliacrilamida nativo en una unidad de electroforesis vertical en 100 V durante 30 min a 4 ° C, utilizando TBE 0.5x como tampón con una barra de agitación magnética dentro de la cámara inferior para mantener la circulación de tampón constante.
- Para cargar la muestra, añadir 2,5 l de colorante de carga que contiene 3x TBE, 30% de glicerol, 0,25% azul de bromofenol, y 0,25% de xileno cianol FF. Mezclar bien, girar brevemente las muestras, y la carga en el gel usando puntas de carga.
- Correr el gel a 200 V durante 4,5 horas a 4 ° C con circulación de buffer.
- Para detectar la señal, transferir el gel a una pila de dos hojas de papel de filtro. Envuelva el papel de filtro con el gel en la parte superior mediante una envoltura de plástico transparente, y luego exponerlo a una pantalla de fósforo de almacenamiento a 4 ° C durante el tiempo deseado.
- Busque en la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos y analizar los datos utilizando un software adecuado.
2. Mononucleosome ensayos de unión
Para ensayar la afinidad de unión de un complejo INO80 dado para mononucleosomes, realice un cambio de movilidad electroforética de ensayo (EMSA) utilizando el sustrato mononucleosomal generada en el paso 1.2.
- Configurar la reacción de mezclas para ensayos de unión como se ha descrito para los ensayos de remodelación de nucleosomas, pero omitir la ATP y la eliminación de la mezcla de las reacciones; incubar a 30 ° C durante 30 min.
- Añadir 2,5 l de colorante de carga a cada mezcla de reacción, y se aplican a un gel de poliacrilamida nativo que contiene 3,5% de acrilamida (acrilamida: bis 37.5: 1), 1% de glicerol, TBE 0,5 x, 0,01% de APS, 0,001% y TEMED.
- El uso de TBE 0.5x como tampón, ejecute el gel a 200 V durante 2,5 horas a 4 ° C con circulación de tampón y se exponga a una pantalla de fósforo de almacenamiento.
3. ADN y Nucleosoma-ATPasa dependiente Ensayos
Realizar ensayos de ATPasa en las mezclas de reacción 5 l que contenía 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 60 mM, 6,6 mM de MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% de Nonidet P-40, 2,5% de glicerol, 0,1 mg / ml de BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 Ci de [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). Para cada complejo INO80 o cantidad de complejo INO80 a ensayar establecer tres reacciones paralelas, una memoria intermedia que contiene EB100 para medir ADN o nucleosoma-ATPasa independiente, uno que contiene ADN plásmido circular cerrado (5.000 pb, ~ 30 nM) para medir el ADN ATPasa dependiente, y una que contiene Hela oligonucleosomas (~ 185 nm) para medir-nucleosoma ATPasa dependiente. Configure todas las reacciones en hielo.
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Representative Results
Las cifras muestran resultados representativos de ensayos bioquímicos utilizados para caracterizar las actividades INO80, incluyendo nucleosoma deslizamiento (Figura 1) y vinculante (Figura 2) y ensayos de ADN o ATPasa ensayos nucleosomas dependiente (Figura 3).
