Introduction
מתחמי שיפוץ הכרומטין משפחת SNF2 כוללים מקטע ATPase מרכזי כמו SNF2-1,2. פונקציה מסוימת כמו SNF2-ATPases כאנזימים למקטע אחד, בעוד שאחרים לתפקד כמקטע קטליטי של מתחמים רב למקטע גדולים יותר. הבהרת המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו כל אחד מיחידות המשנה של הכרומטין מתחמי שיפוץ לתרום לפעילויות שלהם דורש את היכולת לבצע מבחני ביוכימיים שלנתח את תהליך שיפוץ.
שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP על ידי מורכב INO80 האנושי ואנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים יכול להיות שחזה כתהליך רב שלבים שמתחיל בכריכה של אנזים שיפוץ לnucleosomes, ואחרי הפעלה של דנ"א ו / או ATPase הנוקלאוזום תלוי, טרנסלוקציה של אנזים שיפוץ על DNA nucleosomal, ומיצוב מחדש סופו של הדבר nucleosomes 1,2. הבנת הפרטים המולקולריים של r תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATPequires נתיחה של תגובת שיפוץ לשלבים הבודדים שלה והגדרתה של תרומתם של יחידות משנה נפרדות של מתחם שיפוץ הכרומטין לכל צעד של התגובה. ניתוח מסוג זה דורש היכולת לנתח שיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות אחרות באמצעות מצעים מולקולריים מוגדרים במבחנה.
בפרוטוקול יופיטר קודם, שתארנו תהליכים המשמשים ליצירת מתחמי INO80 שיפוץ הכרומטין וsubcomplexes עם יצירות למקטע מוגדרים 3. כאן, אנו מציגים שלושה מבחני ביוכימיים שיאפשר ניתוח כמותי של הנוקלאוזום המחייב, דנ"א וATPase מופעל הנוקלאוזום, ופעילויות שיפוץ הנוקלאוזום הקשורים למתחמים כאלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מבחני Remodeling הנוקלאוזום .1 תלוי ATP
כדי למדוד ATP תלוי פעילויות הנוקלאוזום שיפוץ, immunopurified INO80 או subcomplexes INO80 מודגרת עם ATP ומצע mononucleosomal, המכיל הנוקלאוזום יחיד ממוקם בקצה אחד של קטע DNA 216-BP, שכותרתו-P 32. תוצרי התגובה לאחר מכן נתון לאלקטרופורזה בג'ל פולי-acrylamide ילידים.
- על מנת ליצור את, בר 32 שכותרתו P '601' DNA, להגביר מpGEM-3Z-601 4 שבר 216 נ"ב DNA המכיל 601 רצף מיצוב הנוקלאוזום מיקום סוף, באמצעות oligonucleotides 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG ו5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG כ קדימה ולאחור פריימרים.
- הגדר את תגובת PCR 100 μl כפי שמתואר בטבלה 1.
- לבצע PCR התגובות בCycler תרמית באמצעות התכנית הבאה: 1 דקות ב96 מעלות צלזיוס, followeד על ידי 45 שניות על 94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב57 ° C, 60 שניות ב72 מעלות צלזיוס במשך 30 מחזורים; כלה ב7 דקות ב72 מעלות צלזיוס.
- לאחר תגובת PCR נגמרה, להסיר את נוקלאוטידים מאוגדים על ידי העברת תוצרי התגובה פעמיים באמצעות עמודות ספין nuclease חינם.
- לרוץ 5 μl של מוצר PCR המטוהר בagarose ג'ל 1.2% כדי לאשר שתגובת PCR שנוצרה קטע DNA נ"ב הרצוי ~ 216.
- לדלל 5 μl של מוצר PCR המטוהר פי 20, ולמדוד את ריכוז DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV. התשואה הממוצעת היא ~ 40 ng / μl.
- מדוד את הרדיואקטיביות של 1 μl של מוצר PCR המטוהר במונה נצנץ. להעריך את יעילות התיוג על ידי חישוב עותקים לדקה / ng. תגובת תיוג מוצלחת צפויה להניב ~ 15,000 עותקים לדקה / ng של 601 קטע DNA.
- העבר את nucleosomes תא הלה על DNA 601 שכותרתו באמצעות שיטת דילול סדרתי 5.
