Summary
この記事では、ヒト肝細胞を由来幹細胞の長期、安定的な培養のためにポリマーコーティングされた表面の開発に注力していきます。
Introduction
生物学的材料は、広く、多能性幹細胞1の維持および分化に使用されている。可能にしながら、これらの生物学的基質は、多くの場合、未定義の構成要素の無数が含まれています。マトリゲルは、幹細胞の培養および分化のための一般的に使用される基板である。残念ながら、その可変組成は、細胞の機能および表現型に影響を与える。代替、複数の定義された生物学的マトリックスの多様2-7使用されてきたが、それらの動物由来または貧弱な拡張性は、彼らに工業的な製造には適さない候補にする。したがって、定義された組成と信頼できる性能を有する合成代替物の同定は、幹細胞研究の重要な目標である。
未定義の細胞培養基質の制限を克服する試みにおいて、化学と生物学との間の学際的コラボレーションは、細胞表現型をサポートする能力を有する合成材料を同定した。シンセエティックな基板は、スケーラブルであり、費用対効果、および複雑な3次元構造に製造することができ、 生体内環境を模倣する。によるこれらの特性に合成基質は、広く多くの細胞型8-10の分化を支持し、駆動するために使用されてきた。
Advancedおよびハイスループットアッセイは、大規模なライブラリーから、合成材料の迅速なスクリーニングを容易にし、生物医学の研究開発11-13の幅広いアプリケーションとの柔軟な特性を有する新規材料を提供してきました。高いスループットを利用して、高分子マイクロアレイスクリーニング技術は、急速にヒト幹細胞由来の肝細胞の維持に適した単純なポリウレタン（PU134）を同定した。このポリマーは、肝細胞の分化および機能14-16に関して動物由来の基質よりも優れていることが判明した。私たちは、その後の効果をアクセスするための塗布条件、地形や滅菌プロセスを最適化した肝細胞機能と寿命を安定化するポリマーの性能に。これは、セルベースのモデリングと再生医療アプリケーションのための肝細胞生物学の基礎を理解することに関して重要な意味を持っている。
ここで説明する技術は、合成ポリマーの表面が細胞表現型を維持するために最適化することができる方法の例を示している。私たちは、効率的な無血清肝細胞分化プロトコルでこの技術の組み合わせは、 インビトロモデリングや再生医療で使用するための肝細胞のスケーラブルな生産を提供する可能性を持っていることを信じています。
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Protocol
PHNGAD（ポリ[1,6-hexanodiol /ネオペンチルグリコール/ジ（エチレングリコール）-alt - アジピン酸]ジオール）の合成
スキーム1：PHNAGDの合成 PHNAGDの合成の模式図。。 PHNAGDは、1,6 - Hexanodiol、ジエチレングリコール、neoppentylグリコールとアジピン酸との反応により調製した。 PHNAGD、ポリ[1,6-hexanodiol /ネオペンチルグリコール/ジ（エチレングリコール）-alt - アジピン酸]ジオール。
- 残留水を除去し、真空オーブン中で48時間40℃でのモノマー1,6 - ヘキサンジオール、ジ（エチレングリコール）及びネオペンチルグリコールに熱処理を適用する。真空下で室温まで寒さにできるようにします。
- 二口丸底フラスコに攪拌棒を備えたディーン·スターク装置に接続する各モノマーの22ミリモルを加え、アジピン酸（55ミリモル）を加えた。
- 真空下でアセンブリ全体を置き、静かにGLAを加熱フラスコ中の化学物質の添加中の任意の吸湿を避けるために、6時間40℃でssware。
- 、一滴ずつ、シリンジを介して追加の触媒チタン（IV）ブトキシドの0.0055モル。
- 24時間N 2雰囲気下、180℃で反応混合物を撹拌し、そしてディーン-スタークトラップに残留水を集める。製品が室温まで冷却させる。
PU134の2の合成
スキーム2：PU134の合成 PU134は、4,4 ' -メチレンビス（フェニルイソシアネート）の2.0当量とPHNGADの1.0当量との反応により調製されたポリウレタン134の合成の略図、1.0を添加した。 1,4 - ブタンジオール連鎖延長剤の当量。
- 4の2当量とポリオールPHNGAD 1当量の量（Mn〜1,800ダルトン、3.2ミリモル）を混ぜ無水N 4 ' -メチレンビス（フェニルイソシアネート）（6.4ミリモル）、Nジメチルホルムアミド（12 ml）を加えた。
