Introduction
SNF2 가족 염색질 리모델링 단지는 중앙 SNF2 같은 ATPase의 서브 유닛 1, 2를 포함한다. 단일 서브 유니트 효소와 같은 일부 SNF2 형상 ATPases 기능, 다른 큰 멀티 소단위 복합체 촉매 서브 유닛으로서 기능하는 동안. 리모델링 복합체가 그들의 활동에 기여 염색질의 서브 유니트 각각은 리모델링 과정을 해부 생화학 분석을 수행 할 수있는 능력을 필요로하는 분자 메커니즘을 해명.
인간 INO80 착물 및 기타 염색질 개조 효소에 의해 ATP 의존적 뉴 클레오 리모델링은 그 DNA- 및 / 또는 뉴 클레오 의존적 ATPase를 활성화 한 후, 뉴 클레오로 리모델링 효소의 결합을 시작하는 다단계 과정으로 구상 될 수있다 뉴 클레오 솜 DNA, 그리고 뉴 클레오 1,2의 최종 위치 조정에 리모델링 효소의 전위. ATP 의존적 크로 마틴 리모델링 프로세스 (R)의 분자 세부 사항을 이해반응의 각 단계에 크로 마틴 리모델링 복합체의 개별 서브 유닛의 기여의 리모델링의 각 단계에 대한 반응 및 정의의 절개를 equires. 이런 분석은 in vitro에서 정의 된 분자의 기판을 사용하여 뉴 클레오 리모델링 및 기타 활동을 분석 할 수있는 능력을 필요로한다.
이전 조브 프로토콜에서, 우리는 정의 서브 유닛 조성 3 INO80 크로 마틴 리모델링 복합체 및 서브 콤플렉스를 생성하는 데 사용되는 절차를 설명했다. 여기서 우리는, DNA- 및 뉴 클레오-ATPase의 활성화, 이러한 복합체와 관련된 뉴 클레오 리모델링 활동을 결합 뉴 클레오의 정량 분석을 가능하게 세 가지 생화학 적 분석을 제시한다.
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Protocol
1 ATP에 의존하는 뉴 클레오 리모델링 분석 실험
뉴 클레오 리모델링 활동 ATP-의존성을 측정하기 위해, INO80를 immunopurified 또는 INO80의 서브 콤플렉스는 ATP와 216 bp의, 32 P-표지 된 DNA 단편의 일 단부에 위치하는 단일 뉴 클레오를 포함 mononucleosomal 기판과 함께 배양된다. 반응 생성물은 다음 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 전기 영동한다.
- 32 P-표지 된 ', 601'DNA 단편을 생성하기에서 증폭을 pGEM-3Z-601 4 올리고 뉴클레오티드로서 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG 및 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG을 사용하여 최종 위치 (601) 뉴 클레오 솜 위치 서열을 포함하는 216 염기쌍의 DNA 단편, 순방향 및 역방향 프라이머.
- 표 1에 기재된 바와 같이 100 ㎕의 PCR 반응을 설정한다.
- 다음 프로그램을 사용하여 서열 증폭기에서 PCR 반응을 수행하여 1 분을 96 ° C, followe에서94 ° C, 57 ° C, 30주기 동안 72 ° C에서 60 초에서 30 초에서 45 초만큼 D; 72 ° C에서 7 분으로 끝나는.
- PCR 반응이 완료되면, 클레아없는 스핀 컬럼을 통해 회 반응 생성물을 통과하여 통합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거한다.
- PCR 반응은 원하는 ~ 216 염기쌍의 DNA 단편을 생성 된 것을 확인하는 1.2 % 아가 로즈 겔에서 정제 된 PCR 산물의 5 μL를 실행.
- 정제 된 PCR 생성물 20 배량의 5 μL 희석하고 UV 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다. 평균 수율은 ~ 40 NG / μL이다.
- 섬광 계수기에서 정제 된 PCR 생성물의 1 μL의 방사능을 측정한다. 노출 당 비용 (CPM) / NG를 계산하여 라벨 효율을 추정한다. 성공적인 라벨링 반응물을 601 DNA 단편 ~ 15,000 CPM / NG을 수득 할 것으로 예상된다.
- 용액을 희석 방법 5를 사용하여 표시 601 DNA에 헬라 세포 뉴 클레오을 전송합니다.
