Summary
Denne artikel vil fokusere på udvikling af polymer overflader for langsigtet, stabil kultur stamceller afledt humane hepatocytter.
Introduction
Biologiske materialer er ofte blevet brugt i vedligeholdelse og differentiering af pluripotente stamceller 1. Samtidig med at disse biologiske substrater ofte indeholder et utal af udefinerede komponenter. Matrigel er en almindeligt anvendt substrat for stamcelle kultur og differentiering. Desværre, dets varierende sammensætning påvirker celle funktion og fænotype. Selv om en bred vifte af alternative, mere definerede biologiske matricer er blevet brugt 2-7, deres animalsk oprindelse eller dårlig skalerbarhed gør dem uegnede kandidater til industriel fremstilling. Derfor identifikation af syntetiske alternativer, med defineret sammensætning og pålidelige resultater, er centrale mål i stamcelleforskning.
I et forsøg på at overvinde de begrænsninger af udefinerede celledyrkningssubstrater har tværgående samarbejder mellem kemi og biologi identificeret syntetiske materialer med kapacitet til at støtte cellefænotype. SynthETIC substrater er skalerbar, omkostningseffektiv, og kan fremstilles i komplekse 3D strukturer, efterligne in vivo miljø. På grund af disse egenskaber syntetiske substrater er ofte blevet brugt til at understøtte og drive differentiering af mange celletyper 8-10.
Avancerede og analyser med høj kapacitet har lettet hurtig screening af syntetiske materialer, fra store biblioteker, og leveres nye materialer med fleksible egenskaber med brede applikationer inden for biomedicinsk forskning og udvikling 11-13. Ved hjælp af high throughput, polymer microarray screening teknologi, vi hurtigt kan identificere en simpel polyurethan (PU134), velegnet til vedligeholdelse af humane stamceller afledt hepatocytter. Denne polymer viste sig at være overlegen i forhold til animalsk afledte substrater med hensyn til hepatocyt differentiering og funktion 14-16. Vi har efterfølgende optimeret belægning, topografi og sterilisering proces at få adgang til effekteron polymer ydeevne stabilisere hepatocyt funktion og levetid. Dette har betydelige konsekvenser med hensyn til forståelsen af grundlaget for hepatocyt biologi til cellebaserede modellering og regenerativ medicin applikationer.
Teknologien er beskrevet her, er et eksempel på, hvordan overfladen af en syntetisk polymer, kan optimeres for at bevare cellens fænotype. Vi mener, at kombinationen af denne teknologi med en effektiv serum fri hepatocyt differentiering protokol har potentialet til at levere en skalerbar produktion af hepatocytter til brug som in vitro-modellering og regenerativ medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese af PHNGAD (poly [1,6-hexanodiol / neopentylglycol / di (ethylenglycol) -alt-adipinsyre] diol)
Skema 1: Syntese af PHNAGD Skematisk repræsentation af syntesen af PHNAGD.. PHNAGD blev fremstillet ved omsætning af 1,6-Hexanodiol, diethylenglycol, neoppentyl glykol og adipinsyre. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentylglycol / di (ethylenglycol) -alt-adipinsyre] diol.
- Anvend varmebehandling monomererne 1,6-hexandiol, di (ethylenglycol) og neopentylglycol ved 40 ° C i 48 timer i en vakuumovn for at fjerne eventuelt resterende vand. Lad koldt ned til stuetemperatur under vakuum.
- Tilføj 22 mmol af hver monomer og adipinsyre (55 mmol) til en to-halset rundbundet kolbe udstyret med en omrørt bar og forbundet til en Dean-Stark-apparat.
- Anbring hele samlingen under et vakuum og opvarmes forsigtigt glassware ved 40 ° C i 6 timer, for at undgå enhver fugtabsorption under tilsætningen af kemikaliet ind i kolben.
- Tilføj via sprøjte, dråbe for dråbe, 0,0055 mol af katalysatoren titan (IV) butoxid.
- Reaktionsblandingen omrøres ved 180 ° C under en N2-atmosfære i 24 timer, og indsamle resterende vand i Dean Stark-fælde. Lad produktet køle af til stuetemperatur.
2. Syntese af PU134
Skema 2: Syntese af PU134 Skematisk repræsentation af syntesen af polyurethan 134. PU134 blev fremstillet ved omsætning af 1,0 ækvivalenter af en PHNGAD med 2,0 ækvivalenter af en 4,4-methylen-bis (phenylisocyanat), efterfulgt af tilsætning af 1,0. ækvivalenter af en 1,4-butandiol kædeforlænger.