- N 2雰囲気下、70℃で反応混合物を、攪拌する。
- 触媒チタン（IV）ブトキシド（0.8％重量）を一滴ずつ、シリンジを介して追加します。
- 1時間後、鎖延長剤1,4 - ブタンジオール（3.2ミリモル）の1当量を加える。 90℃に温度を上昇させ、N 2雰囲気下で24時間撹拌した。
- 反応後、沈殿が生じるまで反応溶液に滴下し（ヘキサンまたは水を使用することもできる）のジエチルエーテルを加えて沈殿させることによりポリウレタンを収集する。
- 5分間5,300×gで解決策を遠心。
- 上清を除去し、溶媒が蒸発するまで、真空オーブンで40℃で乾かす。
注するために、反応の最終生成物は、分子量分布に関する適切なパラメータを有することを確実にするために、機能的grouポリマー、溶融およびガラス転移温度のpsが、さまざまな分析技術および方法は、ゲル浸透クロマトグラフィーまたはFITR分光法を用いることができる。
PU134ソリューションの調製
- ガラス瓶にPU134を200mg秤量する。
- クロロホルム、1クロロホルムとトルエンの組み合わせ：1の比率、テトラヒドロフラン、及び1テトラヒドロフラン及びdicloromethaneの組み合わせ：1の比の溶媒の数が2％の最終濃度にPU134を希釈する。
注：右の溶媒の選挙は、使用するポリマーに応じて変化する。異なる溶媒は、ポリマーの可溶化に影響を与えることができる異なる沸点を有する。 - 溶液が均一になり、沈殿物が観察されなくなるまで、200 MOT /分の速度でシェーカーを用いて室温で20分間溶液を激しく振る。
PU134とスライドガラスの4。塗装
- ROUを配置スピンコーター上のND 15ミリメートル2カバースリップ。
- ピペットを用いて各PU134溶液50μlを適用します。比に比例表面ボリュームを保つ必要なカバーガラスサイズに応じてPU134溶液の量を調整します。
- 23 x gで7秒間、各カバースリップスピン。
- 滅菌前に少なくとも24時間、室温で空気乾燥カバースリップ。
カバースリップの5。照射
- 12分間実験室の照射装置を用いて10グレイの線量を適用することにより、ポリマーで被覆されたカバースリップをガンマ - 照射する。
- UV-16分間、30 W、UV電球の各側面を用いてポリマーコーティングされたカバースリップを照射する。
- スライドのサイズに応じて適切な組織培養プレートにポリマー被覆カバースリップを置きます。
6。走査型電子顕微鏡
- 圧力5×10 -1ミリバールの雰囲気下で200秒間スパッタリングによる金コートポリマーカバースリップ。
- マイクログラムをキャプチャ二次電子撮像モードで20kVの加速電圧での走査型電子顕微鏡を用いてポリマーコーティングされたカバースリップのraphs。
7。原子間力顕微鏡の観察
- ポリマー表面の20×20μmの領域をスキャンします。
- 1.32ヘルツから1.60 Hzのスキャンレートを設定します。
- スキャンされた領域内の512×512ピクセルの解像度を設定します。
- 平均画像データプレーンから採取した高さ偏差の平均値を用いて、コーティングの平方根（RMSまたはさRq）の平均平方根を計算し、のように表さ。
Ziが現在のZ値であり、Nは、所定の領域内の点の数である。 - 7.5偏差を計算し、または使用して、画像の表面粗さ（Ra）を意味し、
Z（x）はtで記述する関数である。彼は、高さ（Z）と評価長さ "L"を超える試料の位置（x）に関して分析プロファイル表面。 Raは中心面に対する表面の平均値を表す。
8。細胞培養および分化
- 文化·ヘイ17で説明したようにヒト胚性幹細胞株（ヒトES細胞）H9を区別。
- 解離試薬を用いて細胞を外し、Szkolnicka 18,19で説明するように、無血清培地の存在下で、分化過程の9日目でPU134被覆スライドにドラッグreplate。
注：酵素的細胞解離の使用は物理的な細胞剥離に好適である。
9チトクロームP450機能アッセイ
- 製造者の指示に従ってCYP3A活性を測定する。
- 細胞なしのhESCに由来する13日目または19日目での肝細胞、およびメディアをインキュベート - ネガティブコントロールとして、適切なSUBSTRで37℃で5時間食べた。
- 、細胞および培地からの上清を回収し、製造業者の指示に従ってアッセイを実施しています。