- 2 pmol의 혼합32 P-표지 된 601 DNA 단편 헬라 뉴 클레오 6 μg 1.0 M의 NaCl, 10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 1 mM의 EDTA, 0.1 mM의 PMSF 및 1 ㎜를 포함하는 완충액 50 μL에 (같이 제조 5 참조) DTT와 30 분 동안 30 ° C에서 배양한다.
- 순차적 0.8 M, 0.6 M로 혼합물을 희석하고, 10 mM Tris-HCl (pH8.0)을, 1 mM의 EDTA, 0.1 mM의 PMSF의 각각 12.5 μL, 20.8 μL, 41.6 μL, 희석 0.4 M의 NaCl, 및 1 mM의 DTT, 각 희석 한 후 30 ° C에서 30 분 배양과 함께.
- 또한 30 분 동안 배양하여 다음 0.1 % Nonidet P-40, 20 % 글리세롤, 및 200 μg / ㎖ BSA를 함유하는 동일한 완충액 250 μL을 125 μL 첨가함으로써, 0.1 M의 NaCl로 한 다음 0.2 M 및로 혼합물을 희석 마지막이 희석 사이에 30 ° C에서. 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 mononucleosome 기판을 저장합니다.
- 10 μL의 총 부피에 ATP에 의존하는 뉴 클레오 슬라이딩 반응을 수행합니다. 정말이에요INO80 뉴 클레오 리모델링 활성을위한 최적의 NaCl 농도이기 때문에 ction의 구성 요소. 표 2에 나와있는 것은 ~ 50 mM의 염화나트륨 (미발표 결과), 고려에 함유 된 염화나트륨의 양을 가지고, 50 mm의 각 반응에서의 NaCl의 총 농도를 조정 뉴 클레오 효소의 준비.
- 분석을 설정하기 시작하기 전에 기본 폴리 아크릴 아마이드 젤 (18 X 16cm)를 캐스팅. 5 %의 아크릴 아미드를 함유 한 겔을 제조 (아크릴 아미드 : 37.5 비스 아크릴 아미드 : 1), 0.5의 TBE (45 mM 트리스 보레이트, 1 mM의 EDTA), 0.01 %과 황산 암모늄 (APS), 및 0.001 % N, N, N', N'의 -tetramethylethylenediamine (TEMED는). 표 3에 나와있는 재료를 혼합 겔을 실온에서 적어도 2 시간 동안 중합하도록 허용합니다.
- 각각의 반응을 수행하는 한편, 프리 실리콘이 냉장 된 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 ~ 20 nM의 INO80 또는 INO80의 subcomplex에 결합 (EB100 버퍼의 양 (같이 제조 3 참조)
- 'X'의 요소에 의해 확장, 나머지 재료와 함께 마스터 칵테일을 설정합니다 (여기서 반응의 X = 총 세). 단일 10 μL 반응에 필요한 각 성분의 양은 표 5에 열거한다; 레시피가 수행되는 반응의 수에 따라 확장 할 것이다. Pipetman와 튜브를 눌러 또는 피펫 팅 의해 아래로 잘 섞어 벤치 탑의 microcentrifuge에 몇 초 동안 튜브를 회전.
- 단계 1.3.2에서 설정 반응 관 각각에 마스터 칵테일 5.25 μl를 분배. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다. 30 ° C 열 블록 또는 물을 욕조에 반응 튜브를 전송하여 반응을 시작하고 2 시간 동안 배양한다.
- 한편, 경쟁 DNA를 포함하는 칵테일 '믹스를 제거하는'준비와 뉴 클레오는 X (반응 + 4 X = 총)의 요인에 의해 확장. 단일 반응 혼합물을 1.5 ㎕의 제거를 준비하기 위해 필요한 각 성분의 양을 표 6에 열거한다; 레시피가 수행되는 분석의 수에 따라 확장 할 것이다.
- 제거 믹스의 1.5 μl를 첨가하여 반응을 종료합니다. 잘 믹스 스핀 다운, 그리고 추가로 30 분 동안 30 ° C에서 배양.
- 한편, 일정한 버퍼 순환을 유지하기 위해 하부 챔버 내부의 자기 교반 막대 버퍼를 실행으로 0.5 배의 TBE를 사용하여, 4 ° C에서 30 분 동안 100 V에서 수직 전기 영동 장치의 기본 폴리 아크릴 아마이드 겔을 미리 실행합니다.
- 샘플을로드 배 TBE, 30 % 글리세롤, 0.25 % 브로 모 페놀 블루, 0.25 % 크실렌 Cyanol FF를 포함 로딩 염료의 2.5 μl를 추가합니다. 간단히 샘플을 회전, 잘 혼합, 및로드 정보를 사용하여 겔에로드합니다.
