Summary
Dieser Artikel wird auf die Entwicklung von Polymer-beschichteten Oberflächen für die langfristige Ausrichtung, stabile Kultur der Stammzell abgeleitet humanen Hepatozyten.
Introduction
Biologische Materialien sind weit verbreitet bei der Aufrechterhaltung und Differenzierung von pluripotenten Stammzellen 1 verwendet. Und ermöglichen, enthalten diese biologischen Substraten oft eine Vielzahl von unbestimmten Komponenten. Matrigel ist eine häufig verwendete Substrat für die Stammzellkultur und Differenzierung. Leider beeinflusst die variable Zusammensetzung der Zellfunktion und Phänotyp. Obwohl eine Vielzahl von alternativen, definierten biologischen Matrices wurden verwendet, 2-7, ihre tierischen Ursprungs oder schlechte Skalierbarkeit macht sie ungeeignete Kandidaten für die industrielle Fertigung. Daher ist die Identifizierung von synthetischen Alternativen, mit definierter Zusammensetzung und zuverlässige Leistung, sind wichtige Ziele in der Stammzellforschung.
In einem Versuch, die Grenzen der undefinierten Zellkultursubstraten zu überwinden, sind interdisziplinäre Kooperationen zwischen Chemie und Biologie synthetischen Materialien mit der Fähigkeit, Zell-Phänotyp unterstützt identifiziert. SynthWDV-Substrate sind skalierbar, kostengünstig und kann in komplexe 3D-Strukturen hergestellt werden, imitiert die in vivo-Umgebung. Aufgrund dieser Eigenschaften synthetischen Substraten sind weit verbreitet zu unterstützen und zu fahren Differenzierung vieler Zelltypen 8-10.
Erweiterte und Hochdurchsatz-Assays haben die schnelle Screening von synthetischen Materialien erleichtert, von großen Bibliotheken, und lieferte neuartige Materialien mit flexiblen Eigenschaften mit breiten Anwendungen in der biomedizinischen Forschung und Entwicklung 11-13. Verwendung von Hochdurchsatz-, Polymer-Mikroarray-Screening-Technologie, haben wir schnell eine einfache Polyurethan (PU134), geeignet für die Instandhaltung von menschlichen Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten identifiziert. Dieses Polymer wurde zu überlegen Tieren stamm Substrate hinsichtlich Hepatozyten-Differenzierung und-Funktion 14-16 sein. Wir haben anschließend die Beschichtungsbedingungen, Topographie und Sterilisationsverfahren, Effekte zugreifen optimiertauf Polymer Leistung bei der Stabilisierung Hepatozyten Funktion und Lebensdauer. Dies hat erhebliche Auswirkungen in Bezug auf das Verständnis der Biologie Grundlagen der Hepatozyten für Zell-basierte Modellierung und Anwendungen der regenerativen Medizin.
Die hier beschriebene Technologie ist ein Beispiel, wie die Oberfläche eines synthetischen Polymers kann optimiert werden, um Zell-Phänotyp zu bewahren. Wir glauben, dass die Kombination dieser Technologie mit einer effizienten serumfreien Hepatozyten Differenzierungsprotokoll hat das Potenzial, eine skalierbare Herstellung von Hepatozyten zur Verwendung in in vitro-Modellierung und regenerative Medizin bereitzustellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese von PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / Neopentylglykol / Di (ethylenglykol)--alt Adipinsäure] diol)
Schema 1: Synthese von PHNAGD Schematische Darstellung der Synthese von PHNAGD.. PHNAGD wurde durch Umsetzung von 1,6-Hexanodiol, Diethylenglykol, neoppentyl Glykol und Adipinsäure hergestellt. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / Neopentylglykol / Di (ethylenglykol)--alt Adipinsäure] diol.
- Anwenden der Wärmebehandlung auf die Monomeren, 1,6-Hexandiol, Di (ethylenglykol) und Neopentylglycol bei 40 ° C für 48 Stunden in einem Vakuumofen, um restliches Wasser zu entfernen. Lassen Sie die Kälte auf RT unter Vakuum.
- Hinzufügen 22 mmol eines jeden Monomers und Adipinsäure (55 mMol) in einen Zweihalsrundkolben, der mit einem Rühren, ausgestattet und mit einer Dean-Stark-Apparatur angeschlossen.