El experimento mostrado en la Figura 1 compara la capacidad de los complejos de INO80 intactas purificó a través de FLAG-NIF N ° 2 o FLAG-INO80E y de INO80 subcomplexes purificó a través de cualquiera de FLAG-Ino80ΔN o Ino80ΔNΔHSA para catalizar la remodelación de mononucleosomes montados en un fragmento de ADN radiomarcado 216 pb. La posición del nucleosoma en el fragmento de ADN que afecta a la movilidad electroforética; lateralmente nucleosomas posicionados funcionen más rápido en el gel de nucleosomas más colocadas en posición central. Desde la remodelación de la cromatina INO80 mueven preferentemente mononucleosomes hacia el centro de un trozo de ADN 6,7,8, la actividad de remodelación es monireada por la aparición de una población de nucleosomas que muestran una disminución de la movilidad electroforética. Al final de la reacción, un exceso de oligonucleosomas HeLa y de esperma de salmón u otro ADN se debe agregar a la mezcla de reacción como competidor para eliminar cualquier INO80 o INO80 subcomplexes sustrato determinado, ya que la enzima unida remodelación va a cambiar la movilidad electroforética de la nucleosoma sustrato. Complejos purificados a través Ino80ΔN BANDERA carecen de las subunidades metazoos específicos INO80D, INO80E, Amida, MCRS1, NFRKB y UCH37, mientras que los complejos purificados a través Ino80ΔNΔHSA también carecen ARP4, Arp8 y YY1. Complejos purificados a través FLAG-NIF N ° 2, FLAG-INO80E, y FLAG-Ino80ΔN tienen actividades similares, lo que indica que las subunidades metazoos específicos son prescindibles para la remodelación nucleosoma por el complejo INO80. En contraste, los complejos purificados a través de FLAG-Ino80ΔNΔHSA son inactivos en este ensayo, indicando que la actividad de remodelación depende del dominio de HSA de la ATP Ino80ASE y / o sus subunidades asociadas.
Los experimentos en la Figura 2 compara la actividad de INO80 y INO80 subcomplexes utilizando ensayos de cambio de movilidad electroforética vinculante nucleosoma. Estos ensayos se realizan de manera similar a los ensayos de remodelación de nucleosomas, excepto que no hay adición de oligonucleosomas y el ADN en la conclusión de la reacción para eliminar los complejos de nucleosomas unidos. En consecuencia, la incubación de los nucleosomas con cantidades crecientes de complejos INO80 intactas purificó a través de la subunidad INO80E conduce a una desaparición dependiente de la dosis de la banda correspondiente a mononucleosomes libres y aparición de una nueva especie que migra cerca de la parte superior del gel 'desplazado' (carriles 6-8). En contraste, cuando los nucleosomas se incuban con complejos más pequeños que habían sido purificados a través de Ino80ΔN y que carecen de un subconjunto de subunidades INO80, la especie migra más rápidamente desplazado (carriles 2-5 y 9-11), lo que sugiere que la turba relativaility de la banda super-desplazado es determinado por el tamaño de los complejos ensayados.
La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo comparando el ADN y las actividades ATPasa activada por nucleosoma de dos subcomplexes INO80 diferentes. Las manchas que migran más lentamente corresponden a la partida α- 32 P ATP marcado, y las especies que migran más rápidamente son productos de reacción de ADP; las flechas indican la dirección de la migración de disolvente.
Uno de los complejos ensayados aquí, INO80ΔN, incluye una subunidad Ino80 ATPasa que se extiende a C-terminal normales de la proteína, mientras que el otro, INO80ΔNC, carece de la región C-terminal Ino80. Aunque estos dos complejos son por lo demás idéntico, la tasa de hidrólisis de ATP (medido por la conversión de ATP radiomarcado a ADP) es mayor en la presencia de INO80ΔNC, lo que sugiere el C-terminal de la Ino80 ATPasa puede regular negativamente su actividad. Tenga en cuenta que la tasa de hidr ATPolysis por ambos complejos es mayor en la presencia de nucleosomas que el ADN, lo que sugiere el nucleosoma INO80 remodelación complejos prefieren sustratos nucleosomal para la hidrólisis de ATP.
En el ensayo se muestra en la figura, sólo hay un nivel muy bajo de hidrólisis de ATP en las reacciones que carecen de ADN o nucleosomas (que van desde indetectables a <5% de la observada en la presencia de ADN / nucleosomas). Debido a que la actividad de la ATPasa de INO80 y otras enzimas de remodelación de la cromatina SNF2 familia está fuertemente estimulada por ADN o nucleosomas, la presencia de ADN sustancial y / o actividad de la ATPasa nucleosoma-independiente en las preparaciones purificadas del complejo INO80 sugeriría la presencia de contaminantes celular ADN, o alternativamente, la contaminación de las ATPasas no INO80 que no fueron extraídas con éxito durante la purificación. Varios se pueden tomar medidas para reducir al mínimo la introducción de ADN no deseados y / o ATPasa durante la purificación.
