Summary
Denne artikkelen vil fokusere på å utvikle polymer belagt overflater for langsiktig, stabil kultur for stamcelle avledet humane hepatocytter.
Introduction
Biologisk materiale har blitt mye brukt i vedlikehold og differensiering av pluripotente stamceller en. Mens slik at disse biologiske substrater ofte inneholder en myriade av udefinerte komponenter. Matrigel er et vanlig substrat for stamcellekultur og differensiering. Dessverre, det er variabel sammensetning påvirker cellefunksjon og fenotype. Selv om en rekke av alternative og mer definert biologiske matriser er blitt brukt 2-7, gjør deres animalsk opprinnelse eller dårlig skalerbarhet dem uegnede kandidater for industriell produksjon. Derfor identifisering av syntetiske alternativer, med definert sammensetning og pålitelig ytelse, er sentrale mål i stamcelleforskning.
I et forsøk på å overvinne begrensninger av udefinerte cellekultur substrater, har tverr samarbeid mellom kjemi og biologi identifiserte syntetiske materialer med evne til å støtte celle fenotype. Synthetic underlag er skalerbar, kostnadseffektiv, og kan produseres til komplekse 3D-strukturer, etterligne in vivo miljøet. På grunn av disse egenskapene syntetiske substrater er blitt mye brukt for å støtte og drive differensiering av mange celletyper, 8-10.
Avanserte og høy gjennomstrømning analyser har tilrettelagt rask screening av syntetiske materialer, fra store biblioteker, og levert nye materialer med fleksible eiendommer med brede programmer i biomedisinsk forskning og utvikling 11-13. Utnytte høy gjennomstrømning, polymer microarray screening teknologi, vi raskt identifisert en enkel polyuretan (PU134), egnet for vedlikehold av menneskelige stamceller avledet hepatocytter. Denne polymer ble funnet å være overlegne i forhold til dyre avledet substrater med hensyn til hepatocytter differensiering og funksjon 14-16. Vi har senere optimalisert belegg forhold, topografi og steriliseringsprosess for å få tilgang effekterpå polymer ytelse i å stabilisere hepatocytter funksjon og levetid. Dette har betydelige konsekvenser med hensyn til å forstå grunnleggende av hepatocytter biologi for cellebasert modellering og regenerativ medisin applikasjoner.
Teknologien som er beskrevet her, representerer et eksempel på hvordan overflaten av en syntetisk polymer kan være optimalisert for å bevare celle fenotype. Vi tror at kombinasjonen av denne teknologien med en effektiv serumfritt hepatocytter differensiering protokollen har potensial til å gi en skalerbar produksjon av hepatocytter for anvendelse i in vitro-modeller og regenerativ medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese av PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / neopentylglykol / di (etylenglykol) -alt-adipinsyre] diol)
Skjema 1: Syntese av PHNAGD Skjematisk representasjon av syntesen av PHNAGD.. PHNAGD ble fremstilt ved omsetning av 1,6-Hexanodiol, dietylenglykol, neoppentyl glykol og adipinsyre. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentylglykol / di (etylenglykol) -alt-adipinsyre] diol.
- Påfør varmebehandling til monomerene 1,6-heksandiol, di (etylenglykol) og neopentyl-glykol ved 40 ° C i 48 timer i en vakuumovn for å fjerne eventuelt resterende vann. Tillat å kulde ned til romtemperatur under vakuum.
- Legg 22 mmol av hver monomer og adipinsyre (55 mmol) til en to-halset rundbundet kolbe utstyrt med en omrørt bar og forbundet med en Dean-Stark-apparat.
- Plasser den hele montering under et vakuum og forsiktig oppvarming av glassware ved 40 ° C i 6 timer, for å unngå enhver fuktighet under tilsetningen av kjemikaliet inn i kolben.
- Legg via sprøyte, dråpe for dråpe, 0,0055 mol av katalysatoren titan (IV) butoksid.
- Omrør reaksjonsblandingen ved 180 ° C under en N2 atmosfære i 24 timer, og samle gjenværende vann i Dean-Stark-felle. Tillater produktet å avkjøles til RT.