- לערבב 2 pmol של32 קטע DNA 601 עם כותרת P 6 מיקרוגרם של nucleosomes הלה (שהוכן כמתואר 5) ב50 μl של מאגר המכיל 1.0 M NaCl, 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1 מ"מ PMSF, ו1 מ"מ DTT ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- רצף לדלל את התערובת ל0.8 M, 0.6 M, ו0.4 M NaCl על ידי דילול עם 12.5 μl, 20.8 μl, ו41.6 μl, בהתאמה, של 10 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 מ"מ PMSF, ו 1 מ"מ DTT, עם דגירה 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס לאחר כל דילול.
- יתר על כן לדלל את התערובת ל0.2 M ולאחר מכן ל0.1 M NaCl על ידי תוספת של 125 μl ולאחר מכן 250 μl מאותו המאגר המכיל 0.1% Nonidet P-40, גליצרול 20%, ו200 מיקרוגרם / מ"ל BSA, עם דגירה 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס בין שני דילולים הסופיים. אחסן את מצע mononucleosome ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
- לבצע תגובות הנוקלאוזום הזזה ATP תלויות בנפח כולל של 10 μl. המחשבהרכיבי ction מפורטים בטבלה 2. מאז ריכוז NaCl האופטימלי לפעילות שיפוץ הנוקלאוזום INO80 הוא ~ 50 mM NaCl (תוצאות לא פורסמו), להתאים את הריכוז הכולל של NaCl בכל תגובה ל50 מ"מ, תוך לקיחה בחשבון את כמות NaCl הכלולה ב הכנות של nucleosomes ואנזים.
- לפני שיתחיל בלהגדיר את מבחני, להטיל ג'לי פולי-acrylamide ילידים (18 x 16 סנטימטר). כדי להכין ג'ל יחיד המכיל 5% acrylamide (acrylamide: bisacrylamide 37.5: 1), TBE 0.5x (45 borate מ"מ טריס, 1 mM EDTA), 0.01% persulfate אמוניום (APS), ו0.001% N, N, N', -tetramethylethylenediamine N'(TEMED), לערבב את החומרים המפורטים בטבלה 3. אפשר ג'ל לפלמר לפחות שעה 2 ב RT.
- בינתיים, לכל תגובה שיש לבצע, לשלב בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge מראש צונן siliconized ~ 20 ננומטר INO80 או subcomplex INO80 (שהוכן כמתואר 3) עם סכום של חיץ EB100 (
- הגדר את קוקטייל הורים עם שאר החומרים, גמלון בפקטור של "X" (כאשר X = מספר כולל של תגובות +3). הסכום של כל מרכיב הנחוץ לתגובת 10 μl בודדת מופיע בטבלה 5; המתכון צריך להיות בקנה מידה גדול בהתאם למספר של תגובות שיש לבצע. מערבבים היטב על ידי הקשה על הצינור או על ידי pipetting למעלה ולמטה עם Pipetman ולסובב את הצינור לכמה שניות בmicrocentrifuge המעבדתיים.
- לוותר 5.25 μl של קוקטייל האדון לכל אחד מצינורות התגובה הוקמו בצעד 1.3.2. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. התחל את התגובות על ידי העברת צינורות תגובה לאמבטית גוש חום C 30 מעלות או מים ודגירה עבור שעה 2.
- בינתיים, להכין את 'הסרת לערבב' קוקטייל המכיל DNA מתחרהוnucleosomes, גמלון בפקטור של X (X = מספר הכולל של תגובות + 4). הסכום של כל מרכיב הדרוש כדי להכין 1.5 μl הסרת תערובת לתגובה יחידה מופיע בלוח 6; המתכון צריך להיות בקנה מידה גדול בהתאם למספר מבחני שיש לבצע.
- לסיים תגובות על ידי הוספת 1.5 μl של תמהיל הסרת. מערבבים היטב, ספין למטה, ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות נוספות.
- בינתיים, לפני לרוץ ג'ל polyacrylamide הילידים ביחידת אלקטרופורזה אנכית ב100 V ל30 דקות ב 4 ° C, באמצעות TBE 0.5x כחיץ פועל עם בר ומערבב מגנטי בתוך החדר התחתון כדי לשמור על זרימת דם למאגר קבועה.
- כדי לטעון את המדגם, להוסיף 2.5 μl של טעינת צבע המכיל 3x TBE, גליצרול 30%, 0.25% כחול bromophenol, ו0.25% Cyanol FF קסילן. מערבבים היטב, ספין בקצרה הדגימות, ולהעמיס אותו על ג'ל באמצעות עצות לטעינה.