- 表面積（cm 2）でのCYP活性と正規化のレベルを測定する。
10免疫染色
- PBSで洗浄するのhESC派生肝細胞は、1分間、2回繰り返す。
- 10分間、-20℃での氷冷100％の細胞を固定するために、メタノール、場所を追加します。
- 5分間のPBSで細胞を洗浄し、二回繰り返します。
- RTで1時間PBS / T（0.1％トゥイーン）/ 10％BSAで細胞をインキュベートする。
- PBST液を吸引し、PBS / T（0.1％トゥイーン）/ 1％BSA中に希釈した適切な一次抗体を追加し、穏やかに撹拌し、O / N、4℃でインキュベートする。
- 5分間のPBS / T（0.1％トゥイーン）/ 1％BSAで細胞を洗浄し、三回繰り返して。
- ％のBSA / 1×PBS / T（0.1％トゥイーン）中で適切な抗体を希釈し、細胞に追加し、穏やかに撹拌しながら室温で1時間、暗所でインキュベートする。。
- 5分間のPBSで細胞を洗浄し、3回繰り返します。
- 各ウェルに、気泡の数を減らすために穏やかにカバースリップを追加し（千DAPI 1を含む）MOWIOL 488を追加する。暗闇の中で4℃で保存固定した細胞。適切なフィルターと蛍光灯顕微鏡を用いて染色し観察します。最適化された一次および二次抗体は、 表1に記載されています。
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Representative Results
ポリマー溶媒は、ポリマーコーティングされた表面の形状に影響を与える
ポリウレタン134は、トルエンまたはテトラヒドロフランまたはジクロロメタンとの単独または組み合わせのいずれかで、クロロホルムに溶解し、ガラススライドは、異なる製剤でスピンコートした。走査電子顕微鏡（SEM）および原子間力顕微鏡（AFM）は、ポリマーコーティング（ 図1）の物性を特徴付けるために使用された。トルエンやクロロホルムを使用して得られたコーティングは、PU134沈殿（ 図1A）で塗布ムラを実証する、均質ではなかった。対照的に、テトラヒドロフラン、はるかに均一な表面のスピンコーティングが可能な適切な溶媒（ 図1A）であった。表面形状は、正方形（RMS）と、平均粗さ（Ra）が平均平方根を用いてAFMにより測定した。 PU134溶解テトラヒドロフラン目と比較して粗さの40％の減少を示したE他の溶媒（ 図1Bおよび1C）。これらのデータは、溶媒としてテトラヒドロフランを使用することは、生物学的用途のためにPU134のより均一なコーティングを提供することを実証する。
ポリマートポグラフィは、肝細胞機能に大きな影響を与える
ヒトES細胞を効率的に成人肝17-20に見られる機能の多くを発揮する、in vitroでの肝内胚葉に分化させることができる。肝内胚葉分化を誘導し、目で9肝芽細胞様細胞はサイトケラチン19（1.2±99％）、α-フェトプロテイン（0.6±99％）、肝核因子4α（97％±を発現する細胞の大部分は、明らかであった2.6）;及びアルブミンの低レベル（1.7±20％）（ 図2）。この時点で、細胞が発現し、異なるポリマーでコーティングされた表面上に再播種しTrypLEを使って剥がした。代謝機能の尺度として、チトクロームP450 fは慰め、ポスト再播種4日後に評価した。私たちは、テトラヒドロフラン/ PU134被覆表面（ 図3）上に再プレーティングした細胞における代謝活性における2倍の増加を観察した。これらの結果は、21に接近したhESC由来の肝細胞の代謝活性は、PU134のより均一なコーティングで改善され、これは、前と一致していることを示している。
ポリマーの生体活性特性に及ぼす表面殺菌の影響
PU134性能に対する殺菌の効果も調べた。ポリマー被覆されたガラススライドをUVまたはガンマ線照射に曝露した。 PU134コーティングされたガラススライドの位相コントラストイメージングは、肉眼差はUVまたはガンマ線照射（ 図4A）ポスト示さなかった。これらの観察は、さらにSEM分析（ 図4B）によって確認した。 PU134の生物学的性能は、10日後に再プレーティングでのhESC由来の肝細胞を用いて調べた。ヒトES細胞に由来するγ-放射PU134コーティングされたガラススライド上に再播種した肝細胞は、UV放射PU134コーティングされたガラススライド（ 図4C）に再播種した細胞上のCYP3A活性が3倍の増加を示した。これらの観察は、ガンマ線照射は、私たちの目的のために最適な殺菌技術であることを示した。