2. Syntese av PU134
Skjema 2: Syntese av PU134 Skjematisk representasjon av syntese av polyuretan 134. PU134 ble fremstilt ved omsetning av 1,0 ekviv av en PHNGAD med 2,0 ekvivalenter av en 4,4-metylenbis (fenyl-isocyanat), etterfulgt av tilsetning av 1,0. ekv av en 1,4-butanediol kjedeforlenger.
- Bland én ekvivalent av polyolen PHNGAD (Mn ~ 1800 Da, 3,2 mmol) med to ekvivalenter av 4'4-metylenbis (fenyl-isocyanat) (6,4 mmol) i vannfritt N, N-dimetylformamid (12 ml).
- Omrør reaksjonsblandingen ved 70 ° C under en N2 atmosfære.
- Legg via sprøyte, dråpevis katalysatoren titan (IV) butoksid (0,8 vekt%).
- Etter 1 time, tilsett et ekvivalent av kjedeforlenger 1,4-butandiol (3,2 mmol). Økning av temperaturen ved 90 ° C og omrør i 24 timer under en N2 atmosfære.
- Etter reaksjonen, samle polyuretan ved utfelling ved tilsetning av dietyleter (heksan eller vann kan også brukes) dråpe vis til reaksjonsløsningen inntil utfelling inntreffer.
- Sentrifuger oppløsningen ved 5300 xg i 5 min.
- Dekanter supernatanten og tørk ved 40 ° C i en vakuumovn før løsningsmiddelet fordamper.
Merk: For å sikre at sluttproduktet av reaksjonen har de riktige parametere med hensyn til molekylvektsfordeling, som er funksjonell groups av polymeren, og smelte og glassovergangstemperatur, kan forskjellige analytiske teknikker og metoder som brukes, slik som gelpermeasjonskromatografi eller fitr spektroskopi.
3. Utarbeidelse av PU134 Solutions
- Vei 200 mg PU134 inn i en glassflaske.
- Fortynn PU134 til en sluttkonsentrasjon på 2% i en rekke løsningsmidler: kloroform, en blanding av kloroform og toluen i forholdet 1: 1, tetrahydrofuran, og kombinasjoner av tetrahydrofuran og diklormetan i forholdet 1: 1.
Merk: Valg av riktig løsemiddel varierer avhengig av polymer å bruke. Forskjellige løsningsmidler har forskjellige kokepunkter som kan påvirke oppløseliggjøring av polymeren. - Rist kraftig i oppløsningen i 20 min ved RT ved bruk av en rister ved en hastighet på 200 MOT / min, inntil oppløsningen blir homogen, og ingen utfelling blir observert.
4. Coating av glassplater med PU134
- Plasser en Round 15 mm 2 dekkglass på spin coater.
- Påfør 50 pl av den PU134 løsning til hver ved hjelp av en pipette. Juster volumet på PU134 løsning etter for ønsket dekkstørrelse holde volumet til overflaten ratio proporsjonal.
- Snurr hver dekkglass for 7 sek på 23 x g.
- Air tørr dekkglass ved RT i minst 24 timer før sterilisering.
5. Bestråling av Cover
- Gamma-bestråles polymerbelagt dekkglass ved å bruke en dose på 10 Grays ved hjelp av en laboratorie irradiator i 12 min.
- UV-bestråles polymer belagte dekkglass ved hjelp av en 30 W UV-pære i 16 min hver side.
- Plasser polymer belagte dekkglass i et egnet vevskultur plate i henhold til størrelsen lysbilde.
6. Scanning elektronmikroskopi
- Gull belegge polymer dekkglass ved katodeforstøvning i 200 sekunder i en atmosfære av 5 x 10 -1 millibar trykk.
- Fang micrographs av polymer belagt dekkglass med en scanning elektronmikroskop i et akselererende spenning på 20 kV i sekundærelektronavbildningsmodus.
7. Atomic Force Mikros Observasjoner
- Scan et område på 20 x 20 mikrometer i polymeroverflaten.
- Sett opp en scan rate fra 1,32 Hz til 1,60 Hz.
- Sett opp en oppløsning på 512 x 512 piksler i det skannede regionen.
- Beregn root mean square (RMS eller Rq) av belegget ved hjelp av gjennomsnittet av høydeavvik tatt fra den midlere bildedata planet, uttrykt som:
Hvor Zi er gjeldende Z verdi og N er antall poeng innen den gitte området. - 7.5 Beregn avviket eller midlere overflateruhet (Ra) av bildet ved hjelp av,
Hvor Z (x) er den funksjon som beskriver toverflaten han profil analysert i forhold til høyden (Z) og posisjon (x) av prøven i løpet av evalueringslengden "L". Ra representerer den midlere verdi av overflaten i forhold til midtplanet.
