Introduction
SNF2 familie kromatin remodeling komplekser inkluderer en sentral SNF2 lignende ATPase subenhet 1,2. Noen SNF2 lignende ATPaser funksjon som enkelt subenheten enzymer, mens andre fungere som den katalytiske subenhet av større multi-subenheten komplekser. Belyse de molekylære mekanismer som hver av de underenhetene i kromatin remodeling komplekser bidra til deres virksomhet krever evne til å utføre biokjemiske analyser som dissekere remodeling prosessen.
ATP-avhengige nucleosome remodellering av den menneskelige INO80 kompleks og andre kromatin ombygging enzymer har en virkemåte som en flertrinnsprosess som starter med binding av enzymet til ombygging nucleosomes, etterfulgt av aktivering av dens DNA-og / eller nucleosome avhengig ATPase, translokasjon av ombygging enzymet på nucleosomal DNA, og eventuell omplassering av nucleosomes 1,2. Forstå de molekylære detaljene i ATP-avhengige kromatin remodeling prosessen requires disseksjon av ombygging reaksjonen i sine enkelte trinn og definisjon av bidragene av individuelle subenheter av kromatin ombygging komplekset til hvert trinn av reaksjonen. Slike analyser krever evnen til å analysere nucleosome ombygging og andre aktiviteter ved hjelp av definerte molekylære substrater in vitro.
I en tidligere Jove protokollen, beskrev vi prosedyrer som brukes til å generere INO80 kromatin remodeling komplekser og subcomplexes med definerte subenheten komposisjoner tre. Her presenterer vi tre biokjemiske analyser som gjør at kvantitativ analyse av nucleosome bindende, DNA og nucleosome-aktivert ATPase, og nucleosome remodeling aktiviteter knyttet til slike komplekser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ATP-avhengige nucleosome remodeling Analyser
Å måle ATP-avhengige nucleosome remodeling aktiviteter, immunopurified INO80 eller INO80 subcomplexes inkuberes med ATP og et mononucleosomal substrat, som inneholder en enkelt nucleosome plassert i den ene enden av en 216-bp, 32 P-merket DNA-fragment. De reaksjonsprodukter blir deretter underkastet elektroforese i native poly-akrylamidgeler.
- For å generere 32 P-merket, '601' DNA fragment, forsterke fra pGEM-3Z-601 4 a 216 bp DNA fragment som inneholder en slutt plassert 601 nucleosome posisjonering sekvens, ved hjelp av oligonukleotider 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG og 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG som forover og bakover primere.
- Sett opp en 100 pl PCR-reaksjon som beskrevet i tabell 1.
- Utfør PCR reaksjoner i en termosykler ved hjelp av følgende programmer: 1 min ved 96 ° C, followed med 45 sek ved 94 ° C, 30 sek ved 57 ° C, 60 sek ved 72 ° C i 30 sykluser; slutter med 7 min ved 72 ° C.
- Etter PCR reaksjonen er ferdig fjerne kommunefritt nukleotider ved å sende reaksjonsproduktene to ganger gjennom nukleasefritt spin kolonner.
- Kjør 5 pl av det rensede PCR-produkt i en 1,2% agarosegel for å bekrefte at PCR-reaksjonen ble generert ønsket ~ 216 bp DNA-fragment.
- Fortynn 5 ul av det rensede PCR-produkt 20-fold, og måle den DNA-konsentrasjon ved hjelp av et UV-spektrofotometer. Den gjennomsnittlige avkastningen er ~ 40 ng / mL.
- Måle radioaktiviteten av en pl av det rensede PCR-produkt i en scintillasjonsteller. Anslå merking effektivitet ved å beregne cpm / ng. En vellykket merking reaksjonen ventes å gi ~ 15.000 cpm / ng av 601-DNA-fragment.
- Overfør Hela celle nucleosomes på merket 601 DNA ved hjelp av en seriell fortynning metode fem.