ポリウレタンコーティングされた表面134の図1の最適化。（A）ガラススライドを異なる溶媒に溶解PU134の2％溶液でコーティングした。異なるコーティングされたガラススライドのスキャニング電子顕微鏡（SEM）画像は、均一な塗布面の存在を示す、テトラヒドロフラン、トルエン、クロロホルムまたは溶媒（黒と白の矢印）の混合物と比較して用いた場合、ポリマーの不在が沈殿する。画像は、x1664の倍率で撮影したバーは、AR鱗 eは、画像の下に表示。 （BC）原子間力顕微鏡（AFM）は、選択された溶媒にPU134コーティングされた表面の粗さを分析するために使用した。と比較して粗さパラメータのRMS（二乗平均平方根）（B）と異なるPU134被覆表面はRa（平均粗さ）（C）の分析は、テトラヒドロフランを溶媒として用いて得られたコーティングは、滑らかな表面を有していたことを示し残りの条件（N = 7）。平均±標準偏差、p <0.05での* はp <0.01 **が示され、そしてp <0.001は、テトラヒドロフラン中で可溶化PU134でコーティングされたスライドに比べて、学生のt検定によって測定された、***示される示されているようにデータが表現される。エラーバーは1標準偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ヒトES細胞に由来する肝芽細胞の図2の特徴づけ。免疫細胞は、ヒトES細胞における肝マーカーAFP、CK19、HNF4αおよびアルブミン（H9）の発現を示す肝内胚葉を導出した。ネガティブコントロールは、対応する免疫グロブリンG（IgG）を用いて行い、代表的な画像が示されている。陽性細胞は、標準偏差のパーセンテージは、ビューごとに少なくとも300個の細胞を含むビューの少なくとも5つの無作為視野から推定した。画像は、20X倍率で撮影した。平均±標準偏差エラーバーは1標準偏差を表すようにデータが表現される。 HNF4α、肝細胞核因子4α; AFP、α-フェトプロテイン; ALB、アルブミン; CK19、サイトケラチン19、IgGヤギ、免疫グロブリンG抗ヤギ、IgGのマウス、免疫グロブリンG抗マウス。 大きなversiをを見るにはこちらをクリックしてください。この図の上。
図のhESC派生肝細胞の機能にPU134コーティングされた表面の形状の3機能的意味。異なる溶媒に溶解PU134でコーティングされたガラススライド上で96時間維持hESC由来肝細胞シトクロムP450 3A活性の測定。テトラヒドロフラン中で可溶化PU134コーティングされたガラススライド上に維持された細胞上のチトクロム活性（n = 6）の改善。平均±標準偏差、p <0.05 のが示されているようにデータが表現される* はp <0.01 **示され、そしてp <0.001でコーティングしたスライド上に保持したhESC由来の肝細胞と比較して学生のt検定によって測定され、***示されPU134は、テトラヒドロフランに可溶化した。エラーバーは1標準偏差を表す。
図4のコーティングされた表面の滅菌を最適化。位相差画像（A）又はSEM像（B）は、γ-放射線または紫外線照射（UV）処置間PU134コーティングされた表面における肉眼差異を示さない。位相コントラスト画像は1,664X倍率で40倍倍率SEM画像で撮影した。 （C）PU134コーティングされたガラススライド上で10日間維持したhESC由来の肝細胞上のチトクロームP450 3A活性の分析。 UV上に再播種した細胞と比較してγ-放射PU134コーティングされたガラススライド上に再播種した細胞におけるチトクロームP450 3Aの活性の増加は、PU134コーティングされたガラススライドを放射。活性の単位はml -1のcm -2で培養表面の相対的光単位（RLU）として表される（n = 3）であった。データは平均±標準偏差、p <0.001として表されている私***γ線照射により滅菌PU134コーティングされたガラスカバースリップ上で維持したhESC由来の肝細胞と比較して、スチューデントt検定によって測定と示さsの。エラーバーは1標準偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 一次抗体 | |||
| 抗原 | タイプ | 会社 | 希釈 |
| HNF4α | ウサギポリクローナル | サンタクルス | 100分の1 |