8. Cell Kultur og differensiering
- Kultur og differensiere den humane embryonale stamceller linje (hESC) H9 som beskrevet i Hay 17.
- Løsne cellene ved hjelp av en dissosiasjon reagens og replate dem på PU134 belagte lysbilder på dag 9 av differensieringen prosessen, i nærvær av et serumfritt medium som beskrevet i Szkolnicka 18,19.
Merk: Bruken av en enzymatisk celledissosieringsmedium er foretrukket å fysisk celle avløsning.
9. cytokrom P450 funksjonsanalysen
- Mål CYP3A aktivitet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Inkuber hESC avledet hepatocytter ved dag 13 eller dag 19, og medier uten celler - som en negativ kontroll, med riktig substrspiste i 5 t ved 37 ° C.
- Samle Supernatantene fra celler og media, gjennomføre analysen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Måle nivået av CYP aktivitet og normalisert i forhold til det overflateareal (cm 2).
10. Immunostaining
- Vask hESC avledet hepatocytter med PBS, 1 min, gjenta to ganger.
- Legg iskald 100% metanol for å løse cellene, sted i -20 ° C i 10 min.
- Vask cellene med PBS i 5 min, og gjentas to ganger.
- Inkuber cellene med PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA i 1 time ved RT.
- Aspirer PBST løsning og legge den aktuelle primære antistoff fortynnet i PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, inkuber ved 4 ° C med forsiktig omrøring O / N.
- Vask cellene med PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA i 5 min og gjenta tre ganger.
- Fortynn den aktuelle antistoff i PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, legge til cellene og inkuberes i mørke ved RT i 1 time med forsiktig omrøring.
- Vask cellene med PBS i 5 min og gjenta tre ganger.
- Legg MOWIOL 488 (som inneholder DAPI 1: 1000) til hver brønn, legge til en dekk forsiktig for å redusere antall luftbobler. Lagres fast celler ved 4 ° C i mørket. Observer flekker ved hjelp av et mikroskop med passende filter og lysrør. Den optimaliserte primære og sekundære antistoffer er oppført i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polymerløsningsmidlet påvirker topografien av polymeren belagte overflaten
Polyuretan 134 ble oppløseliggjort i kloroform, enten alene eller i kombinasjon med toluen eller tetrahydrofuran eller diklormetan, og de glassplater spin-belagt med de forskjellige formuleringer. Scanning elektronmikroskopi (SEM) og atomic force microscopy (AFM) ble brukt for å karakterisere de fysikalske egenskaper for de polymere belegg (figur 1). Den oppnådde ved å bruke toluen eller kloroform belegg var ikke homogent, noe som viser et ujevnt belegg med PU134 nedbør (figur 1A). I kontrast, tetrahydrofuran var et egnet løsningsmiddel slik at spin-belegg av en mye mer enhetlig overflate (figur 1A). Overflatetopografi ble målt ved hjelp av AFM rotmiddelkvadrat (RMS) og den midlere ruhet (Ra). PU134 oppløst tetrahydrofuran viste en 40% reduksjon i grovheten i forhold til the andre løsemidler (Figur 1B og 1C). Disse data viser at bruk av tetrahydrofuran som løsningsmiddel gir et mer ensartet belegg av PU134 for biologisk anvendelse.
Polymer topografi har en betydelig innvirkning på hepatocytter funksjon
hESC kan effektivt differensiert til lever endoderm in vitro, viser mange av funksjonene som finnes i den voksne lever 17-20. Hepatisk endoderm differensieringen ble indusert og ved dag 9 hepatoblast-lignende celler var åpenbar, med de fleste av cellene som uttrykker cytokeratin 19 (99% ± 1,2), α-fetoprotein (99% ± 0,6), og lever nukleær faktor 4α (97% ± 2.6); og lave nivåer av albumin (20% ± 1,7) (figur 2). På dette punkt ble cellene frittliggende ved hjelp TrypLE uttrykke og replated på de forskjellige polymer belagte overflater. Som et mål for metabolsk funksjon, cytokrom P450 function ble målt 4 dager post-replating. Vi observerte en to-fold økning i metabolsk aktivitet i celler replated på tetrahydrofuran / PU134 malte overflater (figur 3). Disse resultatene viser at hepatocytter hESC avledet metabolske aktivitet er forbedret med en mer ensartet belegg av PU134, dette er i samsvar med tidligere tilnærminger 21.