- Bland 2 pmol av32 P-merkede 601-DNA-fragment med 6 ug Hela nucleosomes (fremstilt som beskrevet 5) i 50 pl av en buffer inneholdende 1,0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF og 1 mM DTT og inkuber ved 30 ° C i 30 min.
- Sekvensielt fortynne blandingen til 0,8 M, 0,6 M og 0,4 M NaCl ved fortynning med 12,5 mL, 20.8 mL, og 41,6 pl, henholdsvis, av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, og 1 mM DTT, med en 30 min inkubasjon ved 30 ° C etter hver fortynning.
- Ytterligere fortynne blandingen til 0,2 M og deretter til 0,1 M NaCl ved tilsetning av 125 pl og deretter 250 ul av den samme buffer inneholdende 0,1% Nonidet P-40, 20% glycerol, og 200 ug / ml BSA, med en 30 min inkubasjon ved 30 ° C mellom de to siste fortynninger. Oppbevar mononucleosome underlaget ved 4 ° C i opptil tre måneder.
- Utfør ATP-avhengige nucleosome skyve reaksjoner i et totalt volum på 10 pl. ReaDette skjer bestanddelene er listet opp i tabell 2. Siden den optimale NaCl konsentrasjon for INO80 nucleosome ombygging aktivitet er ~ 50 mM NaCl (upubliserte resultater), justere den totale konsentrasjonen av NaCl i hver reaksjon på 50 mm, tar hensyn til mengden av NaCl som finnes i preparater av nucleosomes og enzym.
- Før du begynner å sette opp analyser, kastet innfødte poly-akrylamid gels (18 x 16 cm). For å fremstille en enkelt gel inneholdende 5% akrylamid (akrylamid: bisakrylamid 37.5: 1), 0.5x TBE (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA), 0,01% ammoniumpersulfat (APS), og 0,001% N, N, N ', N'tetrametyletylendiamin (TEMED), blande ingrediensene som er oppført i tabell 3. La gel å polymerisere i minst 2 timer ved romtemperatur.
- I mellomtiden, for hver reaksjon som skal utføres, kombineres i en pre-avkjølt silikonisert 1,5 ml mikrosentrifugerør ~ 20 nM INO80 eller INO80 subcomplex (fremstilt som beskrevet 3) med en mengde av EB100 buffer (
- Sett opp en master cocktail med resten av ingrediensene, skalere opp med en faktor på "X" (der X = antall reaksjoner +3). Mengden av hver bestanddel som er nødvendig for en enkelt 10 pl reaksjon er oppført i tabell 5; oppskriften bør bli skalert opp i henhold til antallet av reaksjoner som skal utføres. Bland godt ved å peke på tube eller ved å pipettere opp og ned med en Pipetman og spinne rør for noen få sekunder i en benkeplate Bøk mikrosentrifuge.
- Tilsett 5,25 mL av master cocktail til hvert av reaksjonsrørene er satt opp i trinn 1.3.2. Bland godt ved å pipettere opp og ned. Begynn reaksjoner ved å overføre reaksjonsrørene til en 30 ° C varmeblokk eller et vannbad og inkuber i 2 timer.
- I mellomtiden forbereder 'fjerne mix' cocktail som inneholder konkurrent DNAog nucleosomes, skalere opp med en faktor X (X = totalt antall reaksjoner + 4). Mengden av hver bestanddel som trengs for å lage 1,5 pl fjerne blanding for en enkelt reaksjon er oppført i tabell 6; oppskriften bør bli skalert opp, avhengig av antallet av analyser som skal utføres.
- Terminere reaksjonene ved tilsetning av 1,5 mL av den fjerne blanding. Bland godt, spinne ned, og inkuber ved 30 ° C i ytterligere 30 min.
- I mellomtiden, pre-løp native polyakrylamid gel elektroforese i en vertikal enhet ved 100 V i 30 min ved 4 ° C, ved hjelp av 0.5x TBE som løpende buffer med en magnetisk rørestav inne i det nedre kammeret for å opprettholde konstant buffer sirkulasjon.