- 버퍼 순환 4 ° C에서 4.5 시간 동안 200 V에서 젤을 실행합니다.
- 신호를 검출하기 위해, 여과지의 두 시트의 스택 겔 옮긴다. 투명한 플라스틱 포장을 사용하여 상단에있는 겔 필터 종이 랩, 다음 원하는 시간 동안 4 ° C에서 저장 형광체 화면에 노출.
- 동위 원소 촬상 스캐너 시스템의 화면을 검색하고 적합한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다.
2 Mononucleosome 결합 분석
mononucleosomes위한 소정 INO80 복합체의 결합 친화도 분석법을 위해, 단계 120에서 생성 mononucleosomal 기판을 이용한 전기 영동 이동성 시프트 분석법 (EMSA)을 수행.
- 반응은 뉴 클레오 리모델링 분석에 대해 설명하지만 반응에서 ATP 및 제거 믹스를 생략으로 분석을 바인딩 믹스 설정; 30 분 동안 30 ° C에서 배양한다.
- 각 반응 혼합물에 로딩 염료의 2.5 μl를 추가하고, 3.5 %의 아크릴 아마이드 (아크릴 아미드가 포함 된 기본 폴리 아크릴 아마이드 겔에 적용 : 세 비스7.5 : 1), 1 % 글리세롤, 0.5 배의 TBE, 0.01 %의 APS 및 0.001 % TEMED.
- 버퍼를 실행으로 0.5 배의 TBE를 사용하여 버퍼 순환 4 ° C에서 2.5 시간 동안 200 V에서 젤을 실행하고 저장 형광체 화면에 노출.
3 DNA- 및 뉴 클레오 의존 ATPase의 분석 실험
20 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.5), 60 mM의 염화나트륨, 6.6 mM의 MgCl2를, 0.8 mM의 EDTA, 0.015 % Nonidet P-40, 2.5 % 글리세롤, 0.1 ㎎ / ㎖ BSA, 1을 포함하는 5 ㎕의 반응 혼합물에 ATPase를 세이를 수행 mM의 DTT, 0.1 mM의 PMSF, 2 mM의 ATP [α- 32 P] ATP의 2 μCi (3000 CI / mmol)을 첨가 하였다. INO80 단지의 각 INO80의 복잡하거나 시간 동안 원형 플라스미드 DNA 측정 (5,000 bp의, ~ 30 nm의) 폐쇄 함유 DNA- 또는 뉴 클레오 독립적 ATPase의 하나를 측정하는 세 병렬 반응, 일 포함 EB100 버퍼를 설정 정량 할 DNA- 의존적 ATPase를, 및 뉴 클레오 의존적 ATPase를 측정하는 한 헬러 oligonucleosomes (~ 185 나노 미터)을 포함. 얼음에 모두 반응을 설정합니다.
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Representative Results
수치는 뉴 클레오 슬라이딩 (그림 1) 및 바인딩 (그림 2) 분석 및 DNA- 또는 뉴 클레오 의존 ATPase의 분석 (그림 3)을 포함 INO80 활동을 특성화하는 데 사용되는 생화학 적 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다.
그림 1의 실험은 그대로 INO80 단지의 능력 FLAG-Ies2 또는 FLAG-INO80E을 통해 정제 INO80은 216 BP, 방사성 동위 원소 표지 된 DNA 단편 조립 mononucleosomes의 리모델링을 촉진하기 위해 FLAG-Ino80ΔN 또는 Ino80ΔNΔHSA 중 하나를 통해 정제 서브 콤플렉스의 비교합니다. DNA 단편의 뉴 클레오 솜의 위치는 전기 이동성에 영향을 미칩니다 측면에 위치 뉴 클레오 빨리 더 중앙에 위치 뉴 클레오보다 젤에서 실행합니다. INO80 염색질 리모델링 복합체가 우선적으로 DNA 6,7,8의 조각의 중심을 향해 mononucleosomes를 이동하기 때문에, 리모델링 활동 모니입니다전기 영동 이동성을 감소을 나타낼 뉴 클레오의 인구의 출현에 의해 tored. 반응 종결 후, 헬라 oligonucleosomes 연어 정자 또는 다른 DNA의 과량 바운드 리모델링 효소는 뉴 클레오 솜의 전기 영동 이동도를 변경하기 때문에, 임의의 기판 바인딩 INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스를 제거하는 경쟁자로서 반응 혼합물에 첨가되어야 기판. Ino80ΔNΔHSA을 통해 정제 단지도 Arp4, Arp8 및 YY1이 부족하면서 FLAG의 Ino80ΔN을 통해 정제 단지는, 후생 동물 별 소단위 INO80D, INO80E, 아미타, MCRS1, NFRKB 및 UCH37이 부족하다. FLAG-Ies2, FLAG-INO80E하고, FLAG-Ino80ΔN을 통해 정제 단지는 후생 동물 고유의 서브 유닛이 INO80 복합체에 의해 뉴 클레오 리모델링 비용 소비 있음을 나타내는 유사한 활동이있다. 리모델링 활동 Ino80 ATP의 HSA 도메인에 의존한다는 것을 나타내는 반면, 착물 FLAG-Ino80ΔNΔHSA 통해 정제하여 본 분석에서 비활성ASE 및 / 또는 그 연관된 서브 유닛.