- Bland en ækvivalent af polyolen PHNGAD (Mn ~ 1.800 Da, 3,2 mmol) med to ækvivalenter af 4»4-methylenbis (phenylisocyanat) (6,4 mmol) i vandfrit N, N-dimethylformamid (12 ml).
- Omrør reaktionsblandingen ved 70 ° C under en N2-atmosfære.
- Tilføj via sprøjte, dråbe for dråbe katalysator titan (IV) butoxid (0,8% vægt).
- Efter 1 time tilsættes en ækvivalent kædeforlænger 1,4-butandiol (3,2 mmol). Forøg temperaturen ved 90 ° C og omrøres i 24 timer under en N2-atmosfære.
- Efter reaktionen indsamle polyurethan ved udfældning ved tilsætning af diethylether (hexan eller vand kan også anvendes) dråbevist til reaktionsopløsningen, indtil udfældning sker.
- Centrifugeres opløsningen ved 5.300 xg i 5 minutter.
- Supernatanten dekanteres fra og tør ved 40 ° C i en vakuumovn indtil opløsningsmidlet fordamper.
Bemærk: For at sikre, at det endelige produkt af reaktionen i besiddelse af de korrekte parametre vedrørende den molekylære vægtfordeling, den funktionelle grupps af polymer og smeltepunkter og glasovergangstemperaturer, kan forskellige analytiske teknikker og metoder, der anvendes, såsom gelpermeationskromatografi eller Fitr spektroskopi.
3. Fremstilling af PU134 Løsninger
- 200 mg PU134 afvejes i en glasflaske.
- Fortynd PU134 til en endelig koncentration på 2% i en række opløsningsmidler chloroform, en blanding af chloroform og toluen i forholdet 1: 1, tetrahydrofuran og kombinationen af tetrahydrofuran og dichlormethan i forholdet 1: 1.
Bemærk: Valget af den rigtige opløsningsmiddel varierer afhængigt af polymeren at bruge. Forskellige opløsningsmidler har forskellige kogepunkter, der kan påvirke opløsningen af polymeren. - Ryst opløsningen kraftigt i 20 minutter ved stuetemperatur under anvendelse af et rysteapparat ved en hastighed på 200 mot / min, indtil opløsningen bliver homogen, og der observeres ingen udfældning.
4. Belægning af glas Slides med PU134
- Placer en Round 15 mm2 dækglas på spin-coater.
- Anvend 50 ul af PU134 opløsning til hver ved hjælp af en pipette. Juster lydstyrken på PU134 løsning derfor til den krævede dækglas størrelse holde volumen til overfladen forholdet proportionalt.
- Spin hvert dækglas i 7 sekunder ved 23 x g.
- Luft tør dækglas ved stuetemperatur i mindst 24 timer før sterilisering.
5. Bestråling af Dækglas
- Gamma-bestråle polymercoatede dækglas ved anvendelse af en dosis på 10 Grays på et laboratorie strålerøret i 12 min.
- UV bestråle polymercoatede dækglas under anvendelse af en 30 W UV-pære til 16 min hver side.
- Placer polymercoatede dækglasset i et egnet vævskulturplade ifølge diasstørrelse.
6. Scanning Electron Microscopy
- Guld frakke polymer dækglas ved forstøvning til 200 sekunder i en atmosfære af 5 x 10 -1 millibar pres.
- Fang mikrogramIGURER af polymercoatede dækglasset ved hjælp af en scanning elektron mikroskop ved en accelererende spænding på 20 kV i sekundær elektron billedbehandlingstype.
7. Atomarkraftmikroskopi Observationer
- Scan et område på 20 x 20 um af polymeroverfladen.
- Opsæt en scanning sats fra 1,32 Hz til 1,60 Hz.
- Opsæt en opløsning på 512 x 512 pixels i det scannede område.
- Beregn geometriske middelværdi (RMS eller Rq) af belægningen ved hjælp af gennemsnittet af højden afvigelser taget fra den gennemsnitlige billeddata fly, udtrykkes som:
Hvor Zi er den aktuelle Z-værdi, og N er antallet af punkter i givet område. - 7.5 Beregn afvigelsen eller betyde overfladeruhed (Ra) på billedet ved hjælp af,
Hvor Z (x) er den funktion, der beskriver than ruhedsprofil analyseret med hensyn til højde (Z) og position (x) af stikprøven over evalueringen længden "L". Ra betegner middelværdien af overfladen i forhold til midterplanet.