Overflatesteriliserings virkninger på de bioaktive egenskaper av polymeren
Effekten av sterilisering på PU134 ytelse ble også undersøkt. Polymer belagte objektglass ble eksponert for UV-eller gamma-bestråling. Fase kontrast avbildning av PU134 belagt glassplater viste ingen brutto forskjeller poste UV eller gammastråling (figur 4A). Disse observasjonene ble ytterligere bekreftet ved SEM-analyse (Figur 4B). De biologiske resultatene av PU134 ble undersøkt ved hjelp hESC avledet hepatocytter 10 dager etter replating. hESC avledethepatocytter replated på γ-utstrålt PU134 belagt glass lysbilder vises en 3-dobling av CYP3A aktivitet over celler replated på UV-utstrålt PU134 belagte glassplater (Figur 4C). Disse observasjonene viser at gamma-bestråling var den optimale sterilisering teknikk for vårt formål.
Figur 1. Optimalisering av polyuretan 134 belagt overflate. (A) glassplater ble belagt med en 2% løsning av PU134 oppløses i forskjellige oppløsningsmidler. Scanning elektronmikroskopi (SEM) bilder av de forskjellige belagte glassplater viser tilstedeværelse av en homogen belagte overflate og fravær av polymeren utfelles når tetrahydrofuran ble anvendt sammenlignet med toluen, kloroform eller blandinger av oppløsningsmidlene (sorte og hvite piler). Bildene ble tatt på x1664 forstørrelse og skalerer barer ar e vist nedenfor bildene. (BC) Atomic Force Mikroskopi (AFM) ble ansatt for å analysere grovheten av de PU134 malte overflater på utvalgte løsemidler. Analyse av ruhet parametere RMS (roten mean square) (B) og RA (den midlere ruhet) (C) av de forskjellige PU134 belagte overflater viser at belegget oppnås ved å bruke tetrahydrofuran som oppløsningsmiddel hadde den glatteste overflate sammenlignet med den Resten av betingelsene (n = 7). Dataene er uttrykt som middelverdi ± SD, er p <0,05 betegnet *, p <0,01 er betegnet ** og p <0,001 er betegnet ***, målt ved studenter t-test sammenlignet med lysbilder belagt med PU134 oppløseliggjort i tetrahydrofuran. Feilfelt representerer en standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Karakterisering av hESC avledet hepatoblasts. Immunocytochemistry viser uttrykk for lever markører AFP, CK19, HNF4α og albumin i hESC (H9) utledet lever endoderm. Negative kontroller ble utført med tilsvarende immunglobulin G (IgG) og representative bilder vises. Prosentandelen av positive celler og standardavvik ble beregnet fra minst fem tilfeldige synsfelt som inneholder minst 300 celler per view. Bildene ble tatt ved 20X forstørrelse. Data blir uttrykt som gjennomsnitt ± sd Feil søylene representerer en standardavvik. HNF4α, hepatocytter nukleær faktor 4α; AFP, α-fetoprotein; ALB, Albumin; CK19, Cytokeratin 19, IgG geit, immunoglobulin G anti-geit, IgG mus, immunoglobulin G anti-mus. Vennligst klikk her for å se en større Versipå denne figuren.
Figur 3. Funksjonelle konsekvenser av topografi PU134 belagte overflaten på funksjon av hESC avledet hepatocytter. Måling av cytokrom P450 3A aktivitet på hESC-avledet hepatocytter opprettholdes i 96 timer på glassplater belagt med PU134 oppløst i ulike løsemidler. En forbedring i den i cytokrom aktivitet på celler opprettholdt på PU134 belagte glassplater oppløseliggjøres med tetrahydrofuran (n = 6). Dataene er uttrykt som middelverdi ± sd, p <0,05 er betegnet *, p <0,01 er betegnet ** og p <0,001 er betegnet ***, målt ved studenter t-test sammenlignet med hESC avledet hepatocytter opprettholdt på objektglass belagt med PU134 oppløseliggjøres på tetrahydrofuran. Feilfelt representerer en standardavvik.