그림 2의 실험은 전기 이동성의 변화 분석을 사용하여 INO80의 활동과 INO80의 서브 콤플렉스 바인딩 뉴 클레오을 비교합니다. 이러한 분석법은 뉴 클레오 바인딩 착물을 제거하는 반응의 종결시 oligonucleosomes 및 DNA의 더 첨가가 없다는 것을 제외하고, 뉴 클레오 리모델링 분석법과 유사하게 수행된다. 따라서, 그대로 INO80 착체의 양의 증가와 함께 뉴 클레오의 인큐베이션 INO80E 소단위 그래피 무연 mononucleosomes 및 겔의 상단 부근 이주 종 새로운 '이동'의 모습 (레인에 대응하는 밴드의 용량 의존적으로 사라짐에 이르게 6-8). 대조적으로, 뉴 클레오이 때, 시프트 된 종보다 빠르게 마이그레이션 INO80 서브 유닛의 서브 세트를 통해 부족 Ino80ΔN 정제되었다 작은 복합체와 함께 배양된다 (레인 2-5 및 9-11), 그 제안 상대적인 폭도슈퍼 - 시프트 된 밴드의 정량은 ility 착체의 크기에 의해 결정된다.
그림 DNA- 두 개의 다른 INO80의 서브 콤플렉스의 뉴 클레오 활성화 ATPase의 활동을 비교 분석의 세 결과를 보여준다. 천천히 마이그레이션 관광 명소 시작 α- 32 P는 ATP를 표시하고, 더 빠르게 마이그레이션 종 ADP 반응 생성물 아르에 해당; 화살표는 용매 마이그레이션의 방향을 나타냅니다.
여기에 정량 착물 중 하나 INO80ΔN는 다른, INO80ΔNC하면서 Ino80 C-말단 영역이 부족한 단백질의 정상적인 C-말단 연장 Ino80 ATPase의 서브 유닛을 포함한다. 두 착물 달리 동일하지만, (ADP에 무선 - 표지 된 ATP의 변환에 의해 측정 됨) ATP 가수 분해의 속도는 음의 활성을 조절할 수 Ino80 ATPase를의 C-말단을 시사 INO80ΔNC의 존재 크다. 참고 ATP의 HYDR의 속도두 단지에 의해 olysis이 단지는 ATP 가수 분해에 대한 뉴 클레오 솜 기판을 선호 리모델링 INO80의 뉴 클레오 솜을 제안, DNA보다 뉴 클레오의 존재 크다.
도면에 도시 된 분석에서, 유일한 DNA 또는 (탐지부터 DNA / 뉴 클레오 솜의 존재하에 관찰의 <5 % 범위) 뉴 클레오 결여 반응에서 ATP의 가수 분해가 매우 낮은 수준이다. INO80 다른 SNF2 가족 염색질 개조 효소 ATPase의 활성을 강력하게 DNA 또는 뉴 클레오 의해 자극되기 때문에, INO80 복합체의 정제 된 제제에 실질적인 DNA- 및 / 또는 뉴 클레오 독립적 ATPase의 활성의 존재는 세포 오염의 존재를 제안 DNA, 또는 대안 적으로, 성공적으로 정제하는 동안 제거되지 않은 비 INO80의 ATPases 오염. 여러 단계의 정제 중에 불필요한 DNA 및 / 또는 도입 ATPase를 최소화하도록 수행 될 수있다.
