Summary
طريقة ثقافة ثلاثية الأبعاد الموصوفة في هذا البروتوكول يلخص التنمية البنكرياس من الأسلاف المتفرقة الجنينية الماوس البنكرياس، بما في ذلك توسعها الكبير، والتمايز والتشكل في هيئة متفرعة. هذا الأسلوب هو قابل للتصوير، والتدخل الوظيفية والتلاعب في مكانه.
Introduction
يوفر الجهاز الثقافة نموذجا مفيدا أن يسد الفجوات بين المجمع ولكن ذات أهمية كبيرة في التحقيقات المجراة والمحاكاة مريحة ولكن التقريبية للنماذج خط الخلية. في حالة البنكرياس، وليس هناك خط الخلية يعادل تماما لالأسلاف البنكرياس على الرغم من أن هناك يتم تحويل خطوط الخلايا محاكاة خلايا الغدد الصماء وإفرازات. لا يمكن تربيتها الكبار البنكرياس كله؛ يمكن الحفاظ على الجزر المعزولة الغدد الصماء لبضعة أسابيع دون تكاثر الخلايا ويمكن أن تظل شرائح الأنسجة في المختبر لبضع ساعات 5. وقد الثقافة البنكرياس الجنينية المستخدمة على نطاق واسع ليس فقط لدراسة تطورها، ولكن أيضا للتحقيق في الظهارة الوسيطة التفاعلات 4،6،7، لصورة يعالج 8 أو التدخل كيميائيا معهم 9. وتستخدم طريقتين ثقافة الجهاز أساسا: الأول يتمثل في زراعة براعم البنكرياس على فبرونيكتين المغلفة لوحات 2، وهو محول،nient لأغراض التصوير؛ الخيار الثاني هو الثقافة الأجهزة على مرشحات في واجهة الهواء السائل 3،4 الذي يحافظ على أفضل التشكل. على الرغم من المفيد جدا، وهذه الأساليب تؤدي إلى درجة معينة من تسطيح؛ توسيع الأسلاف محدودة جدا بالمقارنة مع التطور الطبيعي والسكان بدءا معقد يضم جميع أنواع خلايا البنكرياس وخلايا اللحمة المتوسطة.
القدرة على الثقافة، وتوسيع الخلايا الأولية فرقت هو قيمة لدراسة علاقات النسب وكشف الخصائص الذاتية من أنواع الخلايا المعزولة 10. سوغيياما وآخرون 11 يمكن الحفاظ على الأسلاف البنكرياس والغدد الصماء الأسلاف التي احتفظت بعض الشخصيات الفنية لمدة 3-5 أيام في الثقافة على طبقات المغذية. Pancreatospheres، أقرب إلى neurospheres 12 و 13 mammospheres، تم توسيع من الجزر الكبار وخلايا الأقنية على الرغم من أن طبيعة الأسلاف / الخلايا الجذعيةالتي تولد هذه المجالات ليست واضحة. بالإضافة إلى ذلك، في تناقض مع التنمية الفسيولوجية، تضمن pancreatospheres بعض الخلايا العصبية 14،15. كما أنتجت مؤخرا المجالات من الأسلاف البنكرياس الجنينية 16،17 وتجديد 18 بنكرياسات جيدة مع التوسع السلف والتمايز لاحقة لكنها فشلت في ألخص التشكل.
3D نماذج من الخلايا المتفرقة وغالبا ما تعرف أن تنظيم الذاتي في الأجهزة المنمنمة ازدهرت مؤخرا ومحاكاة تطوير أو الكبار دوران أجهزة متعددة مثل الأمعاء 19،20، 21 المعدة، والكبد 22، 23 البروستاتا والقصبة الهوائية 24. في بعض الحالات، وقد لخص التشكل التنموية والتمايز في 3D من خلايا ES، كما هو الحال بالنسبة للأكواب البصرية 25، 26 الأمعاء أو الدماغ 27.
هنا، ونحن قصرcribe طريقة لتوسيع فصلها الأسلاف البنكرياس متعددة القدرات في سقالة 3D Matrigel حيث يمكنهم تمييز وتنظيم الذات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويهدف هذا البروتوكول لتنمو organoids البنكرياس المستمدة من الفئران E10.5 فصل الخلايا الظهارية البنكرياس.