- Legen Sie die gesamte Baugruppe im Vakuum und sanft erhitzen glassware bei 40 ° C für 6 Stunden, um jegliche Feuchtigkeitsaufnahme während der Zugabe der Chemikalien in den Kolben zu verhindern.
- Fügen über eine Spritze, Tropfen für Tropfen, 0,0055 mol des Katalysators Titan (IV) butylat.
- Das Reaktionsgemisch wird bei 180 ° C unter einer N 2 Atmosphäre für 24 Stunden, zu sammeln und das restliche Wasser in einer Dean-Stark-Falle. Lassen Sie das Produkt auf RT abkühlen.
2. Synthese von PU134
Schema 2: Synthese von PU134 Schematische Darstellung der Synthese von Polyurethan 134 PU134 wurde durch die Umsetzung von 1,0 Äquivalenten eines PHNGAD mit 2,0 Äquivalenten eines 4,4 '-Methylenbis (phenylisocyanat) hergestellt, gefolgt von der Zugabe von 1,0. equiv eines 1,4-Butandiol Kettenverlängerungs.
- Mischen ein Äquivalent der Polyol PHNGAD (Mn ~ 1.800 Da, 3.2 mmol) mit zwei Äquivalenten 4"4-Methylenbis (phenylisocyanat) (6,4 mmol) in wasserfreiem N, N-Dimethylformamid (12 ml).
- Rühre das Reaktionsgemisch bei 70 ° C unter einer N 2 Atmosphäre.
- Fügen über eine Spritze, Tropfen für Tropfen den Katalysator Titan (IV) butylat (0,8% wt).
- Nach 1 Stunde, Hinzufügen eines Äquivalents des Kettenverlängerers 1,4-Butandiol (3,2 mmol). Erhöhung der Temperatur auf 90 ° C und rührt 24 h unter einer N 2 Atmosphäre.
- Nach der Reaktion sammeln das Polyurethan durch Ausfällung durch Zugabe von Diethylether (Hexan oder Wasser kann auch verwendet werden) tropfenweise zu der Reaktionslösung, bis der Niederschlag auftritt.
- Zentrifugieren der Lösung bei 5.300 × g für 5 min.
- Dekantiert und trocknet bei 40 ° C in einem Vakuumofen, bis das Lösungsmittel verdampft.
Hinweis: Um sicherzustellen, daß das Endprodukt der Reaktion besitzt die richtigen Parameter für den Molekulargewichtsverteilung, die funktionelle groups des Polymers und der Schmelz und Glasübergangstemperaturen können verschiedene analytische Techniken und Verfahren verwendet werden, wie Gelpermeationschromatographie oder FITR Spektroskopie.
3. Vorbereitung der PU134 Lösungen
- Wiegen 200 mg PU134 in eine Glasflasche.
- Verdünnen PU134 bis zu einer Endkonzentration von 2% in einer Reihe von Lösemittel: Chloroform, eine Kombination von Chloroform und Toluol im Verhältnis 1: 1, Tetrahydrofuran und einer Kombination aus Tetrahydrofuran und Dichlormethan im Verhältnis 1: 1.
Hinweis: Die Wahl der richtigen Lösungsmittel variiert in Abhängigkeit von dem Polymer zu verwenden. Unterschiedlichen Lösungsmitteln unterschiedliche Siedepunkte besitzen, die die Solubilisierung des Polymers beeinflussen kann. - Schütteln der Lösung kräftig für 20 min bei RT mit einer Schüttelmaschine bei einer Geschwindigkeit von 200 mot / min, bis die Lösung homogen wird und kein Niederschlag beobachtet.
4. Beschichtung von Glasobjektträger mit PU134
- Legen Sie eine round 15 mm 2 Deckglas auf dem Spin Coater.
- Bewerben 50 ul der PU134-Lösung in jede mit einer Pipette. Stellen Sie die Lautstärke der PU134 Lösung entsprechend für die erforderliche Deck Größe halten die Volumen zu Oberfläche Verhältnis proportional.
- Drehen Sie jedes Deckglas für 7 sec bei 23 x g.
- Luft trocknen Deckglas bei RT für mindestens 24 Stunden vor der Sterilisation.