| アルブミン | マウスモノクローナル | シグマ | 1/500 |
| AFP | マウスモノクローナル | アブカム | 1/500 |
| サイトケラチン19 | マウスモノクローナル | ダコ | 50分の1 |
| IgGの | マウスモノクローナル | ダコ | 1/500 |
| 二次抗体 | |||
| 抗ウサギ568アレクサ小麦粉 | ヤギ | インビトロジェン | 1/400 |
| 抗マウス488 Alexaの小麦粉 | ウサギ | インビトロジェン | 1/500 |
本研究で用いた最適化された一次および二次抗体および濃度の表1のリスト 。 HNF4α、肝細胞核因子4α; AFP、α-フェトプロテイン; IgGを、免疫グロブリンG。
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Discussion
幹細胞から肝細胞を生成するために使用される現在の方法の多くは、動物由来の未定義のマトリックスに依存している。これらの基板は、アプリケーションに重大な障壁を表す、細胞の機能および安定性に影響を与える、費用がかかり、非常に可変であることができる。そこで、幹細胞由来肝細胞の培養を支持する合成材料のためのスクリーンを行った。私たちは、同定した、堅牢な肝細胞分化アプローチと組み合わせてPHNGAD、MDIおよびエクステンダー、それを重合して形成された単純なポリウレタン（PU134）は、肝細胞の表現型を安定化し、マトリゲル15と比較して細胞の機能を改善する。
一般的に培養に使用される生体マトリクスを、既存およびビトロネクチン22、ラミニン521 23またはマトリゲルのような幹細胞を分化の取扱いは、短期的なメンテナンスのために効果的である。対照的に、PU134コーティングされた表面は、hepatocy優れた基板を提供TE文化。また、表面形状及びポリマー殺菌の最適化は、電池性能、信頼できる性能とスケールでヒト肝臓モデルを提供する上で重要な要素のさらなる改善につながっている。
鎖延長剤及びフェニルイソシアネートの性質は、プロセスの重要な段階の1つを表し;いずれかの成分の除去または置換して有意にポリマー表面を損ない、したがって、細胞付着および幹細胞由来肝細胞の機能的活性であろう。ポリマーの組成は、そのような影響肝細胞機能に関与する重要な細胞外マトリックスタンパク質を吸収するポリマーの能力を有し、弾力性、濡れ性24などの物理的パラメータに影響を与える。また、触媒の変動は、反応時間および温度は、ポリマーの分子量分布に影響を与える。
ポリマーの再可溶化する溶媒の選択最適化されたポリマーコーティングされた表面を得るの別の重要なポイントを提示します。私たちは、溶媒の性質は、細胞が25〜31の機能の直接的な意味を有するコーティングされた表面のトポグラフィーに影響を与えることを観察した。また、紡糸時間および速度は、この均一で均質なコーティングを得る上で重要である。細胞の活性は、使用される滅菌処理の影響を受けることができるように考慮して取るために別のステップでは、ポリマーコーティングされた表面に塗布殺菌手順である。これは、異なる滅菌手順32-34へのポリマーの構造内の敏感な領域の存在に起因し得る。
現在の多能性幹細胞ベースの細胞モデルは、表現型および機能的な制限を有する。私たちは、この最適化されたポリマーでコーティングされた表面は、生物学的SUBSTの使用に関連するいくつかの制限を回避する、フィールド内の進歩を意味すると考えている料金。さらに、関心のある組織に見られる異なる細胞型の付着をサポートする3次元マトリックス内にポリマーを使用する可能性は、さらなる細胞の忠実度を改善することができる。
結論として、合成材料の使用は、多能性幹細胞からのヒト体細胞の送達においてますます重要になってきている。私たちは、堅牢で最適化された表面とコーティングの手順を開発し、確実に細胞ベースのモデリングや再生医療に大きな影響を持つ機能的なヒト肝細胞を提供しています。
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Disclosures
DCHはCSO、FibromEdプロダクツ株式会社における取締役、創業者でFibromEd製品株式会社MBおよびJPIにおける株主である創業者の株主である
Acknowledgments