1)들 증가정화 동안 바인딩 및 세척 단계에서 ALT 농도 (염화나트륨). 바인딩 및 세척 단계에서 200 mm 이상 염화나트륨의 사용은 일반적으로 DNA 및 / 또는 ATPases 오염의 수용 할 수없는 수준의 리모델링 단지의 준비를 얻을 수 있습니다. 우리는 정기적 (3 참조) 오염 물질을 최소화하기 위해 450 mM의 염화나트륨을 함유하는 완충액을 사용 INO80 착체를 정제. 우리는 활성 INO80 단지를 정화 한 M의 NaCl만큼 포함하는 버퍼를 사용하고 있습니다; 그러나, 우리는 이들 조건 하에서 활성 물질의 수율 감소를 얻었다;
2) 아가로 오스 immunopurification 동안 세포 용 해물에 FLAG의 비율을 감소; FLAG-아가 로스의 최적 량은 적정에 의해 결정되어야한다;
3) ATP에 의존하는 보호자는 immunopurification 동안 FLAG-태그 단백질에 결합 된 상태로 유지 할 수 있습니다. 이들은 종종 immunopurification 동안 세척 완충액에 1 mM의 ATP를 포함함으로써 제거 될 수있다;
4) 우리는 성공적인이Y는 / ㎖-FLAG 아가 로스 비드와 추출액의 인큐베이션 동안 25 유닛 농도 benzonase를 포함하여 DNA의 오염을 제거했다. 주의 : 잔류 DNase의이 INO80 활동에 대한 분석 중에 기판 DNA 또는 뉴 클레오이 저하됩니다로 확인 benzonase는 이후 세척 단계에서 제거하기 위해 필수적이다.
이러한 ATPase의 분석의 해석은 원칙적으로 INO80 염색질 리모델링 복합체가 SNF2 같은 핵심 ATPase의 Ino80, 액틴과 같은 단백질 ARP5, Arp8, Baf53a, 액틴 등 여러 가지 잠재적 인 ATPases를 포함한다는 사실, 그리고 단 + 복잡 할 수 ATPases Tip49a 및 Tip49b. 여러 ATPases의 물리적 존재에도 불구하고, 이전의 연구 만이 복합체 Ino80 DNA- 또는 뉴 클레오 활성 ATP 가수 분해를 지원할 수있는 촉매 활성을 함유하는 것으로 나타났다; Ino80 ATPase의의 촉매 비활성 E653Q 양식을 포함하는 복합체 검출 DNA- 또는 뉴 클레오 자극 ATPase를 맛보게을 전시하는 데 실패어떤 조건에서 vity 8을 테스트했다. 따라서, DNA- 및 / 또는 INO80 또는 INO80의 서브 콤플렉스의 뉴 클레오 자극 ATPase의 활동은 주로 Ino80 ATPase의 서브 유닛에 기부된다.
그림 1 INO80의 nucleosome 리모델링 활동은 Ino80 HSA 도메인 및 / 또는 관련 하부 단위에 따라 달라집니다하지만 Ino80 NTD 및 후생 동물 고유의 서브 유닛의 독립적이다. 뉴 클레오 리모델링 분석이 FLAG를 발현하는 세포주로부터 제조 된 핵 추출물에서 FLAG-immunopurified 단지로 수행되었다 야생형 또는 돌연변이 INO80 서브 유닛의 -tagged 버전. 그대로 INO80 착물은 FLAG-Ies2 또는 FLAG-INO80E 발현 세포주로부터 정제 하였다; INO80의 서브 콤플렉스는 FLAG-Ino80ΔN 또는 FLAG-Ino80ΔNΔHSA을 표현 세포주에서 정제 하였다. 하나의 상대 농도 (REL. 진한는.) ~ 10 nM의 INO80 단지에 해당한다.