5. Die Bestrahlung von Coverslip
- Gamma-Bestrahlung mit Polymer beschichteten Deckglas durch Anlegen einer Dosis von 10 Graustufen mit einer Labor-Strahler für 12 min.
- UV-Bestrahlung mit Polymer beschichtete Deckglas mit einer 30 W, UV-Lampe für 16 min auf jeder Seite.
- Platzieren des mit Polymer beschichteten Deckglas in einem geeigneten Gewebekulturplatte nach dem Foliengröße.
6. Rasterelektronenmikroskopie
- Goldbeschichtungspolymer Deck durch Sputtern für 200 s in einer Atmosphäre von 5 x 10 -1 mbar Druck.
- Capture the Mikrogrammraphs des mit Polymer beschichteten Deckglas mit einem Rasterelektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV in der Sekundärelektronenabbildungsmodus.
7. Atomic Force Microscopy Beobachtungen
- Abtasten einer Fläche von 20 x 20 um für die Polymeroberfläche.
- Eine Scan-Rate von 1,32 Hz bis 1,60 Hz.
- Einrichtung einer Auflösung von 512 x 512 Pixel in der abgetasteten Bereich.
- Berechnen Sie das quadratische Mittel (RMS oder RQ) der Beschichtung durch Verwendung der durchschnittlichen Höhe der Abweichungen vom Mittelwert Bilddaten Ebene genommen, ausgedrückt als:
Wobei Zi die aktuelle Z-Wert ist, und N die Anzahl von Punkten innerhalb des bestimmten Gebiets. - 7.5 Berechnen Sie die Abweichung oder mittlere Oberflächenrauigkeit (Ra) des Bildes mit,
Wobei Z (x) ist die Funktion, t beschreibter Oberflächenprofil in der Höhe (Z) und Position (x) der Probe über die Bewertungslänge "L" analysiert. Ra stellt den Mittelwert der Oberfläche relativ zu der Mittelebene.
8. Zellkultur und Differenzierung
- Kultur und differenzieren die humane embryonale Stammzelllinie (hES) H9 als in Hay 17 beschrieben.
- Lösen Zellen unter Verwendung eines Reagens Dissoziation und Ausstrich sie auf PU134 beschichtete Objektträger an Tag 9 des Differenzierungsprozesses, in Gegenwart von einem serumfreien Medium, wie in Szkolnicka 18,19 beschreiben.
Anmerkung: Die Verwendung eines enzymatischen Zell Dissoziation physikalischen Zellablösung bevorzugt.
9. Cytochrom-P450-Funktionstest
- Messen CYP3A-Aktivität nach der Anleitung des Herstellers.
- HESC abgeleitet Hepatozyten an Tag 13 oder Tag 19, und Medien inkubieren ohne Zellen - als Negativkontrolle, mit der entsprechenden substraß für 5 h bei 37 ° C aufweist.
- Sammeln Ständen von Zellen und Medien, führen Sie den Test nach Anweisungen des Herstellers.
- Messung der Höhe der CYP-Aktivität und normiert auf die Fläche (cm 2).
10. Immunfärbung
- Wasch hESC abgeleitet Hepatozyten mit PBS für 1 min, zwei Mal wiederholen.
- Fügen eiskalten 100% Methanol, um Zellen zu fixieren, in -20 ° C für 10 min.
- Waschen Sie die Zellen mit PBS für 5 min und zweimal wiederholen.
- Inkubiere die Zellen mit PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA für 1 h bei RT.
- Saugen Sie das PBST-Lösung und fügen Sie den entsprechenden primären Antikörpers in PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA verdünnt, Inkubation bei 4 ° C unter leichtem Schütteln O / N.
- Waschen Sie die Zellen mit PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA für 5 min und dreimal wiederholen.
- Verdünne die entsprechenden Antikörper in PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, in den Zellen und Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur 1 Stunde unter leichtem Schütteln.
- Waschen Sie die Zellen mit PBS für 5 min und dreimal wiederholen.