Bilder Figur 4. Optimalisering av steriliseringen av de belagte overflater. Fasekontrast (A) eller SEM-bilder (B) viser ingen grove forskjeller i PU134 belagte overflaten mellom γ-stråling eller behandlinger UV-stråling (UV). Fase bilder kontrast ble tatt på 40X forstørrelse og SEM bilder på 1,664X forstørrelse. (C) Analyse av cytokrom P450 3A aktivitet på hESC avledet hepatocytter opprettholdt i 10 dager på PU134 belagt glassplater. En økning i cytokrom P450 3A aktivitet i celler replated på γ-utstrålt PU134 belagte glassplater sammenlignet med celler replated på UV utstrålt PU134 belagt glassplater. Enheter av aktiviteten er uttrykt som relative lysenheter (RLU) -1 cm -2 ml av kulturoverflaten (n = 3). Dataene er uttrykt som middelverdi ± sd, p <0,001 is betegnet *** målt av studenter t-test i forhold til hESC avledet hepatocytter vedlikeholdt på PU134 belagt glass Dekk steriliseres ved γ-stråling. Feilfelt representerer en standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Primære antistoffer | |||
| Antigen | Type | Selskapet | Fortynning |
| HNF4α | Kanin polyklonale | Santa Cruz | 1/100 |
| Albumin | Monoklonalt | Sigma | 1/500 |
| AFP | Monoklonalt | Abcam | 1/500 |
| Cytokeratin 19 | Monoklonalt | Dako | 1/50 |
| IgG | Monoklonalt | Dako | 1/500 |
| Sekundære antistoffer | |||
| Anti-kanin 568 Alexa Flour | Goat | Invitrogen | 1/400 |
| Anti-mus 488 Alexa Flour | Rabbit | Invitrogen | 1/500 |
Tabell 1. Liste over optimalisert primære og sekundære antistoffer og konsentrasjoner brukt i denne studien. HNF4α, hepatocytter nukleær faktor 4α; AFP, α-fetoprotein; IgG, immunoglobulin G.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange av dagens metoder som brukes til å generere hepatocytter fra stamceller stole på udefinerte matriser av animalsk opprinnelse. Slike underlag kan være kostbart og svært variabel, påvirker cellefunksjon og stabilitet, som representerer en betydelig barriere for søknaden. Derfor gjennomførte vi en skjerm for syntetiske materialer som støtter kulturen i stamcelle avledet hepatocytter. Vi har identifisert en enkel polyuretan (PU134), dannet ved polymerisering av PHNGAD, MDI, og et drøyemiddel, som i kombinasjon med en robust hepatocytter differensiering tilnærming, stabiliserer hepatocytter fenotype og forbedrer cellefunksjon sammenlignet med 15 matrigel.
Håndtering av eksisterende biologiske matriser, som vanligvis brukes i dyrking og differensierende stamceller som vitronectin 22, laminin 521 23 eller matrigel, er effektiv for kortvarig vedlikehold. I kontrast, PU134 malte overflater gir en overlegen substrat for hepatocyte kultur. Videre har optimalisering av overflatetopografi og polymer sterilisering ført til ytterligere forbedringer i celle ytelse, en nøkkelfaktor i å levere humane lever modeller i stor skala med pålitelig ytelse.
Naturen av kjedeforlenger og fenylisocyanat representerer en av de kritiske trinn i prosessen; som eliminering eller erstatning av noen av komponentene ville i betydelig grad svekke polymeroverflaten og derfor cellulær festing og funksjonell aktivitet av stamcelle avledet hepatocytter. Sammensetningen av polymeren påvirker fysikalske parametre som elastisitet og fuktbarheten 24, som har virkninger på polymerens kapasitet til å absorbere nøkkel ekstracellulære matriksproteiner som er involvert i hepatocytter funksjon. I tillegg er variasjoner i katalysator, reaksjonstid og temperatur påvirker molekylvektfordelingen av polymeren.