1) Aumentar los sconcentración alt (NaCl) en las etapas de unión y de lavado durante la purificación. El uso de menos de NaCl 200 mM en la unión y las etapas de lavado suele proporcionar preparaciones de complejos remodeladores con niveles inaceptables de contaminación de ADN y / o ATPasas. Rutinariamente purificamos Ino80 utilizando un tampón que contenía NaCl 450 mM para reducir al mínimo los contaminantes (descrito en el 3). Hemos utilizado tampones que contienen tanto como 1 M NaCl para purificar Ino80 activos; Sin embargo, se obtiene un rendimiento disminuido de complejos activos bajo estas condiciones;
2) Disminuir la proporción de la BANDERA de agarosa al lisado celular durante inmunopurificación; la cantidad óptima de FLAG-agarosa debe determinarse por titulación;
3) acompañantes ATP-dependientes pueden permanecer unidos a proteínas FLAG-etiquetados durante inmunopurificación. Estos a menudo se pueden eliminar mediante la inclusión de ATP 1 mM en el tampón de lavado durante la inmunopurificación;
4) Tenemos exitosay eliminado la contaminación de ADN mediante la inclusión de benzonasa a una concentración de 25 unidades / ml durante la incubación de extracto con perlas de agarosa-FLAG. ATENCIÓN: Es imprescindible realizar se retira seguro benzonasa durante las etapas de lavado posteriores, como DNasa residual se degradará ADN sustrato o nucleosomas durante ensayos para la actividad INO80.
La interpretación de estos ensayos de ATPasa podría, en principio, se complica por el hecho de que los complejos de remodelación INO80 cromatina contienen varias ATPasas potenciales, incluyendo el núcleo SNF2-como la ATPasa Ino80, proteínas actina-como ARP5, Arp8, Baf53a, actina, y la AAA + ATPasas Tip49a y Tip49b. A pesar de la presencia física de múltiples ATPasas, sin embargo, estudios previos han mostrado que sólo contienen complejos catalíticamente activo Ino80 puede apoyar ADN o-nucleosoma activado hidrólisis de ATP; complejos que contienen la forma E653Q catalíticamente inactiva de Ino80 ATPasa no logran exhibir ADN detectable o nucleosoma estimulada ATPasa actividad en cualquier condición de prueba 8. Por lo tanto, ADN y / o actividad de la ATPasa estimulada de nucleosoma-INO80 o subcomplexes INO80 son aportados principalmente por la subunidad Ino80 ATPasa.
Figura 1. INO80 actividad de remodelación nucleosoma depende del dominio de Ino80 HSA y / o subunidades asociadas, pero es independiente de la Ino80 NTD y subunidades-metazoos específico. Nucleosoma remodelación ensayos se realizaron con complejos de FLAG-inmunopurificado a partir de extractos nucleares preparados a partir de líneas celulares que expresan FLAG versiones-etiquetados de tipo salvaje o subunidades INO80 mutantes. Ino80 intactos fueron purificados a partir de líneas celulares que expresan FLAG-NIF N ° 2 o FLAG-INO80E; Subcomplexes INO80 fueron purificados a partir de líneas celulares que expresan FLAG-Ino80ΔN o FLAG-Ino80ΔNΔHSA. Una concentración relativa (rel. Conc.) De 1 corresponde a ~ 10 nM complejo INO80.