- הפעל את הג'ל על 200 V ל4.5 שעות על 4 מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ.
- כדי לזהות את האות, להעביר את הג'ל לערימה של שני גיליונות של נייר סינון. לעטוף את נייר הסינון עם ג'ל על גבי באמצעות ניילון נצמד ברור, ולאחר מכן לחשוף אותו למסך זרחן האחסון ב 4 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי.
- סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיה איזוטופ ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה.
2 מבחני כריכת Mononucleosome
לassay הזיקה המחייבת של מורכב INO80 ניתנו לmononucleosomes, לבצע Shift electrophoretic ניידות Assay (Emsa) באמצעות מצע mononucleosomal שנוצר בשלב 1.2.
- הגדר את תגובת תערובות לכריכה מבחני כפי שתואר עבור מבחני שיפוץ הנוקלאוזום אבל להשמיט ATP ותמהיל הסרת מהתגובות; לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- הוסף 2.5 μl של טעינת צבע לכל תערובת תגובה, ותחול על ג'ל polyacrylamide ילידים המכיל 3.5 acrylamide% (acrylamide: bis 31), 1% גליצרול, TBE 0.5x, APS 0.01%, ו0.001% TEMED: 7.5.
- באמצעות TBE 0.5x כחיץ פועל, הפעל את הג'ל על 200 V ל2.5 שעה על 4 מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ ולחשוף למסך זרחן האחסון.
.3 דנ"א והנוקלאוזום תלוי מבחני ATPase
לבצע מבחני ATPase בתערובות תגובת 5 μl מכילות 20 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), 60 mM NaCl, 6.6 מ"מ MgCl 2, 0.8 mM EDTA, 0.015% Nonidet P-40, גליצרול 2.5%, 0.1 מ"ג / מ"ל BSA, 1 מ"מ DTT, 0.1 מ"מ PMSF, 2 מ"מ ATP, 2 μCi של [P 32 α-] ATP (3,000 Ci / mmol). עבור כל מורכב INO80 או כמות מורכבת INO80 להיות assayed הקים שלוש תגובות מקבילות, חיץ EB100 מכיל אחד למדוד דנ"א או הנוקלאוזום עצמאי ATPase, אחד מכיל סגורות פלסמיד דנ"א העגול (נ"ב 5,000, ~ 30 ננומטר) כדי למדוד דנ"א ATPase תלוי, ואחד המכיל oligonucleosomes הלה (~ 185 ננומטר) כדי למדוד ATPase הנוקלאוזום תלוי. הגדר את כל התגובות על קרח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הנתונים מראים תוצאות נציג של מבחני ביוכימיים משמשים כדי לאפיין פעילויות INO80, כוללים הנוקלאוזום הזזה (איור 1) ומחייב (איור 2) מבחני ודנ"א או מבחני הנוקלאוזום תלוי ATPase (איור 3).
הניסוי שמוצג באיור 1 משווה את היכולת של מתחמי INO80 שלמים מטוהר באמצעות FLAG-Ies2 או FLAG-INO80E ושל INO80 subcomplexes מטוהר או דרך FLAG-Ino80ΔN או Ino80ΔNΔHSA לזרז שיפוץ של mononucleosomes התאסף ב216 נ"ב, קטע DNA radiolabeled. העמדה של הנוקלאוזום בקטע DNA משפיעה על ניידות electrophoretic; רוחבי nucleosomes ממוקם לרוץ מהר יותר בג'ל מnucleosomes יותר הממוקם במרכז. מאז מתחמי שיפוץ הכרומטין INO80 מעדיפים להעביר mononucleosomes לכיוון המרכז של פיסת DNA 6,7,8, פעילות שיפוץ הוא מוניהנמצאת על ידי הופעתה של אוכלוסייה של nucleosomes כי תערוכת ירד ניידות electrophoretic. בסופו של התגובה, עודף של oligonucleosomes הלה וזרע סלמון או DNA האחר יש להוסיף לתערובת התגובה כמתחרה כדי להסיר כל subcomplexes INO80 או INO80 הנכנס מצע, מאז אנזים שיפוץ הכרוך ישנה את ניידות electrophoretic של הנוקלאוזום מצע. מתחמים המטוהרים באמצעות Ino80ΔN FLAG חסרי יחידות משנה מטזואניים ספציפי INO80D, INO80E, אמידה, MCRS1, NFRKB, וUCH37, תוך שבמטוהר באמצעות Ino80ΔNΔHSA גם חוסר Arp4, Arp8, וYY1. יש לי מתחמים המטוהרים באמצעות FLAG-Ies2, FLAG-INO80E, והדגל-Ino80ΔN פעילויות דומות, מצביעים על כך שיחידות המשנה מטזואניים ספציפית הן מיותרות עבור שיפוץ הנוקלאוזום על ידי מורכב INO80. בניגוד לכך, מתחמים מטוהרים באמצעות FLAG-Ino80ΔNΔHSA אינם פעילים בassay זה, מצביעים על כך שפעילות שיפוץ תלויה בתחום HSA של ATP Ino80ASE ו / או יחידות משנה הקשורים אליו.