البروتوكول يتطلب موافقة أخلاقية لإجراء التجارب على الحيوانات.
1. تشريح الظهرية البنكرياس برعم من E10.5 أجنة الفئران
- التضحية الفئران توقيت الحوامل في اليوم الجنينية (E) 10.5، وفتح البطن مع زوج من مقص، وإزالة قرني الرحم ووضعها في طبق بتري 10 سم مليئة الفوسفات عازلة المالحة الباردة (PBS) أو تعديل Dulbecco المتوسطة الأساسية (DMEM) أبقى على الجليد. يتم التجربة الإجمالية من التضحية لبذر خلية في 60-90 دقيقة لمنع تلف الخلايا.
- فصل الرحم إلى أجزاء الجنين الفردية باستخدام مقص صغير. نقل جنين واحد إلى طبق بيتري 35 ملم مع PBS الباردة وتصور تحت المجهر تشريح مع إضاءة من فوق. مع ملقط تشريح إزالة المحيطة العضلات، والساقط وصفار ساج وفضح الجنين. وضع الجنين مرة أخرى إلى الباردة المتوسطة DMEM. يمكن بسهولة نقل الأجنة باستخدام 3 مل ماصة نقل البلاستيك / بالقطارة. عزل كل فرد الجنين بطريقة مماثلة قبل المتابعة.
- وضع الجنين في طبق بتري 35 مم نظيفة في برنامج تلفزيوني.
- استخدام ملقط رقيقة (0.05 ملم عرض) لإزالة forelimb. إدراج بلطف ملقط في افتتاح لفصل الجهاز الهضمي من منطقة النخاع الشوكي (الشكل 1). اختياري: لمشاهدة أكثر سهولة المعدة، وإزالة الجزء العلوي من الجسم للجنين، وصولا الى قلب ومنطقة الذيل أدناه ساق صفار.
- تحديد موقع المعدة والكبد والأمعاء. باستخدام ملقط، عزل القناة الهضمية من المعدة إلى الأمعاء ووضعه في DMEM الباردة على الجليد (الشكل 1). يتم إرفاق برعم البنكرياس الظهرية ظهريا، الخلفي إلى المعدة (الشكل 1).
- عزل كل الجهاز الهضمي الفردية في سيميبطريقة لار قبل المتابعة. إذا في حاجة إلى أن الأجنة مرمزة بالجينات، وجمع الذيل في وقت تشريح والحفاظ على كل الجهاز الهضمي الفردية في بئر مختلفة في 24 لوحة جيدا مع DMEM الباردة على الجليد.
- وضع الجهاز الهضمي واحدة في طبق بيتري 35 ملم نظيفة في برنامج تلفزيوني الباردة. الآن استخدام الإضاءة من الأسفل في حقل مشرق لتصور وتشريح الظهرية برعم البنكرياس تحت المجهر تشريح. هذه الشروط سوف تحسين التصور من وحدات التخزين. باستخدام الإبر التنغستن شحذ الكهربائي أو 20 G الإبر المحاقن، وعزل برعم البنكرياس مع اللحمة المتوسطة أقل قدر ممكن حول ظهارة (الشكل 1).
- نقل برعم معزولة في طبق بتري تحتوي على حل dispase الباردة (1.25 ملغ / مل) لمدة 2-3 دقيقة. من هذه النقطة، يمكن لمعظم مريح أن يتم نقل مع انسحاب الشعلة 50 الشعيرات الدموية الزجاج ميكرولتر تعلق على أنبوب مرن التي تسيطر عليها الفم. بدلا من ذلك، ولكن مع مزيد من ريكورونا فقدان مهدها، استخدم 10 ميكرولتر ماصة أوتوماتيكية (Pipetman) مع نصائح البلاستيك المناسبة.
- أداء البنكرياس تطلع برعم وطرد تحت السيطرة المجهرية. وضع برعم البنكرياس مرة أخرى في برنامج تلفزيوني. مزيد من تنظيف برعم البنكرياس معزولة من اللحمة المتوسطة مع الإبر والتطلع لطيف باستخدام الزجاج الشعرية (الشكل 1).