Figura 2. Nucleosoma de unión por el complejo INO80 es independiente de la Ino80 NTD y subunidades-metazoos específico. Ensayos de unión nucleosoma se realizaron en presencia de cantidades variables de complejo INO80 FLAG-inmunopurificado indicado. La unión de INO80 o subcomplexes INO80 a mononucleosomes resultado en la aparición de bandas de "super-desplazado" lenta migración correspondientes a mononucleosomes unido de forma estable por INO80 o subcomplexes INO80. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. ADN y ensayos de ATPasa nucleosoma-dependientes. TLC (cromatografía en capa fina) a base de ensayos de ATPasa se llevaron a cabo para medir la velocidad de hidrólisis de ATP por INO80 subcomplexes purificado a través de FLAG-Ino80ΔN (Delta N) o FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) en la presencia de cantidades saturantes de ADN o nucleosomas. Los ensayos se realizaron usando dos concentraciones diferentes de cada complejo (5 nM y 10 nM) y para tres tiempos de reacción diferentes. La cantidad de ATP hidrolizado (en pmol) en las reacciones se indica debajo de cada panel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 67,5 l | H 2 O |
| 10 l | 10x PCR buffer de reacción (ver Lista de Materiales) | </ Tr>
| 1 l | pGEM-3Z-601 (10 ng / l) |
| 5 l | cebador directo (10 micras) |
| 5 l | cebador inverso (10 micras) |
| 0,5 l | dNTP solución madre que contiene 10 mM de cada uno de los 4 dNTPs |
| 1 l | Taq ADN polimerasa (5 unidades / l) |
| 10 l | [Α- 32 P] dCTP (6000 Ci / mmol, 3,3 M) |
Tabla 1. mezcla de reacción para la amplificación por PCR del fragmento '601' de ADN radiomarcado.
| 20 nM | INO80 o INO80 subcomplexes |
| 2,8 nM | nucleosomas (consistente en una mezcla de mononucleosomes en los P-etiquetados 601 fragmentos de ADN y células Hela nucleosomas 32) |
| 1 mM | ultrapura ATP |
| 20 mM | HEPES-NaOH (pH 7,9) |
| 50 mM | NaCl |
| 5 mM | MgCl2 |
| 1 mM | ditiotreitol (DTT) |
| 0,1 mM | fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) |
| 0,1 mg / ml | albúmina de suero bovino (BSA) |
| 5% | glicerol |
| 0,02% | Nonidet P-40 |
| 0,02% | Triton X-100 |
Cuadro 2 Componentes de ensayos nucleosomas dependiente de ATP remodelación.
| 32,6 ml | H 2 O |
| 5 ml | 40% de acrilamida / BIS (37,5: 1) |
| 2 ml | 10x TBE (900 mM Tris-borato, EDTA 20 mM) |
| Añadir los siguientes ingredientes inmediatamente antes de verter el gel: | |
| 0,4 ml | Persulfato de amonio al 10% |
| 0,1 ml | TEMED |
Tabla 3 Preparación de gel de poliacrilamida nativo para los ensayos de remodelación de nucleosomas dependiente de ATP.
| 10 mM | HEPES pH 7,9 |
| 10% | glicerol |
| 100 mM | NaCl |
| 1,5 mM | MgCl2 |
| 0,05% | Triton X-100 |
| Añadir poco antes de su uso: | |
| 1 mM | TDT |
| 200 M | PMSF |
| 1: 1000 dilución | Inhibidor de la proteasa Cocktail (ver Lista de Materiales) |
Tabla 4. tampón EB100.
| 3,9 l | H 2 O |
| 1 l | Remodelación 10x tampón (200 mM HEPES-NaOH (pH 7,9), 0,2% NP-40, 0,2% de Triton X-100, 50% de glicerol, 50 mM de MgCl 2, 1 mg / ml de BSA) |
| 0,1 l | ATP 100 mM |
| 0,01 l | 1 M DTT |
| 0,01 l | MM PMSF 100 |
| 0,25 l | sustrato mononucleosome reconstituido desde el paso 1.2 |
Cuadro 5 Componentes del cóctel maestro para ensayos nucleosoma remodelación ATP-dependiente.
| 0,33 l | 400 nucleosomas nM Hela |
| 0,75 l | 100 nM AND esperma de salmón sonicado |
| 0,01 l | 1 M DTT |
| 0,01 l | MM PMSF 100 |
Tabla 6. Extracción de cóctel mezcla.