הניסויים באיור 2 להשוות הנוקלאוזום מחייב פעילות של INO80 וsubcomplexes INO80 באמצעות מבחני משמרת ניידות electrophoretic. מבחני אלה מבוצעים באופן דומה למבחני שיפוץ הנוקלאוזום, פרט לכך שאין תוספת של oligonucleosomes וDNA בסיומה של התגובה להסרת מתחמים מאוגד הנוקלאוזום. בהתאם לכך, דגירה של nucleosomes עם כמויות הולכים וגדלות של מתחמי INO80 שלמים מטוהר באמצעות מקטע INO80E מוביל להיעלמות תלוית מינון של הלהקה המתאימה לmononucleosomes החופשי ומראה של חדש 'להחליף' מינים שנודדים בחלק העליון של ג'ל (נתיבים 6-8). בניגוד לכך, כאשר nucleosomes מודגרת עם מתחמים קטנים יותר שמטוהרים באמצעות Ino80ΔN ושאין להן קבוצת משנה של יחידות משנה INO80, המינים השתנו נודדים במהירות רבה יותר (נתיבי 2-5 ו9-11), המצביעים על כך האספסוף היחסיility של הלהקה העביר סופר נקבע על ידי הגודל של מתחמי assayed.
איור 3 מוצג תוצאות של assay השוואת דנ"א ופעילויות ATPase מופעל הנוקלאוזום של שתי subcomplexes INO80 שונה. הכתמים הנודדים לאט יותר מתאים לα- ההתחלה 32 P שכותרתו ATP, ומינים במהירות רבה יותר הנודדים הם תוצרי תגובת ADP; חיצים מצביעים על הכיוון של הגירת ממס.
אחד מהמתחמים assayed כאן, INO80ΔN, כולל מקטע Ino80 ATPase המשתרע על C-הסופי הנורמלי של החלבון, ואילו אחרים, INO80ΔNC, חסר את אזור C-מסוף Ino80. למרות ששני מתחמים אלה מלבד זאת הם זהים, השיעור של הידרוליזה ATP (שנמדדה על ידי המרה של ATP שכותרת רדיו לADP) הוא גדול יותר בנוכחות INO80ΔNC, המצביע על C-הסופי של ATPase Ino80 עלול להשפיע לרעה להסדיר את פעילותה. שימו לב שהשיעור של hydr ATPolysis על ידי שני מתחמים גדול בנוכחות nucleosomes מ DNA, המצביע על הנוקלאוזום INO80 שיפוץ מתחמים מעדיפים מצעי nucleosomal להידרוליזה ATP.
בassay שמוצג באיור, יש רק רמה נמוכה מאוד של הידרוליזה ATP בתגובות שאין להן DNA או nucleosomes (הנע בין גילוי ל< 5% מזה שנצפה בנוכחות DNA / nucleosomes). בגלל פעילות ATPase של INO80 ואנזימי הכרומטין משפחת SNF2 אחרים שיפוץ מגורה מאוד על ידי DNA או nucleosomes, הנוכחות של דנ"א המשמעותי ו / או בפעילות ATPase הנוקלאוזום עצמאית בהכנות המטוהרת של מתחם INO80 הייתי מציעה נוכחות של זיהום סלולארי DNA, או לחלופין, זיהום ATPases אינו INO80 שלא הוסרו בהצלחה במהלך טיהור. אפשר לנקוט במספר צעדים כדי למזער את החדרת DNA לא רצוי ו / או ATPase במהלך הטיהור.