- Slik legger du prøven, tilsett 2,5 mL av lasting fargestoff som inneholder 3x TBE, 30% glyserol, 0,25% bromfenolblå, og 0,25% Xylen cyanol FF. Bland godt, kort spinne prøvene, og laste inn gelen ved hjelp av laste tips.
- Kjør gelen ved 200 V i 4,5 timer ved 4 ° C med buffer sirkulasjon.
- For å detektere signalet, å overføre gelen i en stabel av to ark av filterpapir. Pakk filterpapiret med gel på toppen ved hjelp klar plastfolie, og deretter utsette den til et lagrings fosfor skjermen ved 4 ° C for ønsket tid.
- Skann skjermen med en isotop bildebehandling skanner systemet og analysere data ved hjelp av egnet programvare.
2. Mononucleosome bindingsanalyser
For å analysere den bindende affinitet av et gitt INO80 kompleks for mononucleosomes, utføre en Elektrofore Mobility Shift Assay (EMSA) ved hjelp av mononucleosomal substrat generert i trinn 1.2.
- Sett opp reaksjonsblandinger for binding analyser som beskrevet for nucleosome remodeling analyser, men utelater ATP og fjerne blanding fra reaksjonene; Inkuber ved 30 ° C i 30 min.
- Legg 2,5 mL av laste fargestoff til hver reaksjonsblanding, og gjelder for en innfødt polyakrylamidgel inneholdende 3,5% akrylamid (akrylamid: bis 37,5: 1), 1% glycerol, 0.5x TBE, 0,01% APS, og 0,001% TEMED.
- Ved hjelp av 0.5x TBE som rennende buffer, drevet gelen ved 200 V i 2,5 timer ved 4 ° C med buffer sirkulasjon og utsettes for en lagrings fosfor-skjerm.
3. DNA og nucleosome-avhengige ATPase Analyser
Utfør ATPase-assays i 5 ul reaksjonsblandinger inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl, 6,6 mM MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% glycerol, 0,1 mg / ml BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 uCi av [α- 32P] ATP (3000 Ci / mmol). For hver INO80 kompleks eller mengden av INO80 kompleks som skal undersøkes, satt opp i tre parallelle reaksjoner, inneholdende en EB100 buffer for å måle DNA-eller nucleosome uavhengig ATPase, en som inneholder lukket sirkulært plasmid-DNA (5000 bp, ~ 30 nM) for å måle DNA- avhengig ATPase, og en som inneholder Hela oligonucleosomes (~ 185 nM) for å måle nucleosome avhengig ATPase. Sett opp alle reaksjoner på is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tallene viser representative resultatene av biokjemiske analyser som brukes for å karakterisere INO80 aktiviteter, inkludert nucleosome skyve (figur 1) og binding (figur 2) analyser og DNA eller nucleosome avhengig ATPase-analyser (figur 3).
Eksperimentet vist i figur 1 sammen evne intakte INO80 komplekser renset gjennom FLAG-Ies2 eller FLAG-INO80E og INO80 subcomplexes renset gjennom enten FLAG-Ino80ΔN eller Ino80ΔNΔHSA å katalysere ombygging av mononucleosomes montert på en 216 bp, ble radiomerket DNA fragment. Posisjonen til nucleosome på DNA-fragmentet påvirker elektrofore mobilitet; lateralt plassert nucleosomes kjøre raskere i gelen enn mer sentralt plassert nucleosomes. Siden INO80 kromatin remodeling komplekser fortrinnsvis flytte mononucleosomes mot midten av et stykke DNA 6,7,8, er ombygging aktivitet monitored av fremveksten av en befolkning på nucleosomes som viser redusert elektromobilitet. Ved slutten av reaksjonen, må et overskudd av Hela oligonucleosomes og laksesperm-DNA eller andre tilsettes til reaksjonsblandingen som konkurrent til å fjerne eventuelle substrat-bundet INO80 eller INO80 subcomplexes, siden bundet ombygging enzym vil forandre den elektroforetiske mobilitet av nucleosome substrat. Komplekser renset gjennom FLAGG Ino80ΔN mangler metazoan spesifikke subenheter INO80D, INO80E, Amida, MCRS1, NFRKB, og UCH37, mens komplekser renset gjennom Ino80ΔNΔHSA mangler også Arp4, Arp8, og YY1. Komplekser renset gjennom FLAG-Ies2, FLAG-INO80E, og FLAG-Ino80ΔN har lignende aktiviteter, noe som indikerer at de metazoan spesifikke subenheter er unnværlig for nucleosome ombygging av INO80 kompleks. I kontrast, komplekser renset gjennom FLAG-Ino80ΔNΔHSA er inaktive i denne analysen, noe som indikerer at ombygging aktivitet avhenger av HSA domenet til Ino80 ATPase og / eller en av våre assosierte subenheter.