8. Celledyrkning og Differentiering
- Kultur og differentiere humane embryonale stamceller linje (embryonale) H9 som beskrevet i Hay 17.
- Frigør celler ved hjælp af en dissociation reagens og replate dem på PU134 coatede objektglas på dag 9 i differentieringsprocessen, i nærværelse af en serum-frit medium som beskriver i Szkolnicka 18,19.
Bemærk: Brugen af en enzymatisk celledissociering foretrækkes til fysisk celle løsrivelse.
9. cytokrom P450 funktionelt assay
- Mål CYP3A-aktivitet, ved at følge producentens instruktioner.
- Inkuber hESC afledt hepatocytter på dag 13 eller dag 19, og medier uden celler - som en negativ kontrol, med passende substrspiste i 5 timer ved 37 ° C.
- Saml supernatanter fra celler og medier udføre assayet ifølge producentens anvisninger.
- Måle niveauet af CYP-aktivitet og normaliseret i forhold til overfladeareal (cm2).
10. Immunfarvning
- Vask embryonale afledte hepatocytter med PBS, i 1 min, gentages to gange.
- Tilføj iskold 100% methanol for at løse celler, sted i -20 ° C i 10 min.
- Vask cellerne med PBS i 5 minutter og gentag to gange.
- Cellerne inkuberes med PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA i 1 time ved stuetemperatur.
- Aspirer PBST, og der tilsættes den passende primære antistof fortyndet i PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, inkuberes ved 4 ° C med forsigtig omrøring O / N-.
- Vask cellerne med PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA i 5 minutter og gentage tre gange.
- Fortynd den passende antistof i PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, tilsættes til cellerne og inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 1 time med forsigtig omrøring.
- Vask cellerne med PBS i 5 minutter og gentage tre gange.
- Tilføj MOWIOL 488 (indeholdende DAPI 1: 1.000) til hver brønd, tilføje et dækglas forsigtigt for at reducere antallet af luftbobler. Opbevares fikserede celler ved 4 ° C i mørke. Overhold farvning hjælp af et mikroskop med et passende filter og lysstofrør. De optimerede primære og sekundære antistoffer er anført i tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polymer opløsningsmiddel påvirker topografien af polymeren overflade
Polyurethan 134 blev solubiliseret i chloroform, enten alene eller i kombination med toluen eller tetrahydrofuran eller dichlormethan, og de objektglas spin-belagt med de forskellige formuleringer. Scanning elektronmikroskopi (SEM) og atomic force mikroskopi (AFM) blev anvendt til at karakterisere de fysiske egenskaber af de polymere overtræk (figur 1). Belægningen opnås ved anvendelse af toluen eller chloroform ikke var homogen, hvilket viser en ujævn belægning med PU134 udfældning (figur 1A). I modsætning hertil, tetrahydrofuran var et egnet opløsningsmiddel giver spin coating af en langt mere ensartet overflade (figur 1A). Overfladetopografi blev målt ved AFM hjælp af geometriske middelværdi (RMS) og den gennemsnitlige ruhed (Ra). PU134 opløst tetrahydrofuran udviste en 40% reduktion i ruhed i forhold til the andre opløsningsmidler (figur 1b og 1c). Disse data viser, at anvendelse af tetrahydrofuran som et opløsningsmiddel giver en mere ensartet belægning af PU134 til biologisk anvendelse.
Polymer topografi har en betydelig indvirkning på hepatocyt funktion
embryonale effektivt kan differentieres til hepatisk endoderm in vitro, udviser mange af de funktioner, der findes i den voksne leveren 17-20. Nedsat endoderm differentiering blev induceret og på dag 9 hepatoblast-lignende celler var synlige, med størstedelen af celler, der udtrykker cytokeratin 19 (99% ± 1,2), α-føtoprotein (99% ± 0,6) og hepatisk kernefaktor 4α (97% ± 2,6); og lave niveauer af albumin (20% ± 1,7) (figur 2). På dette tidspunkt blev cellerne løsrevet hjælp TrypLE udtrykke og genudpladet på de forskellige polymere overflader. Som et mål for metaboliske funktion, cytochrom P450 fsalvelse blev vurderet 4 dage efter genudpladning. Vi observerede en 2-fold stigning i metabolisk aktivitet i celler genudplades på tetrahydrofuran / PU134 coatede overflader (figur 3). Disse resultater viser, at embryonale afledt hepatocyt metaboliske aktivitet er forbedret med en mere ensartet belægning af PU134, dette er i overensstemmelse med tidligere tilgange 21.