1 להגדיל) שלריכוז גובה (NaCl) בצעדים המחייבים וכביסה במהלך הטיהור. שימוש בפחות מ -200 mM NaCl במחייב ושלבים כביסה בדרך כלל מניב הכנות של מתחמי שיפוץ עם רמות מקובלות של זיהום DNA ו / או ATPases. אנחנו באופן שיגרתי לטהר מתחמי INO80 באמצעות מאגר המכיל 450 mM NaCl כדי למזער מזהמים (שתואר ב3). יש לנו בשימוש מאגרים המכילים ככל 1 M NaCl לטהר מתחמי INO80 פעילים; עם זאת, אנו מקבלים תשואה נמוכה יותר של מתחמים פעילים בתנאים אלה;
2) ירידת היחס של דגל agarose לlysate תא במהלך immunopurification; הכמות האופטימלית של FLAG-agarose צריכה להיקבע על ידי טיטרציה;
3) מלווים תלוי ATP עשויים להישאר מחויבים לחלבונים מתויג דגל במהלך immunopurification. אלה לעתים קרובות ניתן להסיר על ידי כולל 1 מ"מ ATP בכביסת החיץ במהלך immunopurification;
4) יש לנו מוצלחy הוסר זיהום DNA על ידי הכללת Benzonase בריכוז של 25 יחידות / מ"ל במהלך דגירה של תמצית עם חרוזים FLAG-agarose. זהירות: זה חיוני כדי להפוך את Benzonase בטוח יוסר במהלך שלבי כביסה שלאחר מכן, כDNase השיורי יהיה לבזות DNA מצע או nucleosomes במהלך מבחני לפעילות INO80.
הפרשנות של מבחני ATPase אלה יכולים, באופן עקרוני, להיות מסובכת על ידי העובדה כי מתחמי שיפוץ הכרומטין INO80 להכיל מספר ATPases הפוטנציאלי, כוללים ליבה כמו SNF2 ATPase Ino80, החלבונים כמו יקטינו Arp5, Arp8, Baf53a, אקטין, ו+ AAA ATPases Tip49a וTip49b. למרות נוכחותם הפיסית של ATPases מרובה, עם זאת, מחקרים קודמים הראו כי מתחמים בלבד המכילים הפעיל כקטליזאטור Ino80 יכול לתמוך דנ"א או הידרוליזה ATP-מופעל הנוקלאוזום; מתחמים המכילים את טופס E653Q קטליזאטור פעיל של Ino80 ATPase אינם מגלים דנ"א לגילוי או מגורה הנוקלאוזום ATPase activity בכל תנאים שנבדק 8. לפיכך, דנ"א ו / או פעילות ATPase מגורה הנוקלאוזום של INO80 או subcomplexes INO80 בעיקר שנתרמו על ידי מקטע Ino80 ATPase.
פעילות שיפוץ הנוקלאוזום .1 INO80 איור תלוי בתחום Ino80 HSA ו / או יחידות משנה הקשורות אך אינה תלוי בNTD Ino80 ויחידות משנה מטזואניים ספציפית. מבחני שיפוץ הנוקלאוזום בוצעו עם מתחמים-immunopurified FLAG מתמציות גרעיניות מוכנות משורות תאים המבטאות FLAG גרסאות -tagged של סוג בר או יחידות משנה INO80 מוטציה. מתחמי INO80 שלמים היו מטוהרים משורות תאים המבטאות FLAG-Ies2 או FLAG-INO80E; subcomplexes INO80 היו מטוהר משורות תאים המבטאות FLAG-Ino80ΔN או FLAG-Ino80ΔNΔHSA. ריכוז יחסי (rel. קונצרט כלשהו.) של 1 מתאים ל~ 10 ננומטר מורכב INO80.