Forsøkene i Figur 2 sammenligne nucleosome bindende aktiviteter INO80 og INO80 subcomplexes bruker elektro mobilitet skift analyser. Disse forsøk ble utført på samme måte som de nucleosome remodeling analysene, bortsett fra at det ikke er noen tilsetning av oligonucleosomes og DNA ved avslutningen av reaksjonen å fjerne nucleosome bundne komplekser. Følgelig inkubering av nucleosomes med økende mengder av intakte INO80 komplekser renset gjennom INO80E subenheten fører til en doseavhengig forsvinning av båndet som svarer til frie mononucleosomes og utseende av en ny 'forskyves' art som vandrer i nærheten av toppen av gelen (kolonnene 6-8). I kontrast, når nucleosomes inkuberes med mindre komplekser som var blitt renset gjennom Ino80ΔN og som mangler en undergruppe av INO80 subenheter, vandrer raskere forskjøvet arter (søyle 2-5 og 9-11), noe som tyder på at den relative mobilitet av super-forskjøvet båndet bestemmes av størrelsen av kompleksene analysert.
Figur 3 viser resultatene av en analyse som sammenligner DNA-og nucleosome-aktivert ATPase-aktivitet på to forskjellige INO80 subcomplexes. De mer langsomt migrerende flekker korresponderer til start α- 32 P-merket ATP, og hurtigere migrerende arter er ADP reaksjonsprodukter; Pilene viser retningen av løsemiddel migrasjon.
En av de komplekser analysert her, INO80ΔN, omfatter en Ino80 ATPase-subenhet som strekker seg til protein normale C-enden, mens den andre, INO80ΔNC mangler Ino80 C-terminale region. Selv om disse to komplekser er ellers identisk, er frekvensen av ATP-hydrolyse (målt ved omdanning av radiomerket ATP til ADP) større i nærvær av INO80ΔNC, noe som tyder på at C-terminus av den Ino80 ATPase kan negativt regulerer dens aktivitet. Legg merke til at frekvensen av ATP hydrhemolyse av begge komplekser er større i nærvær av nucleosomes enn DNA, noe som tyder på INO80 nucleosome ombygging komplekser foretrekker nucleosomal substrater for ATP-hydrolyse.
I analysen er vist i figuren, er det bare et meget lavt nivå av ATP-hydrolyse i reaksjoner som mangler DNA eller nucleosomes (som strekker seg fra ikke-detekterbar til <5% av det som ble observert i nærvær av DNA / nucleosomes). Fordi aktiviteten av ATPase INO80 og andre SNF2 familien kromatin remodeling enzymer er sterkt stimulert av DNA eller nucleosomes, vil tilstedeværelsen av betydelig DNA-og / eller nucleosome uavhengig ATPase-aktivitet i de rensede preparater av den INO80 kompleks tyder på tilstedeværelsen av forurensende celle DNA, eller alternativt, ikke-forurensende INO80 ATPaser som ikke ble fjernet ved rensing. Flere trinn kan tas for å minimere uønsket å innføre DNA og / eller ATPase i løpet av rensingen.