Overfladesterilisation indvirkninger på de bioaktive egenskaber af polymeren
Effekten af sterilisation på PU134 resultater blev også undersøgt. Polymer coatede objektglas blev eksponeret for UV-eller gamma-bestråling. Fase kontrast imaging af PU134 coatede objektglas viste ingen grove forskelle sende UV eller gammastråling (figur 4A). Disse observationer blev yderligere bekræftet ved SEM-analyse (figur 4B). Den biologiske ydeevne PU134 blev undersøgt ved hjælp af embryonale afledte hepatocytter 10 dage efter genudpladning. hESC afledthepatocytter genudplades på γ-udstrålet PU134 coatede objektglas viste en 3-dobling i CYP3A aktivitet i celler genudplades på UV-udstrålet PU134 coatede objektglas (figur 4C). Disse observationer viste, at y-bestråling var den optimale steriliseringsteknik til vores formål.
Figur 1. Optimering af polyurethan 134 overflade. (A) objektglas blev overtrukket med en 2% opløsning af PU134 opløst i forskellige opløsningsmidler. Scanning Electron Microscopy (SEM) billeder af de forskellige coatede objektglas viser tilstedeværelsen af en homogen belagte overflade og fraværet af polymer udfældes, når tetrahydrofuran blev anvendt i sammenligning med toluen, chloroform eller blandinger af opløsningsmidler (sorte og hvide pile). Billederne blev taget på x1664 forstørrelse og skalaer barer ar e vist nedenfor billederne. (BC) Atomic force mikroskopi (AFM) blev anvendt til at analysere ruhed PU134 coatede overflader på udvalgte opløsningsmidler. Analyse af ruhed parametre RMS (root mean square) (B), og Ra (gennemsnitlig ruhed) (C) af de forskellige PU134 overflader viser, at belægningen er fremstillet ved anvendelse af tetrahydrofuran som et opløsningsmiddel, havde den glatteste overflade sammenlignet med resten af betingelserne (n = 7). Data er udtrykt som middelværdi ± SD er p <0,05 betegnet *, p <0,01 er betegnet ** og p <0,001 betegnes *** målt ved studerende t-test i forhold til objektglas overtrukket med PU134 solubiliseres i tetrahydrofuran. Fejl søjler repræsenterer 1 standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Karakterisering af de embryonale afledte hepatoblasts. Immuncytokemi viser ekspression af hepatiske markører AFP, CK19, HNF4α og albumin i embryonale (H9) afledt nedsat endoderm. Negative kontroller blev udført med tilsvarende immunoglobulin G (IgG) og repræsentative billeder skal vises. Procentdelen af positive celler og standardafvigelse blev estimeret fra mindst fem tilfældige synsfelter, der indeholder mindst 300 celler pr visning. Billederne blev taget ved 20x forstørrelse. Data udtrykt som gennemsnit ± SD Fejl søjler repræsenterer 1 standardafvigelse. HNF4α, Hepatocyt nuklear faktor 4α; AFP, α-føtoprotein; ALB, Albumin; CK19, Cytokeratin 19 IgG ged, immunoglobulin G anti-ged IgG mus, immunoglobulin G anti-mus. Klik her for at se et større vepå denne figur.
Figur 3. Funktionelle konsekvenser af topografi PU134 overflade på funktionen af embryonale afledte hepatocytter. Måling af cytochrom P450 3A aktivitet på hESC-afledte hepatocytter opretholdt i 96 timer på objektglas belagt med PU134 opløst i forskellige opløsningsmidler. En forbedring af den i cytochrom aktivitet på celler opretholdt på PU134 coatede objektglas solubiliseres med tetrahydrofuran (n = 6). Data er udtrykt som middelværdi ± SD, p <0,05 er betegnet *, p <0,01 er betegnet ** og p <0,001 betegnes *** målt ved studerende t-test i forhold til embryonale afledte hepatocytter opretholdt på objektglas overtrukket med PU134 solubiliseres på tetrahydrofuran. Fejl søjler repræsenterer 1 standardafvigelse.