Valget av løsningsmidlet for å oppløse polymeren representerer et annet kritisk punkt i innhenting av en optimalisert polymerbelagt overflate. Vi har observert at arten av det løsningsmiddel påvirker topografien av den belagte overflate, som har direkte betydning i funksjonen av cellene 25-31. I tillegg er den roterende tid og hastighet er også avgjørende for å oppnå denne ensartede og homogene belegg. Et annet trinn for å ta i betraktning er steriliseringsprosedyre anvendes på polymerbelagt overflate, som aktiviteten av cellene kan bli påvirket av steriliseringsbehandling anvendes. Dette kan være på grunn av tilstedeværelsen av følsomme område (r) innenfor strukturen av polymeren til forskjellige steriliseringsprosedyrer 32-34.
Gjeldende pluripotente stamcellebaserte cellemodeller har fenotypiske og funksjonelle begrensninger. Vi tror at dette er optimalisert polymerbelagt overflate representerer et fremskritt i feltet, å omgå noen av de begrensninger som er forbundet med bruk av biologisk substpriser. Videre er muligheten for å bruke polymeren i 3D matriser til å støtte festing av forskjellige celletyper som finnes i vevet av interesse, kan ytterligere forbedre celle gjengivelse.
I konklusjonen, er bruken av syntetiske materialer blir stadig viktigere i levering av menneskelig soma fra pluripotente stamceller. Vi har utviklet en optimalisert overflate og belegg prosedyre som er robust og pålitelig leverer funksjonelle humane hepatocytter med betydelige konsekvenser for cellebasert modellering og regenerativ medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DCH er CSO, direktør, gründer og medeier i FibromEd Products Ltd MB og JPI er grunnlegger aksjonærer i FibromEd Products Ltd
Acknowledgments
DCH, MB og FK ble støttet av en EPSRC Følg på fondet. BL-V og DS ble hver støttet av MRC Doktorgradsstipend. KC ble støttet av midler fra Storbritannia regenerativ medisin Platform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips | |||
| Shaker | Edmun Bühler | KS-15 | |
| Irradiator | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| Spin coater | Specialty Coating System | P-6708 | |
| Scanning Electron Microscope | Philips | XL30CPSEM | |
| Atomic Force Microscope | DimensionV Nanoscope, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| UV bulb | ESCO | ||
| NanoScope analysis software | VEECO | version 1.20 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | TH45200 | Use Volocity 4 Software |
| Tissue culture plates | Corning, UK | 3527 | |
| glass slides | Scientific Laboratory Supplies | MIC3308 | |
| Diethylene glycol | Sigma–Aldrich | 93171 | |
| 1,6-hexanediol | Sigma–Aldrich | 240117 | |
| Neopentyl glycol | Sigma–Aldrich | 408255 | |
| Adipic acid | Sigma–Aldrich | 9582 | |
| anhydrous N,N-Dimethylformamide | Sigma–Aldrich | 227056 | |
| Diethyl ether | Sigma–Aldrich | 676845 | |
| titanium (IV) butoxide | Sigma–Aldrich | 244112 | |
| 1,4-butanediol | Sigma–Aldrich | 493732 | |
| Vacuum oven | Thermoscientific | ||
| 4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) | Sigma–Aldrich | 101688 | |
| Tetrahydrofurane | Sigma–Aldrich | 401757 | |
| Sputter coater | Bal-Tec SCD 050 | ||
| Inmunostaining | |||
| Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) | Gibco | 10010031 | Store at room temperature |
| PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 | Scientific Laboratory Supplies Ltd | EC607 | |
| Methanol | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, UK | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions |
| Cell culture and Functional assay | |||
| CYP3A activity pGLO kit | Promega | V8902 | |
| Hepatozyme | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 | |
References
- Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).
- Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).
- Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).
- Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26 (19), 4171-4179 (2005).
- Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50 (7), 645-652 (2006).
- Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (1), 13-22 (2013).
- Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3 (3), 034112 (2008).
- Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32 (12), 3220-3232 (2011).
- Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30 (6), 1045-1055 (2009).
- Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31 (8), 2216-2228 (2010).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4 (1335), (2013).
- Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).
- Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).
- Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1 (1), 50-53 (2012).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (34), 12301-12306 (2008).
- Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
- Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).
- Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33 (1-2), 15-30 (1998).
- Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5 (3195), (2014).
- Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25 (1), 336-370 (2003).
- Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
- Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116 (10), 1881-1892 (2003).
- Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231 (1), 28-37 (2008).
- Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5 (4), 273-280 (2006).
- Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28 (1), 1806-1819 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19 (19), 2775-2779 (2007).
- Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23 (3), 305-311 (2013).
- Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).
- Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).