1) Øke salt konsentrasjon (NaCl) i bindingen og vasketrinnene i løpet av rensingen. Bruk av mindre enn 200 mM NaCl i et forpliktende og vasketrinn gir vanligvis preparater av remodeling komplekser med uakseptable nivåer av forurensende DNA og / eller ATPases. Vi rutinemessig rense INO80 komplekser ved hjelp av en buffer inneholdende 450 mM NaCl for å minimere forurensninger (beskrevet i 3). Vi har benyttet buffere inneholdende så mye som 1 M NaCl for å rense aktive INO80 komplekser; men vi får en redusert utbytte av aktive komplekser under disse betingelser;
2) Reduser forholdet FLAG agarose til cellelysat under immunorensing; den optimale mengden av FLAG-agarose bør bestemmes ved titrering;
3) ATP-avhengige anstand kan fortsatt være bundet til å flagge-merket proteiner under immunorensing. Disse kan ofte fjernes ved å ta med 1 mM ATP i vaskebuffer under immunorensing;
4) Vi har vellykkety fjernet kontaminerende DNA ved å inkludere benzonase ved en konsentrasjon på 25 enheter / ml ved inkubering av ekstrakten med FLAG-agarose-perler. FORSIKTIG: Det er viktig å sørge for at benzonase fjernes under de etterfølgende vasketrinn, som rest DNase vil forringe underlaget DNA eller nucleosomes under analyser for INO80 aktivitet.
Tolkningen av disse ATPase analyser kan i prinsippet være komplisert ved det faktum at INO80 kromatin remodeling komplekser inneholde flere potensielle ATPases, inkludert SNF2-lignende kjerne ATPase Ino80, aktin-lignende proteiner Arp5, Arp8, Baf53a, aktin, og AAA + ATPases Tip49a og Tip49b. Til tross for den fysiske tilstedeværelse av flere ATPaser, men har tidligere undersøkelser vist at bare komplekser inneholdende katalytisk aktive Ino80 kan støtte DNA eller nucleosome-aktivert ATP-hydrolyse; komplekser som inneholder det katalytisk inaktive E653Q form av Ino80 ATPase ikke klarer å utvise påviselig DNA eller nucleosome-stimulert ATPase Actiteten under alle forhold testet åtte. Således er DNA-og / eller nucleosome-stimulert ATPase-aktivitet av INO80 eller INO80 subcomplexes hovedsakelig bidrar med Ino80 ATPase-subenheten.
Figur 1. INO80 nucleosome ombygging aktivitet avhenger Ino80 HSA domene og / eller tilknyttede subenheter men er uavhengig av Ino80 NTD og metazoan spesifikke underenhetene. Nucleosome remodeling analysene ble utført med flagg immunopurified komplekser fra atom ekstrakter tilberedt fra cellelinjer som uttrykker FLAG -tagged versjoner av villtype eller mutant INO80 subenheter. Intakte INO80 komplekser ble renset fra cellelinjer som uttrykker FLAG-Ies2 eller FLAG-INO80E; INO80 subcomplexes ble renset fra cellelinjer som uttrykker FLAG-Ino80ΔN eller FLAG-Ino80ΔNΔHSA. En relativ konsentrasjon (rel. Kons.) Av 1 svarer til ~ 10 nM INO80 kompleks.