איור 2 הנוקלאוזום כריכה במתחם INO80 הוא עצמאי של NTD Ino80 ויחידות משנה מטזואניים ספציפית. מבחני מחייבים הנוקלאוזום בוצעו בנוכחות של כמויות משתנות של מתחם INO80-immunopurified דגל המצוין. כריכה של INO80 או subcomplexes INO80 לmononucleosomes תוצאות בהופעה של להקות נודדות איטית "העבירו סופר" המקביל לmononucleosomes קשור ביציבות על ידי INO80 או subcomplexes INO80. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 "src =" "/> / קבצים / ftp_upload / 51721 / 51721fig3highres.jpg
איור 3 דנ"א ומבחני ATPase הנוקלאוזום תלוי. TLC (כרומטוגרפיה שכבה דקה) מבוססת מבחני ATPase בוצעו כדי למדוד את השיעור של ATP הידרוליזה על ידי INO80 subcomplexes מטוהר באמצעות FLAG-Ino80ΔN (ΔN) או FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) ב הנוכחות של להרוות סכומי DNA או nucleosomes. מבחני בוצעו באמצעות שני ריכוזים שונים של כל אחד מורכב (5 ננומטר ו10 ננומטר) ובמשך שלושה זמני תגובה שונים. הסכום של ATP הידרוליזה (בpmol) בתגובות מצויינים מתחת לכל פנל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| 67.5 μl | H 2 O |
| 10 μl | 10x PCR חיץ תגובה (ראה חומרי רשימה) | </ Tr>
| 1 μl | pGEM-3Z-601 (10 ng / μl) |
| 5 μl | פריימר קדימה (10 מיקרומטר) |
| 5 μl | פריימר ההפוך (10 מיקרומטר) |
| 0.5 μl | פתרון מניות dNTP מכיל 10 מ"מ כל אחד 4 dNTPs |
| 1 μl | תקי DNA פולימראז (5 יחידות / μl) |
| 10 μl | [P 32 α-] dCTP (6,000 Ci / mmol, 3.3 מיקרומטר) |
שולחן תערובת 1 תגובה להגברת PCR של בר radiolabeled DNA '601'.
| 20 ננומטר | subcomplexes INO80 או INO80 |
| 2.8 ננומטר | nucleosomes (מורכב מתערובת של mononucleosomes על 601 nucleosomes קטע DNA ותא הלה שכותרת P 32) |
| 1 מ"מ | ultrapure ATP |
| 20 מ"מ | HEPES-NaOH (pH 7.9) |
| 50 מ"מ | NaCl |
| 5 מ"מ | MgCl 2 |
| 1 מ"מ | dithiothreitol (DTT) |
| 0.1 מ"מ | פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF) |
| 0.1 מ"ג / מ"ל | אלבומין בסרום שור (BSA) |
| 5% | גליצרול |
| 0.02% | Nonidet P-40 |
| 0.02% | טריטון X-100 |
.2 רכיבי לוח מבחני הנוקלאוזום ATP תלוי שיפוץ.
| 32.6 מ"ל | H 2 O |
| 5 מ"ל | 40 acrylamide% / Bis (37.5: 1) |
| 2 מ"ל | TBE 10x (900 מ"מ Tris-borate, 20 mM EDTA) |
| מוסיף את המרכיבים הבאים מייד לפני מזיגת ג'ל: | |
| 0.4 מ"ל | 10% persulfate אמוניום |
| 0.1 מ"ל | TEMED |
הכנת לוח 3 של ג'ל polyacrylamide המקורי עבור מבחני הנוקלאוזום שיפוץ תלוי ATP.
| 10 מ"מ | pH HEPES 7.9 |
| 10% | גליצרול |
| 100 מ"מ | NaCl |
| 1.5 מ"מ | MgCl 2 |
| 0.05% | TritonX-100 |
| הוסף רק לפני שימוש: | |
| 1 מ"מ | DTT |
| 200 מיקרומטר | PMSF |
| 1: 1,000 דילול | מעכבי פרוטאז Cocktail (ראה חומרי רשימה) |
לוח 4: חיץ EB100.
| 3.9 μl | H 2 O |
| 1 μl | 10x שיפוץ חוצץ (200 HEPES מ"מ-NaOH (pH 7.9), 0.2% NP-40, 0.2% טריטון X-100, 50% גליצרול, 50 מ"מ MgCl 2, 1 מ"ג / מ"ל BSA) |
| 0.1 μl | 100 מ"מ ATP |
| 0.01 μl | 1 M DTT |
| 0.01 μl | 100 מ"מ PMSF |
| 0.25 μl | מצע mononucleosome מחדש משלב 1.2 |
לוח 5: רכיבים של קוקטייל האב למבחני הנוקלאוזום שיפוץ תלוי ATP.
| 0.33 μl | 400 nucleosomes ננומטר הלה |
| 0.75 μl | 100 ננומטר DNAs זרע סלמון sonicated |
| 0.01 μl | 1 M DTT |
| 0.01 μl | 100 מ"מ PMSF |
לוח 6: הסרת קוקטייל תערובת.