INO80 컴플렉스 바인딩 그림 2 뉴 클레오 솜은 Ino80 NTD 및 후생 동물 고유의 서브 유닛의 독립적이다. 뉴 클레오 결합 분석은 지정된 FLAG-immunopurified INO80 단지의 다양한 양의 존재 하였다. INO80 또는 INO80의 서브 콤플렉스의 결합이 안정적으로 INO80 또는 INO80의 서브 콤플렉스에 구속 mononucleosomes에 해당하는 느린 마이그레이션 "슈퍼 이동"밴드의 출현에 결과를 mononucleosomes 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 51,721 / 51721fig3highres.jpg "/>
도 3 DNA- 및 뉴 클레오 의존적 ATPase의 분석. TLC (박층 크로마토 그래피) ATPase의 분석을 통해 정제하여 서브 콤플렉스 INO80 의한 ATP 가수 분해의 속도를 측정하기 위해 수행되었다 기반 FLAG-Ino80ΔN (ΔN) 또는 FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC)에서 DNA 또는 뉴 클레오 양의 포화의 존재. 분석은 각 복합체의 두 가지 농도 (5 nM 내지 10 nM의) 및 세 가지 반응 번을 사용하여 수행 하였다. 반응에 (pmol의에서) 가수 분해 ATP의 양은 각 패널 아래에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 67.5 μL | H 2 O |
| 10 μL | 10 배 PCR 반응 완충액 (자료 목록 참조) | </ TR>
| 1 μL | 을 pGEM-3Z-601 (10 NG / μL) |
| 5 μL | 앞으로 프라이머 (10 μM) |
| 5 μL | 역방향 프라이머 (10 μM) |
| 0.5 ㎕의 | 10 mM의 4 각 dNTP의 dNTP를 포함하는 원액 |
| 1 μL | 의 Taq DNA 중합 효소 (5 개 / μL) |
| 10 μL | [α- 32 P] dCTP (6000 CI / 밀리몰, 3.3 μM) |
방사성 표지 '601'DNA 단편의 PCR 증폭에 대한 표 1의 반응 믹스.
| 20 nM의 | INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스 |
| 2.8 nm의 | (32 P-표지 된 DNA 절편 (601)와 헬라 세포에서 뉴 클레오 mononucleosomes의 혼합물로 이루어진) 뉴 클레오 |
| 1 ㎜ | 초순수 ATP |
| 20 mM의 | HEPES-수산화 나트륨 (산도 7.9) |
| 50 mM의 | 염화나트륨 |
| 5 mM의 | MgCl2를 |
| 1 ㎜ | 디티 오 트레이 톨 (DTT) |
| 0.1 mM의 | 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF) |
| 0.1 ㎎ / ㎖ | 소 혈청 알부민 (BSA) |
| 5 % | 글리세롤 |
| 0.02 % | Nonidet P-40 |
| 0.02 % | 트리톤 X-100 |
ATP에 의존하는 뉴 클레오 리모델링 분석의 표 2 구성 요소.
| 32.6 ML | H 2 O |
| 5 ML | 40 % 아크릴 아미드 / 비스 (37.5 : 1) |
| 2 ML | 10 배 TBE (900 mM의 트라이S-보레이트, 20 mM의 EDTA) |
| 젤을 주입하기 전에 다음과 같은 성분을 즉시 추가 : | |
| 0.4 ml의 | 10 %과 황산 암모늄 |
| 0.1 ml의 | TEMED |
ATP에 의존하는 뉴 클레오 리모델링 분석에 대한 기본 폴리 아크릴 아마이드 겔의 표 3 준비.
| 10 mM의 | HEPES pH를 7.9 |
| 10 % | 글리세롤 |
| 100 밀리미터 | 염화나트륨 |
| 1.5 mM의 | MgCl2를 |
| 0.05 % | 트리톤-100 |
| 사용 직전 추가 | |
| 1 ㎜ | DTT |
| 200 μM | PMSF |
| 1 : 1000 희석 | 프로테아제 억제제 COCktail (자료 목록 참조) |
표 4 EB100 버퍼입니다.
| 3.9 ㎕의 | H 2 O |
| 1 μL | 배 리모델링 완충액 (200 mM의 HEPES-수산화 나트륨 (pH를 7.9), 0.2 % NP-40, 0.2 % 트리톤 X-100, 50 % 글리세롤, 50 mM의 MgCl2를, 1 ㎎ / ㎖ BSA) |
| 0.1 ㎕의 | 100 mM의 ATP |
| 0.01 μL | 한 M DTT |
| 0.01 μL | 100 mM의 PMSF |
| 0.25 μL | 단계 1.2에서 재구성 mononucleosome 기판 |
표 ATP 의존적 뉴 클레오 리모델링 분석 용 마스터 칵테일 5의 구성 요소.
| 0.33 μL | 400 nm의 헬라 뉴 클레오 |
| 0.75 μL | 100 nm의 초음파 연어 정자 DNA를 |
| 0.01 μL | 한 M DTT |
| 0.01 μL | 100 mM의 PMSF |
표 6 믹스 칵테일을 제거.