- Fügen MOWIOL 488 (mit DAPI 1: 1.000) in jede Vertiefung, fügen Sie ein Deckglas vorsichtig auf die Anzahl der Luftblasen zu reduzieren. Speicher fixierten Zellen bei 4 ° C im Dunkeln. Beachten Färbung unter Verwendung eines Mikroskops mit entsprechenden Filter und Leuchtstofflampen. Die optimierten primären und sekundären Antikörper sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polymerlösungsmittel beeinflusst die Topographie des mit Polymer beschichteten Oberfläche
Polyurethan-134 wurde in Chloroform gelöst, entweder allein oder in Kombination mit Toluol oder Tetrahydrofuran oder Dichlormethan, und die Objektträger aus Glas mit den verschiedenen Formulierungen schleudert. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Rasterkraftmikroskopie (AFM) wurden zur Charakterisierung der physikalischen Eigenschaften der Polymerschichten (Abbildung 1). Die Verwendung von Toluol oder Chloroform erhaltene Beschichtung war nicht homogen, zeigen eine ungleichmäßige Beschichtung mit PU134 Niederschlag (Abbildung 1a). Im Gegensatz dazu war Tetrahydrofuran ein geeignetes Lösungsmittel ermöglicht die Schleuderbeschichtung einer viel gleichmäßiger Oberfläche (1A). Oberflächentopographie wurde von AFM mit der Root Mean Square (RMS) und die mittlere (Ra) gemessen. PU134 aufgelöst Tetrahydrofuran zeigte eine Verringerung der Rauhigkeit von 40% im Vergleich zu the andere Lösungsmittel (Abbildung 1B und 1C). Diese Daten zeigen, dass die Verwendung von Tetrahydrofuran als Lösungsmittel liefert eine gleichmäßige Beschichtung der PU134 für biologische Anwendung.
Polymer Topographie hat einen signifikanten Einfluss auf Leberzellfunktionen
HES effizient an Leber Endoderm in vitro differenziert werden, zeigen viele der Funktionen in der adulten Leber 17-20 gefunden. Leber Endoderm Differenzierung induziert und am Tag 9 hepatoblast artigen Zellen ergibt, wobei die Mehrzahl der Zellen Cytokeratin 19 (99% ± 1,2), α-Fetoprotein (99% ± 0,6) und Leber nuclear factor 4α (97% ± exprimieren 2,6); und geringe Mengen an Albumin (20% ± 1,7) (Abbildung 2). An dieser Stelle wurden die Zellen mit TrypLE auszudrücken und auf die verschiedenen Polymer beschichteten Oberflächen replattiert abgelöst. Als Maß für die Stoffwechselfunktion, die Cytochrom-P450-fSalbung wurden 4 Tagen beurteilt Post-Replattierung. Wir beobachteten eine 2-fache Erhöhung der Stoffwechselaktivität in Zellen in Tetrahydrofuran / PU134 beschichteten Oberflächen (Figur 3) wieder ausplattiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass menschliche embryonale Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten Stoffwechselaktivität ist mit einer mehr gleichmäßige Beschichtung der PU134 verbessert, ist dies im Einklang mit bisherigen Ansätzen 21.
Oberflächensterilisation Auswirkungen auf die bioaktiven Eigenschaften des Polymers
Die Wirkung der Sterilisation auf PU134 Leistung wurde ebenfalls untersucht. Polymer beschichteten Glasobjektträger wurden mit UV-oder Gammastrahlung ausgesetzt wird. Phasenkontrast-Bildgebung von PU134 beschichteten Glasobjektträger zeigten keine großen Unterschiede zu posten oder UV-Gamma-Bestrahlung (4A). Diese Beobachtungen wurden durch SEM-Analyse (4B) bestätigt. Die biologische Leistung der PU134 wurde mit humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten in 10 Tagen nach der Replattierung sucht. hESC abgeleitetHepatozyten auf γ-abgestrahlt PU134 beschichteten Glasobjektträger erneut plattiert zeigte eine 3-fache Steigerung der CYP3A-Aktivität gegenüber Zellen auf UV-abgestrahlt PU134 beschichtete Glasobjektträger (4C) wieder ausplattiert. Diese Beobachtungen zeigten, daß der Gamma-Bestrahlung war das optimale Sterilisationstechnik für unsere Zwecke.