Figur 4. Optimering af sterilisering af de coatede overflader. Fasekontrast billeder (A) eller SEM billeder (B) viser ingen grove forskelle i PU134 overflade mellem γ-stråling eller UV-stråling (UV) behandlinger. Fasekontrast billeder blev taget ved 40X forstørrelse og SEM billeder på 1,664X forstørrelse. (C) Analyse af cytochrom P450 3A aktivitet på hESC afledt hepatocytter opretholdt i 10 dage på PU134 coatede objektglas. En stigning i cytochrom P450 3A-aktivitet i cellerne genudpladet på γ-udstrålet PU134 coatede objektglas sammenlignet med celler genudpladet UV udstrålede PU134 coatede objektglas. Enheder er udtrykt som relative lysenheder (RLU) ml -1 cm -2 kultur overflade (n = 3). Data er udtrykt som middelværdi ± SD, p <0,001 is betegnet *** målt ved studerende t-test i forhold til embryonale afledte hepatocytter vedligeholdes på PU134 belagt dækglas steriliseret ved γ-stråling. Fejl søjler repræsenterer 1 standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Primære antistoffer | |||
| Antigen | Type | Virksomhed | Fortynding |
| HNF4α | Kanin polyklonale | Santa Cruz | 1/100 |
| Albumin | Mus monoklonale | Sigma | 1/500 |
| AFP | Mus monoklonale | Abcam | 1/500 |
| Cytokeratin 19 | Mus monoklonale | Dako | 1/50 |
| IgG | Mus monoklonale | Dako | 1/500 |
| Sekundære antistoffer | |||
| Anti-kanin 568 Alexa Flour | Goat | Invitrogen | 1/400 |
| Anti-mus 488 Alexa Flour | Kanin | Invitrogen | 1/500 |
Tabel 1. Liste af optimerede primære og sekundære antistoffer og koncentrationer, der anvendes i denne undersøgelse. HNF4α, Hepatocyt nuklear faktor 4α; AFP, α-føtoprotein; IgG immunoglobulin G.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange af de nuværende metoder, der anvendes til at frembringe hepatocytter fra stamceller afhængige udefinerede matrixer af animalsk oprindelse. Disse substrater kan være dyrt og meget varierende, der påvirker celle funktion og stabilitet, hvilket er en væsentlig hindring for ansøgningen. Derfor udførte vi en skærm til syntetiske materialer, der støtter kulturen i stamceller afledt hepatocytter. Vi har identificeret en simpel polyurethan (PU134), der dannes ved at polymerisere PHNGAD, MDI og et strækkemiddel, der i kombination med en robust hepatocyt differentiering tilgang stabiliserer hepatocyt fænotype og forbedrer cellefunktion i sammenligning med matrigel 15.
Håndtering af eksisterende biologiske matricer, der almindeligvis anvendes i dyrkning og differentierende stamceller såsom vitronectin 22, laminin 521 23 eller matrigel, er effektiv på kort sigt vedligeholdelse. I modsætning hertil PU134 coatede overflader giver en overlegen substrat for hepatocyte kultur. Desuden har optimering af overflade topografi og polymer sterilisering førte til yderligere forbedringer i celle ydeevne, en nøglefaktor i at levere human lever modeller på skalaen med pålidelig ydeevne.
Arten af kædeforlænger og phenylisocyanat repræsenterer en af de kritiske faser i processen; som fjernelse eller udskiftning af hver komponent vil i væsentlig grad forringe polymeroverfladen og derfor cellulære udlæg og funktionelle aktivitet af stamceller afledt hepatocytter. Sammensætningen af polymeren påvirker fysiske parametre såsom elasticitet og befugtelighed 24, som har konsekvenser kapacitet polymeren at absorbere vigtige ekstracellulære matrix proteiner involveret i hepatocyt funktion. Desuden variationer i katalysatoren, reaktionstid og temperatur påvirker molekylvægtsfordeling af polymeren.