| 2 μL | H 2 O |
| 0.25 μL | 400 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.5), 200 mM의 염화나트륨을 함유하는 20 배 ATPase를 버퍼, 132 mM의 MgCl2를, 16 mM의 EDTA, 0.3 % Nonidet P-40, 50 % 글리세롤, 2 ㎎ / ㎖ BSA |
| 0.1 ㎕의 | 100 μM ATP |
| 0.005 μL | 한 M DTT |
| 0.005 μL | 100 mM의 PMSF |
| 0.1 ㎕의 | [α- 32 P] ATP (3000 CI / mmol)을 |
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Discussion
, 그리고 리모델링 및 / 또는 ATPase의 효소 오염에 우리가 분석에서 관찰하는 뉴 클레오 리모델링 및 ATPase의 활동 INO80 복합체의 촉매 활성에 따라 보장하기 위해, 우리는 정기적으로 분석 뉴 클레오 리모델링 및 INO80 단지의 촉매 비활성 버전의 ATPase의 활동은 정제 야생형 INO80 동일한 절차를 사용하여 평행. INO80 착체 또는 서브 콤플렉스의 다른 제제의 액티비티를 비교하는 실험의 해석을 복잡하게 할 수 ATP 및 / 또는 ATP 독립적 리모델링 활동 오염의 존재를 테스트하는 뉴 클레오 리모델링 활성을 시금 때 ATP 결여 된 음성 대조군 반응물을 또한 수행한다. 촉매 INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스의 비활성 버전은 더 뉴 클레오 리모델링 또는 ATPase의 활동을 전시 없습니다. 또한, 뉴 클레오 DNA- 또는 독립적 ATPase의 활성의 검출에 enzym ATPase를 (들)를 오염의 존재를 표시전자 분율. 활성은 여전히 촉매 비활성 Ino80의 존재하에 검출 된 경우 또는 실질적인 DNA- 또는 뉴 클레오 독립적 ATPase의 활동도에 설명 된대로 정제를 최적화 한 후이 있다면 '대표 결과,'착체는 또한 이온 교환 또는 추가 단계를 사용하여 정제 할 수있다 겔 여과 크로마토 그래피 구배 침강.
뉴 클레오 리모델링 및 ATPase의 활동을 측정 할 때, 제품 시간 및 용량 - 반응 곡선은 선형 일 때 측정이 취해지고되도록 시간의 길이를 변화시키는과 INO80 또는 INO80의 서브 콤플렉스 이상의 농도로 분석을 수행하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 결합 분석은 뉴 클레오 INO80 착물 (들)의 여러 농도를 사용하여 수행되어야한다; 그렇지 않으면, 다른 하나는 확실 INO80 제제의 활동을 비교할 수 없다.
뉴 클레오 슬라이딩 결합 분석은 항상 제어 반응을 포함해야한다그 시작 뉴 클레오 인구의 전기 영동 이동성을 표시 마커를 단독 mononucleosome 기판을 포함한다. 이러한 방식으로, 하나 쉽게 구체적 효소 분획의 존재로 인한 변화를 식별 할 수있다. 이러한 제어 반응은 또한 재구성 mononucleosomes의 무결성을 평가.
슬라이딩 결합 분석 뉴 클레오 쉽게 해석을 실시하기 위해, 동질 mononucleosomal 기판을 생성하는 것이 유용하다; 그 때문에,이 프로토콜에 기재된 분석법은 강한 뉴 클레오 포지셔닝 서열을 함유하는 DNA 단편을 조립 된 뉴 클레오 솜을 사용한다. INO80의 복잡한 DNA 단편에 더 중심 위치에 측면으로 위치 뉴 클레오의 위치를 변경하는 경향이 있지만, 같은 ISWI 함유 NURF 단지 9 다른 염색질 리모델링 효소는 DNA 조각의 끝을 향해 더 중앙 위치에서 뉴 클레오 이동합니다. 따라서, 모든 염색질 리모델링의 특성 동안 엔그것은 뉴 클레오 솜 위치 시퀀스가 다른 장소에있을 mononucleosome되는 기판을 제조하는 것이 유용하다 zyme. 또한, 하나는 뉴 클레오는 뉴 클레오 솜 위치 순서없이 DNA 조각에 조립되어있는 기판을 사용할 수있다. 이 경우, 출발 뉴 클레오 인구보다 중앙에서 가로 방향으로 배치 뉴 클레오의 혼합물을 포함 할 것이다.