Figur 1. Optimierung der Polyurethan beschichtete Oberfläche 134. (A) Glasobjektträger wurden mit einer 2% igen Lösung von PU134 in verschiedenen Lösungsmitteln gelöst beschichtet. Rasterelektronenmikroskopie (REM) Aufnahmen der einzelnen beschichteten Glasobjektträger zeigen das Vorhandensein einer homogenen beschichtete Oberfläche und die Abwesenheit von Polymer ausfällt, wenn Tetrahydrofuran wurde im Vergleich mit Toluol, Chloroform oder Gemische der Lösemittel (schwarze und weiße Pfeile) verwendet. Die Bilder wurden bei x1664 Vergrößerung und skaliert Bars ar e unter den Bildern angezeigt. (BC) Atomic Force Microscopy (AFM) wurde verwendet, um die Rauhigkeit der beschichteten Oberflächen PU134 auf ausgewählten Lösungsmitteln analysieren. Analyse der Parameter Rauheit RMS (der root mean square) (B) und Ra (die mittlere Rauheit) (C) der verschiedenen PU134 beschichteten Oberflächen zeigen, dass die durch die Verwendung von Tetrahydrofuran als Lösungsmittel erhaltene Beschichtung hatte die glatte Oberfläche, wenn sie mit der im Vergleich Rest der Bedingungen (n = 7). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung, p <0,05 * bezeichnet wird, p <0,01 ** bezeichnet ist, und p <0,001 *** bezeichnet wird, die von Studenten t-Test im Vergleich zu Folien mit PU134 beschichtet in Tetrahydrofuran löslich gemessen. Fehlerbalken stellen 1 Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Charakterisierung der humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet Hepatoblasten. Immunocytochemistry, der die Expression von hepatischen Marker AFP, CK19, HNF4α und Albumin in hESC (H9) abgeleitet Leber Endoderm. Negative Kontrollen wurden mit entsprechenden Immunglobulin G (IgG) und repräsentativen Bilder angezeigt werden ausgeführt. Der Prozentsatz der positiven Zellen und die Standardabweichung wurden aus mindestens fünf zufälligen Sichtfelder, die zumindest 300 Zellen pro Ansicht geschätzt. Die Bilder wurden bei 20facher Vergrößerung. Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung 1. HNF4α, Hepatocyte nuclear factor 4α; AFP, α-Fetoprotein; ALB, Albumin; CK19, Cytokeratin 19, IgG Ziege, Immunglobulin G Anti-Ziege-IgG-Maus, Immunglobulin G Anti-Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere versi sehenauf dieser Figur.
Figur 3. Funktionelle Folgen der Topographie der PU134 beschichteten Oberfläche auf die Funktion der HES abgeleiteten Hepatozyten. Messung des Cytochrom P450 3A-Aktivität auf humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten für 96 h auf Glasobjektträgern mit PU134 in verschiedenen Lösungsmitteln gelöst beschichtet gehalten. Eine Verbesserung der in der Cytochrom-Aktivität auf Zellen PU134 beschichteten Glasobjektträger gehalten, das mit Tetrahydrofuran solubilisiert (n = 6). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung, p <0,05 * bezeichnet wird, p <0,01 ** bezeichnet ist, und p <0,001 *** bezeichnet wird, die von Studenten t-Test im Vergleich zu humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet gemessen Hepatozyten auf Folien beschichtet mit gepflegt PU134 auf Tetrahydrofuran löslich gemacht. Fehlerbalken stellen 1 Standardabweichung.