Figur 2. nucleosome binding av INO80 komplekset er uavhengig av Ino80 NTD og metazoan spesifikke subenheter. Nucleosome bindingsanalyser ble utført i nærvær av varierende mengder av den eller de angitte FLAG-immunopurified INO80 kompleks. Binding av INO80 eller INO80 subcomplexes å mononucleosomes resultater i fremveksten av slow-migrering "super-skiftet" band som tilsvarer mononucleosomes stabilt bundet av INO80 eller INO80 subcomplexes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 "src =" / filer / Ftp_upload / 51721 / 51721fig3highres.jpg "/>
Figur 3. DNA og nucleosome-avhengige ATPase-analyser. TLC (tynnsjiktskromatografi) -baserte ATPase analysene ble utført for å måle frekvensen av ATP hydrolyse av INO80 subcomplexes renset gjennom FLAG-Ino80ΔN (Ín) eller FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) i nærvær av mette mengder av DNA eller nucleosomes. Analyser ble utført ved hjelp av to forskjellige konsentrasjoner av hvert kompleks (5 nM og 10 nM) og for tre forskjellige reaksjonstider. Mengden av ATP hydrolysert (i pmol) i reaksjonene er angitt under hvert panel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 67.5 mL | H 2 O |
| 10 ul | 10x PCR reaksjon buffer (se Materialer List) | </ Tr>
| 1 mL | pGEM-3Z-601 (10 ng / mL) |
| 5 mL | forward primer (10 mikrometer) |
| 5 mL | revers primer (10 mikrometer) |
| 0,5 mL | dNTP stamløsning inneholdende 10 mM hver av de fire dNTPs |
| 1 mL | Taq DNA Polymerase (5 enheter / mL) |
| 10 ul | [Α- 32 P] dCTP (6000 Ci / mmol, 3,3 mm) |
Tabell 1. Reaksjon mix for PCR forsterkning av radiomerket '601' DNA fragment.
| 20 nM | INO80 eller INO80 subcomplexes |
| 2.8 nM | nucleosomes (som består av en blanding av mononucleosomes på 32 P-merkede 601-DNA-fragment og Hela celle nucleosomes) |
| 1 mm | ultra ATP |
| 20 mm | HEPES-NaOH (pH 7,9) |
| 50 mm | NaCl |
| 5 mm | MgCl2 |
| 1 mm | dithiothreitol (DTT) |
| 0,1 mM | phenylmethanesulfonyl (PMSF) |
| 0,1 mg / ml | bovint serumalbumin (BSA) |
| 5% | glyserol |
| 0,02% | Nonidet P-40 |
| 0,02% | Triton X-100 |
Tabell 2. Komponenter i ATP-avhengige nucleosome remodeling analyser.
| 32.6 ml | H 2 O |
| 5 ml | 40% akrylamid / bis (37.5: 1) |
| 2 ml | 10x TBE (900 mm Tris-borat, 20 mM EDTA) |
| Legg følgende ingredienser umiddelbart før helle gel: | |
| 0,4 ml | 10% ammoniumpersulfat |
| 0,1 ml | TEMED |
Tabell 3. Utarbeidelse av innfødte polyacrylamidgel for ATP-avhengige nucleosome remodeling analyser.
| 10 mm | HEPES pH 7.9 |
| 10% | glyserol |
| 100 mm | NaCl |
| 1.5 mm | MgCl2 |
| 0,05% | TritonX-100 |
| Legg like før bruk: | |
| 1 mm | DTT |
| 200 uM | PMSF |
| 1: 1000 fortynning | Proteasehemmer Cocktail (se Materialer List) |
Tabell 4. EB100 buffer.
| 3,9 mL | H 2 O |
| 1 mL | 10x Remodeling buffer (200 mM HEPES-NaOH (pH 7,9), 0,2% NP-40, 0,2% Triton X-100, 50% glycerol, 50 mM MgCl2, 1 mg / ml BSA) |
| 0,1 mL | 100 mM ATP |
| 0.01 mL | 1 M DTT |
| 0.01 mL | 100 mM PMSF |
| 0.25 mL | rekonstituert mononucleosome substrat fra trinn 1.2 |
Tabell 5. Komponenter av master cocktail for ATP-avhengige nucleosome remodeling analyser.
| 0.33 mL | 400 nM Hela nucleosomes |
| 0,75 mL | 100 nM lydbehandlet lakse sperm DNAS |
| 0.01 mL | 1 M DTT |
| 0.01 mL | 100 mM PMSF |
Tabell 6. Fjerne blanding cocktail.