| 2 l | H 2 O |
| 0,25 l | 20x ATPasa tampón que contiene 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 200 mM, 132 mM MgCl2, 16 mM EDTA, 0,3% Nonidet P-40, 50% de glicerol, 2 mg / ml de BSA |
| 0,1 l | 100 mM de ATP |
| 0.005 l | 1 M DTT |
| 0.005 l | MM PMSF 100 |
| 0,1 l | [Α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol) |
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Discussion
Para asegurarse de que la remodelación nucleosoma y actividades de ATPasa se observa en los ensayos dependen de la actividad catalítica de complejos INO80, y no en la contaminación de la remodelación y / o enzimas ATPasa, que nucleosoma ensayo de forma rutinaria la remodelación y la actividad ATPasa de versiones catalíticamente inactivos de Ino80, purificado en en paralelo con el tipo salvaje INO80 utilizando el mismo procedimiento. Una reacción de control negativo que carece de ATP también se debe realizar cuando el ensayo de actividad de remodelación nucleosoma para probar la presencia de contaminación de ATP y / o actividades de remodelación independiente de ATP, lo que podría complicar la interpretación de los experimentos que comparan las actividades de las diferentes preparaciones de complejo INO80 o subcomplexes. Catalíticamente versiones inactivas de INO80 o subcomplexes INO80 no presentarán remodelación nucleosoma o actividades ATPasa. Además, la detección de ADN o nucleosoma independiente de la actividad de ATPasa indica la presencia de contaminación de la ATPasa (s) en el Enzymfracción e. Si todavía se detecta actividad en presencia de catalíticamente inactiva Ino80 o si hay ADN sustancial o actividad de la ATPasa nucleosoma-independiente incluso después de la optimización de la purificación como se describe en 'Los resultados representativos,' complejos se pueden purificar adicionalmente usando pasos adicionales tales como intercambio iónico o cromatografía de filtración en gel o la sedimentación de gradiente.
Al medir la remodelación nucleosoma y actividades ATPasa, es aconsejable realizar ensayos durante distintos períodos de tiempo y con más de una concentración de INO80 o subcomplexes INO80 para asegurar que se están tomando medidas cuando en tiempo producto y curvas dosis-respuesta es lineal. Del mismo modo, los ensayos de unión de nucleosomas se deben efectuar utilizando varias concentraciones de complejo INO80 (es); de lo contrario, no se puede comparar de forma fiable las actividades de las diferentes preparaciones INO80.
Nucleosome deslizamiento y ensayos de unión siempre deben incluir las reacciones de controlque incluyen mononucleosome sustrato solo como un marcador para mostrar la movilidad electroforética de la población nucleosoma de partida. De esta manera, se pueden identificar fácilmente los cambios debidos específicamente a la presencia de la fracción de enzima. Tales reacciones de control también evalúan la integridad de los mononucleosomes reconstituidas.
Para llevar a cabo nucleosoma fácilmente interpretable de deslizamiento y los ensayos de unión, es útil para generar sustratos mononucleosomal homogéneos; por esa razón, el ensayo descrito en este protocolo utiliza nucleosomas reunidos en un fragmento de ADN que contiene una secuencia de fuerte posicionamiento nucleosoma. Aunque el complejo INO80 tiende a cambiar la posición de los nucleosomas posicionados lateralmente a una posición más central en un fragmento de ADN, otras enzimas remodelación de la cromatina, tales como el complejo NURF ISWI que contienen 9, se mueven nucleosomas desde posiciones más centrales hacia los extremos de los fragmentos de ADN. Por lo tanto, durante la caracterización de cualquier remodelación de la cromatina enZyme es útil para preparar sustratos mononucleosome en el que la secuencia es el posicionamiento de nucleosomas en diferentes lugares. Alternativamente, se puede emplear sustratos en los que los nucleosomas han sido montados en fragmentos de ADN sin una secuencia posicionamiento nucleosoma. En este caso, la población de partida nucleosoma incluirá una mezcla de nucleosomas más en posición central y lateralmente.