Abbildung 4. Optimierung der Sterilisation der beschichteten Oberflächen. Phasenkontrastaufnahmen (A) oder REM-Bilder (B) zeigen keine großen Unterschiede in der PU134 beschichtete Oberfläche zwischen γ-Strahlung oder UV-Strahlung (UV)-Behandlungen. Phasenkontrastaufnahmen wurden bei 40-facher Vergrößerung und REM-Aufnahmen bei 1,664X Vergrößerung. (C) Analyse des Cytochrom P450 3A-Aktivität auf humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten für 10 Tage auf PU134 beschichteten Glasobjektträger gehalten. Eine Erhöhung des Cytochrom P450 3A-Aktivität in Zellen, die auf γ-abgestrahlt PU134 beschichteten Glasobjektträger erneut plattiert, wenn mit Zellen, die auf UV wiederplattierte Vergleich abgestrahlt PU134 beschichteten Glasobjektträgern. Aktivitätseinheiten sind als relative Lichteinheiten (RLU) ml -1 cm -2 Kulturoberfläche exprimiert (n = 3). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung, p <0,001, ausgedrückt is bezeichnet *** von Studenten t-Test im Vergleich zu humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten auf PU134-Deckgläsern von γ-Strahlung sterilisiert gehalten gemessen. Fehlerbalken stellen 1 Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Primäre Antikörper | |||
| Antigen | Art | Firma | Verdünnung |
| HNF4α | Polyklonale Kaninchen | Santa Cruz | 1/100 |
| Albumin | Monoklonalen Maus- | Sigma | 1/500 |
| AFP | Monoklonalen Maus- | Abcam | 1/500 |
| Cytokeratin 19 | Monoklonalen Maus- | Dako | 1:50 |
| IgG | Monoklonalen Maus- | Dako | 1/500 |
| Sekundärantikörper | |||
| Anti-Kaninchen-Alexa 568-Mehl | Ziege | Invitrogen | 1/400 |
| Anti-Maus-Alexa Flour 488 | Kaninchen | Invitrogen | 1/500 |
Tabelle 1. Liste der optimierten primären und sekundären Antikörper und Konzentrationen in dieser Studie verwendet. HNF4α, Hepatocyte nuclear factor 4α; AFP, α-Fetoprotein; IgG, Immunglobulin G
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viele der verwendeten Hepatozyten aus Stammzellen erzeugen aktuellen Methoden beruhen auf undefinierte Matrizen tierischen Ursprungs. Diese Substrate können kostspielig und sehr variabel sein und somit die Zellfunktion und der Stabilität, die ein großes Hindernis für Anwendung. Daher führten wir einen Bildschirm für synthetische Materialien, die die Kultur der Stammzell abgeleitet Hepatozyten zu unterstützen. Wir haben festgestellt, eine einfache Polyurethan (PU134) durch Polymerisation PHNGAD, MDI und ein Streckmittel, das in Verbindung mit einem robusten Hepatozyten-Differenzierung Ansatz gebildet ist, stabilisiert die Hepatozyten Phänotyp und verbessert die Zellfunktion, wenn mit Matrigel 15 verglichen.
Umgang mit der bestehenden biologischen Matrices, die gemeinhin in der Kultivierung und Differenzierung verwendet Stammzellen wie Vitronektin 22, Laminin 521 23 oder Matrigel, ist für Kurzzeitpflege. Im Gegensatz dazu PU134 beschichtete Oberflächen bieten eine überlegene Substrat für hepatocyte Kultur. Darüber hinaus haben die Optimierung der Oberflächentopographie und Polymer Sterilisation zu weiteren Verbesserungen der Zellleistung, ein Schlüsselfaktor bei der Bereitstellung der menschlichen Leber Modelle im Maßstab mit zuverlässige Leistung geführt.
Die Art des Kettenverlängerers und Phenylisocyanat ist eine der kritischen Phasen des Prozesses; als Beseitigung oder Ersatz einer Komponente wäre die Polymeroberfläche erheblich beeinträchtigen und damit die Zellhaftung und funktionelle Aktivität von Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten. Die Zusammensetzung des Polymers beeinflusst physikalische Parameter wie Elastizität und Benetzbarkeit 24, welche Auswirkungen hat die Fähigkeit des Polymers zur Schlüsselextrazellulären Matrixproteinen in Leberzellfunktionen beteiligt absorbieren. Außerdem Veränderungen in den Katalysator, Reaktionszeit und Temperatur beeinflussen die Molekulargewichtsverteilung des Polymers.
Die Auswahl des Lösungsmittels, um das Polymer zu solubilisieren Wiederstellt eine weitere kritische Punkt in der Erlangung eines optimierten Polymer beschichtet Oberfläche. Wir haben festgestellt, dass die Art des Lösungsmittels beeinflußt die Topographie der beschichteten Oberfläche, die direkte Auswirkungen auf die Funktion der Zellen 25-31 hat. Darüber hinaus sind auch die Schleuderzeit und die Geschwindigkeit wesentlich, um diese gleichmäßige und homogene Beschichtung. Ein weiterer Schritt, um in Betracht zu ziehen ist, die an dem Polymer beschichtete Oberfläche aufgebracht Sterilisationsverfahren, wie die Aktivität der Zellen kann durch die Sterilisationsbehandlung verwendet beeinflusst werden. Dies kann auf die Anwesenheit von empfindlichen Bereich (en) innerhalb der Struktur des Polymers, verschiedene Sterilisationsverfahren 32-34 sein.