| 2 μl | H 2 O |
| 0.25 μl | 20x ATPase מאגר המכיל 400 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 132 מ"מ MgCl 2, 16 mM EDTA, 0.3% Nonidet P-40, גליצרול 50%, 2 מ"ג / מ"ל BSA |
| 0.1 μl | 100 מיקרומטר ATP |
| 0.005 μl | 1 M DTT |
| 0.005 μl | 100 מ"מ PMSF |
| 0.1 μl | [P α- 32] ATP (3,000 Ci / mmol) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי להבטיח ששיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות ATPase שאנו רואים במבחנים תלויים בפעילות הקטליטית של מתחמי INO80, ולא על זיהום ו / או אנזימי ATPase שיפוץ, אנו הנוקלאוזום באופן שגרתי assay שיפוץ ופעילות ATPase של גרסאות כקטליזאטור פעילים של מתחמי INO80, מטוהר ב במקביל עם הסוג בר INO80 תוך שימוש באותו ההליך. גם תגובת ביקורת שלילית חסרת ATP צריכה להתבצע כאשר מנסים לאמוד את פעילות שיפוץ הנוקלאוזום כדי לבדוק את קיומו של זיהום ATP ו / או פעולות שיפוץ ATP-עצמאיות, אשר עלול לסבך את הפרשנות של ניסויי השוואת הפעילות של תכשירים שונים של מורכבות INO80 או subcomplexes. כקטליזאטור גרסאות פעילה של INO80 או subcomplexes INO80 צריכה להפגין לא שיפוץ הנוקלאוזום או פעילויות ATPase. בנוסף, זיהוי של דנ"א או הנוקלאוזום עצמאי פעילות ATPase מעיד על קיומו של זיהום ATPase (ים) בenzymחלק דואר. אם הפעילות היא עדיין מזוהה בנוכחות Ino80 כקטליזאטור לא פעיל או אם יש דנ"א המשמעותי או פעילות ATPase הנוקלאוזום עצמאית גם לאחר אופטימיזציה של טיהור כפי שמתואר ב'נציג תוצאות, "מתחמים יכולים להיות מטוהרים נוסף באמצעות צעדים נוספים כגון חילוף יונים או כרומטוגרפיה ג'ל סינון או שקיעה הדרגתית.
כאשר מודדים שיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות ATPase, רצוי לבצע מבחני לתקופות שונות ובריכוז יותר מסוג אחד של INO80 או subcomplexes INO80 כדי להבטיח מדידות ננקטות כאשר מוצר בזמן ומנת תגובה עקום הוא ליניארי. בדומה לכך, יש לבצע מבחני הנוקלאוזום מחייב שימוש במספר ריכוזים של מתחם INO80 (es); אחרת, לא ניתן באופן מהימן להשוות את פעילותם של הכנות INO80 שונות.
הנוקלאוזום הזזה ומבחנים מחייבים תמיד צריכים לכלול תגובות שליטההכולל mononucleosome מצע לבד כסמן כדי לעבור לניידות electrophoretic של אוכלוסיית הנוקלאוזום מתחילה. בדרך זו, אפשר בקלות לזהות שינויים עקב במיוחד לנוכחות של שבריר האנזים. תגובות שליטה כזו גם להעריך את היושרה של mononucleosomes מחדש.
על מנת לנהל הנוקלאוזום לפרש בקלות הזזה ומחייב מבחני, כדאי ליצור מצעי mononucleosomal הומוגנית; מסיבה זו, assay שתואר בפרוטוקול זה משתמש בnucleosomes התאסף בקטע DNA המכיל רצף מיצוב הנוקלאוזום חזק. למרות מורכב INO80 נוטה למקם nucleosomes ממוקם רוחבי למקום מרכזי יותר בקטע DNA, אנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים, כגון מורכב NURF ISWI המכיל 9, להעביר nucleosomes מיותר עמדות מרכזיות כלפי הקצוות של שברי DNA. כך, במהלך האפיון של כל שיפוץ הכרומטין enzyme כדאי להכין מצעי mononucleosome בי רצף מיצוב הנוקלאוזום הוא במקומות שונים. לחלופין, אפשר להעסיק מצעים שבי nucleosomes הורכבו על שברי DNA ללא רצף מיצוב הנוקלאוזום. במקרה זה, אוכלוסיית הנוקלאוזום מתחילה תכלול תערובת של nucleosomes יותר הממוקם במרכז ורוחבי.