- عند إزالة اللحمة المتوسطة بأكملها، شطف برعم البنكرياس في برنامج تلفزيوني الباردة؛ نقل كل برعم إلى DMEM الباردة في الآبار الفردية (60 جيدا صواني صغيرة مليئة 10 ميكرولتر من DMEM الباردة). فمن المهم عدم إزالة اللحمة المتوسطة في dispase، مما يجعل الأنسجة لزجة جدا.
2. الطلاء وثقافة خلايا متناثرة
- نقل ظهائر تشريح من جميع الأجنة مع كوب الشعرية سحبت اللهب في آبار المخروطية من 60 جيدا صواني صغيرة مليئة 10 ميكرولتر PBS للشطف.
- نقل برعم في 10 ميكرولتر من التربسين 0.05٪ لالثانية السماح لها احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. إبطال نشاط التربسين عن طريق نقل برعم في بئر مع 10 ميكرولتر DMEM + 10٪ مصل العجل الجنين (FCS).
- فصل في تعليق خلية بواسطة الطموح من خلال الشعيرات الدموية رقيقة وانسحبت مع ساحبة ماصة. من المهم تجنب فقاعات في هذه المرحلة في حين pipetting صعودا وهبوطا لفصل الخلايا. organoids البنكرياس تبدأ على النحو الأمثل من مجموعات صغيرة من 5-15 الخلايا وينصح بالتالي التفكك الجزئي (الشكل 1).
- تجميع الخلايا من العديد من الأجنة في أنبوب إيبندورف من أجل تقليل الاختلافات بسبب المعالجة الفردية. تمييع تعليق خلية في Matrigel المبردة بنسبة 01:03. قسامة هذا الخليط لوحة 96 جيدا، 8 ميكرولتر / جيد أو في لوحة الأمثل للتصوير (انظر أدناه).
- احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والسماح للMatrigel لرشاقته. ملء الآبار مع 70 ميكرولتر من المتوسط من خيار (عضوي أو المجال، راجع تبويبليه 1 و 2) وترك في بيئة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 و 95٪ الهواء في 37 درجة مئوية.
- استبدال المتوسطة كل يوم 4 ال. رصد المستعمرات البنكرياس يتزايد يوميا وتوثيق هذه العملية عن طريق التصوير.
- جزيئات صغيرة من البروتينات أو الفائدة يمكن أن تضاف إلى وسيلة في هذه المرحلة للتجارب التدخل، كما ذكرت سابقا 28.
الجدول 1: متوسط عضوي.
| اسم المادة | الأسهم تركيز | التركيز في النهائي المتوسطة | حجم المخزون |
| البنسلين، الستربتوميسين | 100٪ | 1٪ | 50 ميكرولتر |
| خروج المغلوب استبدال المصل (تكملة) | 100٪ | 10٪ | 500 ميكرولتر |
| 2 المركابتويثانول | 14.3 M 0.1 ملي | 1 ميكرولتر | |
| Phorbol ميريستيت خلات (سلطة النقد الفلسطينية) | 16 ميكرومتر | 16 نانومتر | 5 ميكرولتر |
| Y-27632 (ROCK المانع) | 50 ملي | 10 ميكرومتر | 1 ميكرولتر |
| صندوق تعديل العولمة الأوروبي | 50 ميكروغرام / مل | 25 نانوغرام / مل | 2.5 ميكرولتر |
| المؤتلف الإنسان R-spondin 1 | 250 ميكروغرام / مل | 500 نانوغرام / مل | 10 ميكرولتر |
| - أو - | |||
| المؤتلف ماوس R-spondin 1 | 250 ميكروغرام / مل | 500 نانوغرام / مل | 10 ميكرولتر |
| المؤتلف FGF1 الإنسان (aFGF) | 100 ميكروغرام / مل | 25 ميكروغرام / مل | 1.25 ميكرولتر |
| الهيبارين (Liquemin) | 2500 U / مل | 2.5 U / مل | 2 ميكرولتر |
| الذي أوصتbinant FGF10 الإنسان | 100 ميكروغرام / مل | 100 نانوغرام / مل | 5 ميكرولتر |
| DMEM/F-12 | 4،412.25 ميكرولتر | ||
| مجموع | 5،000 ميكرولتر |
الجدول 2: المجال المتوسطة.