Aktuelle pluripotenten Stammzellzellmodelle besitzen phänotypischen und funktionellen Einschränkungen. Wir glauben, dass diese optimierte Polymer beschichteten Oberfläche stellt einen Fortschritt auf dem Gebiet, zu umgehen einige der Einschränkungen bei der Verwendung von biologischen subst zugeordnetRaten. Außerdem ist die Möglichkeit der Verwendung des Polymers in 3D-Matrices zur Unterstützung der Befestigung der verschiedenen Zelltypen in dem Gewebe von Interesse gefunden wird, kann die Zellenwiedergabetreue zu verbessern.
Im Ergebnis ist die Verwendung von synthetischen Materialien, die sich bei der Abgabe von Soma menschlichen pluripotenten Stammzellen zunehmend an Bedeutung. Wir haben eine optimierte Oberfläche und Beschichtungsverfahren, das robust entwickelt und liefert zuverlässig funktionellen humanen Hepatozyten mit erheblichen Auswirkungen für die Zellbasierte Modellierung und der regenerativen Medizin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DCH ist CSO, Regisseur, Gründer und Gesellschafter der FibromEd Products Ltd MB und JPI sind Gründungsaktionäre in FibromEd Products Ltd
Acknowledgments
DCH, MB und FK wurden von einem EPSRC Folgen auf Fonds unterstützt. BL-V und DS wurden jeweils durch MRC PhD student unterstützt. KC wurde durch Mittel aus dem UK Regenerative Medizin-Plattform unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips | |||
| Shaker | Edmun Bühler | KS-15 | |
| Irradiator | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| Spin coater | Specialty Coating System | P-6708 | |
| Scanning Electron Microscope | Philips | XL30CPSEM | |
| Atomic Force Microscope | DimensionV Nanoscope, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| UV bulb | ESCO | ||
| NanoScope analysis software | VEECO | version 1.20 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | TH45200 | Use Volocity 4 Software |
| Tissue culture plates | Corning, UK | 3527 | |
| glass slides | Scientific Laboratory Supplies | MIC3308 | |
| Diethylene glycol | Sigma–Aldrich | 93171 | |
| 1,6-hexanediol | Sigma–Aldrich | 240117 | |
| Neopentyl glycol | Sigma–Aldrich | 408255 | |
| Adipic acid | Sigma–Aldrich | 9582 | |
| anhydrous N,N-Dimethylformamide | Sigma–Aldrich | 227056 | |
| Diethyl ether | Sigma–Aldrich | 676845 | |
| titanium (IV) butoxide | Sigma–Aldrich | 244112 | |
| 1,4-butanediol | Sigma–Aldrich | 493732 | |
| Vacuum oven | Thermoscientific | ||
| 4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) | Sigma–Aldrich | 101688 | |
| Tetrahydrofurane | Sigma–Aldrich | 401757 | |
| Sputter coater | Bal-Tec SCD 050 | ||
| Inmunostaining | |||
| Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) | Gibco | 10010031 | Store at room temperature |
| PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 | Scientific Laboratory Supplies Ltd | EC607 | |
| Methanol | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, UK | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions |
| Cell culture and Functional assay | |||
| CYP3A activity pGLO kit | Promega | V8902 | |
| Hepatozyme | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 | |
References
- Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).
- Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).
- Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).
- Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26 (19), 4171-4179 (2005).
- Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50 (7), 645-652 (2006).
- Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (1), 13-22 (2013).
- Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3 (3), 034112 (2008).
- Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32 (12), 3220-3232 (2011).
- Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30 (6), 1045-1055 (2009).
- Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31 (8), 2216-2228 (2010).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4 (1335), (2013).
- Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).
- Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).
- Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1 (1), 50-53 (2012).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (34), 12301-12306 (2008).
- Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
- Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).
- Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33 (1-2), 15-30 (1998).
- Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5 (3195), (2014).
- Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25 (1), 336-370 (2003).
- Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
- Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116 (10), 1881-1892 (2003).
- Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231 (1), 28-37 (2008).
- Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5 (4), 273-280 (2006).
- Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28 (1), 1806-1819 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19 (19), 2775-2779 (2007).
- Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23 (3), 305-311 (2013).
- Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).
- Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).