DCH、MBとFKは基金に関するEPSRCフォローによってサポートされていました。 BL-VとDSがそれぞれのMRC博士studentshipsによってサポートされていました。 KCは、英国再生医療プラットフォームからの資金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips | |||
| Shaker | Edmun Bühler | KS-15 | |
| Irradiator | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| Spin coater | Specialty Coating System | P-6708 | |
| Scanning Electron Microscope | Philips | XL30CPSEM | |
| Atomic Force Microscope | DimensionV Nanoscope, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| UV bulb | ESCO | ||
| NanoScope analysis software | VEECO | version 1.20 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | TH45200 | Use Volocity 4 Software |
| Tissue culture plates | Corning, UK | 3527 | |
| glass slides | Scientific Laboratory Supplies | MIC3308 | |
| Diethylene glycol | Sigma–Aldrich | 93171 | |
| 1,6-hexanediol | Sigma–Aldrich | 240117 | |
| Neopentyl glycol | Sigma–Aldrich | 408255 | |
| Adipic acid | Sigma–Aldrich | 9582 | |
| anhydrous N,N-Dimethylformamide | Sigma–Aldrich | 227056 | |
| Diethyl ether | Sigma–Aldrich | 676845 | |
| titanium (IV) butoxide | Sigma–Aldrich | 244112 | |
| 1,4-butanediol | Sigma–Aldrich | 493732 | |
| Vacuum oven | Thermoscientific | ||
| 4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) | Sigma–Aldrich | 101688 | |
| Tetrahydrofurane | Sigma–Aldrich | 401757 | |
| Sputter coater | Bal-Tec SCD 050 | ||
| Inmunostaining | |||
| Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) | Gibco | 10010031 | Store at room temperature |
| PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 | Scientific Laboratory Supplies Ltd | EC607 | |
| Methanol | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, UK | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions |
| Cell culture and Functional assay | |||
| CYP3A activity pGLO kit | Promega | V8902 | |
| Hepatozyme | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 | |
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