תהליך שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP יכול להוביל לתוצאות שיפוץ שונות, כוללים עקירה מוחלטת הנוקלאוזום מDNA, תנועת הנוקלאוזום על DNA, או שינויים זמניים במבנה הנוקלאוזום כי לא יכול להביא לשינויים בעמדות של nucleosomes פעם התגובה מגיעה לשיווי משקל אבל בכל זאת מבחינה תפקודית משמעותיים. Assay הנוקלאוזום הזזה תאר יכול לפקח על שתי התגובות הראשונות, אבל לא יכול להיות מסוגל לזהות שינויים זמניים במבנה הנוקלאוזום. assay אחד שיכול לזהות כמה גובה חולף כגוןמיישמים מנצלים את העובדה שDNA nucleosomal על פני השטח של octamer הנוקלאוזום הוא במידה רבה בלתי נגיש לחיתוך על ידי אנזים הגבלה, ואילו DNA מקשר שכבר נעקר ממשטח octamer ידי הנוקלאוזום הזזה או ההתרה חלקית של DNA nucleosomal היא רגישה לגזירה 10,11,12. כגון assay יכול גם להיות שימושי במיוחד במקרה שאנזים שיפוץ הנוקלאוזום נקשר כל כך חזק למצע שלה שהיא לא יכולה להסיר על ידי מתחרה 13.
הנוקלאוזום זזים ומחייב מבחני למדוד פעילויות INO80 באמצעות מצעי mononucleosomal מוכנים עם ההיסטונים תא הלה ילידים. עם זאת, פעילות שיפוץ של INO80 או אנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים יכולה באופן עקרוני להיות מושפעת מנוכחותו או היעדריו של שלאחר translational שינויים ספציפיים או גרסאות היסטון. בנוסף, mononucleosomes עשוי לעורר את הפעילות של מתחם INO80 שונה מdi-nucleosomes,או מערך של nucleosomes. לפיכך, הפעילות של מתחם INO80 מדידה באמצעות מצע nucleosomal יותר מסובך ומגוון עשויה לספק תובנות לגבי המנגנון שבאמצעותו מתחמי שיפוץ הכרומטין INO80 מוסדרים.
כחלופה לשימוש שבברי DNA radiolabeled בשיפוץ הנוקלאוזום ומבחנים מחייבים, כמה חוקרים לחזות nucleosomes ו / או DNA על ידי צביעת DNA nucleosomal ברומיד ethidium 14; עם זאת, מבחני שבוצעו תוך שימוש בשיטות זיהוי שאינו רדיואקטיבי יכולים להיות הרבה פחות רגיש מזו שתוארה בפרוטוקול זה, בדרך כלל דורש שימוש בהרבה יותר אנזים.
מעקב אחר ההתקדמות של תגובות ATPase כפונקציה של זמן באמצעות assay מבוסס P 32 המתוארים כאן דורש סבבים נפרדים של טיפול מדגם וניתוח בכל נקודת זמן. כגישה חלופית, פעילות ATPase ניתן למדוד באמצעות מבחני הקרינה מבוססת הנהלים שתוארנו במאמר זה יופיטר היו בשימוש כדי לאפיין שלוש תכונות הביוכימיות שונות של subcomplexes INO80 או INO80 בתהליך של שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP. באמצעות subcomplexes INO80 שונים או מוטציות INO80 במבחנים אלה, ניתן לנתח את התרומה הפונקציונלית של יחידות משנה שונות INO80 ו / או מבני תחום לפעילות שיפוץ הנוקלאוזום INO80 ולהגדיר צעד (ים) בתגובת שיפוץ שביחידות משנת INO80 ו / או תחומים עשויים להיות חשובים. נהלים אלה יכולים להיות מותאמים למחקר של שיפוץ הנוקלאוזום אחר ואנזימים מחייבים וATPases with שני דנ"א ופעילויות הנוקלאוזום תלויים או בלתי תלויות. נציין, כי ייתכן שיש לי אנזימי הכרומטין שיפוץ שונים פעילויות ATPase או שיפוץ הנוקלאוזום גבוהות יותר או נמוך יותר מאשר פנימיות המורכב INO80 האנושי. לפיכך, כאשר התאמת פרוטוקולים אלה לניתוח של אנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים, אחד צריך להשתנות ריכוזים של אנזים, ATP, DNA או nucleosomes, וזמני תגובה ו / או טמפרטורות על מנת לייעל את מבחני לאנזימים מסוימים הנלמדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
- Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
- Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
- Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
- Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
- Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
- Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
- Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).