Udvælgelsen af opløsningsmidlet at opløse polymeren repræsenterer en anden kritisk punkt i forbindelse med opnåelse af en optimeret polymer overflade. Vi har observeret, at beskaffenheden af opløsningsmidlet påvirker topografien af den belagte overflade, som har direkte indflydelse på funktionen af de celler 25-31. Hertil kommer, at spinding tid og hastighed er også afgørende at opnå denne ensartet og homogen belægning. Et andet skridt at tage i betragtning, er den sterilisation procedure anvendes på polymercoatede overflade, da aktiviteten af cellerne kan påvirkes af steriliseringsbehandlingen anvendes. Dette kan være på grund af tilstedeværelsen af følsomme område (r) inden for strukturen af polymeren til forskellige steriliseringsprocedurer 32-34.
Aktuelle pluripotente stamceller baseret cellemodeller besidder fænotypiske og funktionelle begrænsninger. Vi mener, at dette er optimeret polymer overflade er et fremskridt på området, omgår nogle af de begrænsninger, der er forbundet med brugen af biologiske substsatser. Desuden er der mulighed for at anvende polymeren inden 3D matricer støtte fastgørelsen af forskellige cellulære typer fundet i vævet af interesse, kan yderligere forbedre celle fidelity.
Konklusionen er, at brugen af syntetiske materialer bliver stadig vigtigere i leveringen af menneskelig soma fra pluripotente stamceller. Vi har udviklet en optimeret overflade og belægning procedure, der er robust og pålideligt leverer funktionelle humane hepatocytter med betydelige konsekvenser for cellebaserede modellering og regenerativ medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DCH er CSO, direktør, grundlægger og aktionær i FibromEd Products Ltd MB og JPI er stiftende aktionærer i FibromEd Products Ltd
Acknowledgments
DCH, MB og FK blev støttet af et EPSRC Følg på fonden. BL-V og DS blev understøttet af hver MRC ph.d.-stipendier. KC blev støttet af midler fra britiske regenerativ medicin Platform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips | |||
| Shaker | Edmun Bühler | KS-15 | |
| Irradiator | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| Spin coater | Specialty Coating System | P-6708 | |
| Scanning Electron Microscope | Philips | XL30CPSEM | |
| Atomic Force Microscope | DimensionV Nanoscope, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| UV bulb | ESCO | ||
| NanoScope analysis software | VEECO | version 1.20 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | TH45200 | Use Volocity 4 Software |
| Tissue culture plates | Corning, UK | 3527 | |
| glass slides | Scientific Laboratory Supplies | MIC3308 | |
| Diethylene glycol | Sigma–Aldrich | 93171 | |
| 1,6-hexanediol | Sigma–Aldrich | 240117 | |
| Neopentyl glycol | Sigma–Aldrich | 408255 | |
| Adipic acid | Sigma–Aldrich | 9582 | |
| anhydrous N,N-Dimethylformamide | Sigma–Aldrich | 227056 | |
| Diethyl ether | Sigma–Aldrich | 676845 | |
| titanium (IV) butoxide | Sigma–Aldrich | 244112 | |
| 1,4-butanediol | Sigma–Aldrich | 493732 | |
| Vacuum oven | Thermoscientific | ||
| 4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) | Sigma–Aldrich | 101688 | |
| Tetrahydrofurane | Sigma–Aldrich | 401757 | |
| Sputter coater | Bal-Tec SCD 050 | ||
| Inmunostaining | |||
| Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) | Gibco | 10010031 | Store at room temperature |
| PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 | Scientific Laboratory Supplies Ltd | EC607 | |
| Methanol | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, UK | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions |
| Cell culture and Functional assay | |||
| CYP3A activity pGLO kit | Promega | V8902 | |
| Hepatozyme | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 | |
References
- Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).
- Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).
- Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).
- Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26 (19), 4171-4179 (2005).
- Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50 (7), 645-652 (2006).
- Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (1), 13-22 (2013).
- Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3 (3), 034112 (2008).
- Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32 (12), 3220-3232 (2011).
- Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30 (6), 1045-1055 (2009).
- Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31 (8), 2216-2228 (2010).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4 (1335), (2013).
- Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).
- Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).
- Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1 (1), 50-53 (2012).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (34), 12301-12306 (2008).
- Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
- Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).
- Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33 (1-2), 15-30 (1998).
- Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5 (3195), (2014).
- Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25 (1), 336-370 (2003).
- Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
- Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116 (10), 1881-1892 (2003).
- Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231 (1), 28-37 (2008).
- Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5 (4), 273-280 (2006).
- Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28 (1), 1806-1819 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19 (19), 2775-2779 (2007).
- Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23 (3), 305-311 (2013).
- Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).
- Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).