| 2 mL | H 2 O |
| 0.25 mL | 20x ATPase-buffer inneholdende 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 132 mM MgCl 2, 16 mM EDTA, 0,3% Nonidet P-40, 50% glyserol, 2 mg / ml BSA |
| 0,1 mL | 100 uM ATP |
| 0.005 mL | 1 M DTT |
| 0.005 mL | 100 mM PMSF |
| 0,1 mL | [Α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å sikre at nucleosome ombygging og ATPase aktiviteter vi observerer i analyser avhenger av den katalytiske aktiviteten av INO80 komplekser, og ikke på forurensende ombygging og / eller ATPase enzymer, vi rutinemessig analyse nucleosome ombygging og ATPase aktiviteten katalytisk inaktive versjoner av INO80 komplekser, renset i parallelt med villtype INO80 med samme prosedyre. En negativ kontroll reaksjon mangler ATP bør også utføres ved å analysere nucleosome ombygging aktivitet for å teste for tilstedeværelse av kontaminerende ATP og / eller ATP-uavhengige remodeling aktiviteter, noe som kan komplisere tolkningen av eksperimenter som sammenligner aktivitetene til forskjellige preparater av INO80 kompleks eller subcomplexes. Katalytisk inaktive versjoner av INO80 eller INO80 subcomplexes skal fremvise ingen nucleosome ombygging eller ATPase aktiviteter. I tillegg, deteksjon av DNA eller nucleosome uavhengig ATPase-aktivitet indikerer tilstedeværelsen av forurensende ATPase (r) i den enzyme-fraksjon. Hvis aktivitet er fortsatt detektert i nærvær av katalytisk inaktive Ino80 eller om det er vesentlig DNA-eller nucleosome uavhengig ATPase-aktivitet selv etter å optimalisere rensing som beskrevet i 'Representative resultater,' komplekser kan bli ytterligere renset ved anvendelse av ytterligere trinn som ionebytte eller gelfiltrerings-kromatografi eller gradient sedimentering.
Ved måling nucleosome ombygging og ATPase aktiviteter, er det tilrådelig å utføre analyser for kortere eller lengre tid og med mer enn én konsentrasjon av INO80 eller INO80 subcomplexes å sikre målinger blir tatt når produktet-tid og dose-responskurver er lineære. Likeledes bør nucleosome bindingsanalysen utføres ved hjelp av en rekke konsentrasjoner av komplekset INO80 (e); ellers kan man ikke pålitelig sammenligne aktivitetene til ulike INO80 forberedelser.
Nucleosome skyve og bindingsanalyser bør alltid inneholde kontroll reaksjonersom omfatter mononucleosome substrat alene som en markør for å vise den elektroforetiske mobilitet av utgangs nucleosome populasjonen. På denne måten kan man lett identifisere endringer grunnet spesielt tilstedeværelsen av enzymfraksjonen. Slike kontrollreaksjoner vurdere også integriteten av de rekonstituerte mononucleosomes.
For å drive lett tolkes nucleosome skyve og bindende analyser, er det nyttig å generere homogene mononucleosomal underlag; av den grunn, at analysen beskrevet i denne protokollen bruker nucleosomes montert på et DNA-fragment inneholdende en sterk nucleosome posisjonering sekvens. Selv om INO80 komplekset har en tendens til å flytte seg sideveis plasserte nucleosomes til en mer sentral posisjon på et DNA-fragment, andre kromatin ombygging enzymer, slik som ISWI holdige NURF kompleks 9, beveger nucleosomes fra flere sentrale stillinger mot endene av DNA-fragmenter. Således, under karakterisering av en hvilken som helst kromatin ombygging noZyme er det nyttig å klar mononucleosome substrater hvori nucleosome posisjonering sekvensen er på ulike steder. Alternativt kan man anvende substrater som nucleosomes har vært samlet på DNA-fragmenter uten nucleosome posisjonering sekvens. I dette tilfellet vil utgangs nucleosome populasjonen omfatter en blanding av mer sentralt plasserte og lateralt nucleosomes.