ATP 의존적 뉴 클레오 리모델링 과정은 반응이 평형에 도달하면 뉴 클레오 솜의 위치의 변화로 이어질 않을 수도 DNA로부터 완전한 뉴 클레오 변위, DNA의 뉴 클레오 솜의 움직임, 또는 뉴 클레오 솜 구조의 일시적인 변화를 포함하여, 다양한 개조 결과로 이어질 수 그럼에도 불구하고 기능적으로 중요합니다. 뉴 클레오 슬라이딩 분석은 처음 두 반응을 모니터링 할 수 있습니다 설명하지만, 뉴 클레오 솜 구조에 과도 변화를 감지하지 못할 수 있습니다. 몇 가지 예를 과도 고도를 감지 할 수있는 하나의 분석작 동 슬라이딩 또는 뉴 클레오 솜 DNA의 부분 해제가 절단되기 쉽다 뉴 클레오 의해 량체 표면으로부터 변위 된 링커 DNA 반면, 뉴 클레오 옥타 머의 표면에 뉴 클레오 솜 DNA를 제한 효소로 절단하여 크게 액세스한다는 사실을 활용 10,11,12. 뉴 클레오 리모델링 효소는 경쟁자 (13)에 의해 제거 할 수 있으므로 그 기재에 단단히 결합되도록 분석은 또한 경우에 특히 유용 할 수있다.
우리의 뉴 클레오 슬라이딩 및 분석은 기본 헬라 세포 히스톤 준비 mononucleosomal 기판을 사용하여 INO80 활동을 측정 바인딩. 그러나 INO80 또는 기타 염색질 개조 효소의 활동이 개장 원칙적으로 존재하거나 특정 번역 후 변형 또는 히스톤 변형의 유무에 의해 영향을받을 수있다. 또,이 디 mononucleosomes 뉴 클레오 다르게 INO80 착체의 활동을 자극 수도또는 뉴 클레오의 배열. 따라서, 더 복잡하고 다양한 뉴 클레오 솜의 기판을 사용하여 측정 INO80 복합체의 활동은 INO80 염색질 리모델링 복합체가 조절되는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수있다.
뉴 클레오 리모델링 및 결합 분석에서 방사성 표지 된 DNA 단편의 사용에 대한 대안으로서, 일부 연구자는 에티 디움 브로마이드 (14)와 함께 뉴 클레오 솜 DNA를 뉴 클레오 염색 및 / 또는 DNA를 시각화; 그러나, 분석은 일반적으로 상당히 많은 효소의 사용을 필요로하는,이 프로토콜에 기술 한 것보다 훨씬 덜 민감 할 수있는 비 - 방사능 검출 방법을 이용하여 수행 하였다.
여기에 설명 된 P-32 기반 분석을 사용하여 시간의 함수로서 ATPase의 반응의 진행을 모니터링하는 것은 각 시점에서의 시료 처리 및 분석의 분리 원을 필요로한다. 대안으로, ATPase의 활성은 형광 계 분석을 이용하여 측정 할 수있다 우리가이 정돈 용지에 기재된 절차는 ATP 의존적 뉴 클레오 리모델링 과정에 INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스 세 가지 생화학 적 성질을 특성화하는데 사용되어왔다. 다양한 INO80 서브 콤플렉스 또는 이들 분석법에서 INO80 변이주를 사용함으로써, INO80의 뉴 클레오 개장 활동 다양 INO80 서브 유닛 및 / 또는 도메인 구조의 기능적 기여를 해부 및 리모델링 반응 단계 (들)을 정의 할 수있는 INO80 소단위 및 / 또는 도메인은 중요 할 수있다. 이러한 절차는 다른 뉴 클레오 리모델링의 연구와 결합 효소와 ATPases w에 적용 할 수 있습니다i 번째 DNA- 앤 뉴 클레오 의존하거나 독립적 인 활동을 모두. 우리는 다른 크로 마틴 리모델링 효소는 인간의 INO80 단지보다 높거나 낮은 고유 ATPase의 또는 뉴 클레오 리모델링 활동을 가질 수 있습니다. 다른 염색질 개조 효소 분석을 위해 이러한 프로토콜을 채택 할 때 특정 효소 연구되고 대한 따라서, 하나의 분석을 최적화하기 위하여 효소, ATP, DNA 또는 뉴 클레오하고, 반응 시간 및 / 또는 온도의 농도를 변화한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
- Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
- Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
- Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
- Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
- Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
- Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
- Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).