El proceso de remodelación nucleosoma dependiente de ATP puede conducir a diferentes resultados de remodelación, incluyendo el desplazamiento completo a partir del ADN de nucleosoma, el movimiento nucleosoma en el ADN, o alteraciones transitorias en la estructura de nucleosoma que puede no conducir a cambios en las posiciones de los nucleosomas una vez que la reacción alcanza el equilibrio pero sin embargo son funcionalmente significativa. El ensayo nucleosoma deslizamiento descrito puede monitorear las dos primeras reacciones, pero puede no ser capaz de detectar alteraciones transitorias en la estructura del nucleosoma. Un ensayo que puede detectar algunos tales alt transitoriaopera- toma ventaja del hecho de que el ADN nucleosomal en la superficie del octámero nucleosoma es en gran parte inaccesible al corte por una enzima de restricción, mientras que el ADN enlazador que ha sido desplazado de la superficie octámero por nucleosoma deslizamiento o desenrollado parcial de ADN nucleosomal es susceptible a corte 10,11,12. Tal ensayo también puede ser particularmente útil en el caso de que la enzima remodelación nucleosoma se une tan estrechamente a su sustrato que no puede eliminarse por competidor 13.
Nuestro nucleosoma deslizamiento y vinculante ensayos miden actividades INO80 utilizando sustratos mononucleosomal preparados con histonas celulares Hela nativos. Sin embargo, las actividades de remodelación de INO80 u otras enzimas remodelación de la cromatina pueden en principio ser afectados por la presencia o ausencia de modificaciones post-traduccionales específicas o variantes de las histonas. Además, mononucleosomes pueden estimular las actividades de complejos INO80 diferente que di-nucleosomas,o un conjunto de nucleosomas. Por lo tanto, las actividades de medición de complejos INO80 utilizando sustrato nucleosomal más complicada y diversa pueden proporcionar información sobre el mecanismo por el cual se regulan los complejos de remodelación de la cromatina INO80.
Como una alternativa al uso de fragmentos de ADN radiomarcados en la remodelación de nucleosoma y los ensayos de unión, algunos investigadores visualizar nucleosomas y / o el ADN por tinción de ADN nucleosomal con bromuro de etidio 14; Sin embargo, los ensayos realizados utilizando métodos de detección no radiactivos puede ser considerablemente menos sensible que el que se describe en este protocolo, por lo general requiere el uso de considerablemente más enzima.
Seguimiento del progreso de las reacciones de ATPasa como una función del tiempo usando el ensayo basado en P 32 descrito aquí requiere rondas separadas de manipulación de la muestra y el análisis en cada punto de tiempo. Como un enfoque alternativo, la actividad ATPasa puede medirse utilizando ensayos basados en fluorescencia Los procedimientos que se describen en este documento JOVE se han utilizado para caracterizar tres propiedades bioquímicas diferentes de INO80 o INO80 subcomplexes en el proceso de remodelación de nucleosomas dependiente de ATP. Mediante el uso de varios subcomplexes INO80 o mutantes INO80 en estos ensayos, es posible diseccionar las contribuciones funcionales de diversas subunidades INO80 y / o estructuras de dominio a la actividad de remodelación nucleosoma INO80 y para definir el paso (s) en la reacción de remodelación en la que las subunidades INO80 y / o dominios pueden ser importantes. Estos procedimientos pueden ser adaptados para el estudio de otros remodelación nucleosoma y enzimas de unión y ATPasas wITH tanto ADN y las actividades de nucleosomas dependientes o independientes. Nos cuenta que diferentes enzimas remodelación de la cromatina pueden tener actividades ATPasa o remodelación nucleosoma superiores o inferiores intrínsecas que el complejo INO80 humano. Por lo tanto, cuando la adaptación de estos protocolos para el análisis de otras enzimas remodelación de la cromatina, se debe variar las concentraciones de enzima, ATP, ADN o nucleosomas, y los tiempos y / o temperaturas de reacción con el fin de optimizar los ensayos para los que se estudian los enzimas particulares.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
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