ATP-avhengige nucleosome ombygging prosessen kan føre til ulike remodeling resultater, inklusive fullstendig nucleosome forskyvning fra DNA, nucleosome bevegelse på DNA, eller forbigående forandringer i nucleosome struktur som ikke kan føre til endringer i posisjonen til nucleosomes når reaksjonen oppnår likevekt men er likevel funksjonelt signifikant. Nucleosome skyve analysen beskrevet kan overvåke de to første reaksjoner, men kanskje ikke i stand til å oppdage forbigående endringer i nucleosome struktur. En analyse som kan påvise noe slikt transient altrasjoner tar fordel av det faktum at nucleosomal DNA på overflaten av den nucleosome octamer er hovedsakelig utilgjengelig for skjæring ved hjelp av et restriksjonsenzym, mens linker-DNA som er blitt forskjøvet fra octamer overflaten ved nucleosome skyve eller delvis avvikling av nucleosomal DNA er utsatt for skjæring 10,11,12. Et slikt assay kan også være spesielt nyttig i det tilfelle at nucleosome ombygging enzymet binder så tett til dens substratet at det ikke kan fjernes ved 13 konkurrent.
Vår nucleosome skyve og forpliktende analyser måle INO80 aktiviteter ved hjelp mononucleosomal underlag tilberedt med innfødte Hela celle histoner. Imidlertid kan remodeling aktivitetene INO80 eller andre kromatin remodeling enzymer i prinsippet bli påvirket av nærvær eller fravær av spesifikke posttranslasjonelle modifikasjoner eller varianter histon. I tillegg kan mononucleosomes stimulere INO80 komplekse aktiviteter annerledes enn di-nucleosomes,eller en rekke nucleosomes. Dermed kan måle INO80 komplekse virksomhet som bruker mer komplisert og mangfoldig nucleosomal underlaget gi innsikt i den mekanismen som INO80 kromatin remodeling komplekser er regulert.
Som et alternativ til bruken av radioaktivt merkede DNA-fragmenter i nucleosome ombygging og bindingsanalyser, enkelte forskere visual nucleosomes og / eller DNA ved farging nucleosomal DNA med etidiumbromid 14; imidlertid analyser utført ved bruk av ikke-radioaktive påvisningsmetoder kan være vesentlig mindre følsom enn den som er beskrevet i denne protokollen, typisk krever bruk av vesentlig mer enzym.
Overvåking av fremdriften av ATPase-reaksjon som en funksjon av tid ved bruk av 32 P-baserte analysen beskrevet her krever separate runder med prøvehåndtering og analyse ved hvert tidspunkt. Som en alternativ fremgangsmåte, kan ATPase-aktivitet kan måles ved å bruke fluorescens-baserte assays Prosedyrene vi beskrevet i denne Jove papir har blitt brukt for å karakterisere tre ulike biokjemiske egenskaper INO80 eller INO80 subcomplexes i ferd med ATP-avhengige nucleosome remodeling. Ved å bruke forskjellige INO80 subcomplexes eller INO80 mutanter i disse analysene, er det mulig å dissekere de funksjonelle bidragene fra forskjellige INO80 underenheter og / eller domenestrukturer til INO80 nucleosome ombygging aktivitet og for å definere trinn (e) i remodelle reaksjonen ved hvilken INO80 subenheter og / eller domener kan være viktig. Disse prosedyrene kan tilpasses for studiet av andre nucleosome ombygging og bindende enzymer og ATPases wed både DNA og nucleosome-avhengige eller uavhengige aktiviteter. Vi merker oss at ulike kromatin remodeling enzymer kan ha høyere eller lavere iboende ATPase eller nucleosome remodeling aktiviteter enn den menneskelige INO80 kompleks. Derfor, når man tilpasser disse protokollene for analyse av andre kromatin ombygging enzymer, bør man variere konsentrasjonen av enzym, ATP, DNA eller nucleosomes, og reaksjonstider og / eller temperaturer for å optimalisere de analyser for de spesielle enzymer som studeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
- Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
- Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
- Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
- Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
- Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
- Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
- Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).