| اسم المادة | الأسهم تركيز | التركيز في النهائي المتوسطة | حجم المخزون |
| البنسلين، الستربتوميسين | 100٪ | 1٪ | 50 ميكرولتر |
| B27 X50 (تكملة) | 100٪ | 10٪ | 100 ميكرولتر |
| المؤتلف FGF2 الإنسان (bFGF) | 100 ميكروغرام / مل | 64 نانوغرام / مل | 3.2 ميكرولتر |
| Y-27632 (ROCK المانع) | 50 ملي | 10 ميكرومتر | 1 ميكرولتر |
| DMEM/F-12 | 4845.8 ميكرولتر | ||
| مجموع | 5000 ميكرولتر |
3. التصوير من التقدم التنمية عضوي
- organoids الصورة إما يوميا أو حسب وقت الفاصل بين المجهري باستخدام المجهر الفلورسنت مرور الزمن. لوقت التصوير مرور، استخدم XY (Z) الآلي المجهر الفلورسنت المقلوب.
- قطرات صغيرة من إيداع 3 ميكرولتر في لوحات 4 جيدا أو لوحات من الزجاج السفلي مليئة 2-5 مل المتوسطة. صورة مع الهدف 10X لمسافات طويلة. ملاحظة: الفئران المعدلة وراثيا معربا عن استشفاف الفلورسنت يمكن استخدامها. الفيلم 1 يبين على سبيل المثال التوسع الأولي لorganoids من Pdx1-Ngn3-ER-TM-IRES nGFP + الفئران 4. وGFP النووية تمكن المستخدم من تتبع الخلايا ككائنات فردية ولكن مبادئ مماثلة يمكن تطبيقها على تتبع الخلايا مع مضان غشاء مثلكما طن / ملغ الفئران 29.
- بدء الوقت الفاصل بين التصوير 3 ساعة بعد البذر الخلايا لتجنب الانجرافات التركيز وضبط برامج التحكم في التشغيل الآلي لالتقاط صور 1 / ساعة لمدة 3 أيام أو أكثر في مواقع محددة يدويا. لكل موقف، والحصول على المقابل تدخل الفرق (DIC) صورة فضلا عن إشارة GFP، وتقديم التقارير الفلورسنت التعبير علامة.
4. استرداد Organoids لعلم الأنسجة
- وضع لوحة 96 جيدا على الجليد وإزالة المتوسطة، والاستعاضة عنها مع PBS الباردة الجليد. هذا depolymerizes جزئيا Matrigel.
- نضح بلطف كل عضوي الفردية، وإزالة Matrigel المحيطة باستخدام تلميح 1،000 ميكرولتر من أجل عدم تعطيل العمارة بشكل عام. نقل كل عضوي لبئر مع الثلج الباردة PBS. الحفاظ على لوحة على الجليد. التثبيت المباشر في Matrigel هو ممكن أيضا.
- إصلاح عضوي لمدة 15 دقيقة في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA)، cryopreserve في السكروز وتضمين ذلك في الجيلاتين. معالجة كلعضوي لcryosectioning والأنسجة كما هو موضح سابقا (يوهانسون وآخرون، 2007) 4.
5. استرداد Organoids لPCR والكيمياء الحيوية
- وضع لوحة 96 جيدا على الجليد وإزالة المتوسط. إضافة 60 ميكرولتر من RNAlater لكل بئر من أجل تحقيق الاستقرار وحماية الحمض النووي الريبي الخلوية.
- تعطيل هلام في كل ميكانيكيا بشكل جيد من قبل depolymerizing ذلك جزئيا على الجليد. إما استرداد organoids الفردية باستخدام تلميح 1،000 ميكرولتر من أجل عدم تعطيل البناء الشامل أو استرداد كامل جيدا (مع Matrigel) عن طريق تعطيل هلام ميكانيكيا مع 200 ميكرولتر غيض. استخدام غيض 1،000 ميكرولتر لنقل المحتويات جيدا إلى ريبونوكلياز خالية من غير لزجة أنبوب إيبندورف أبقى على الجليد.
- غسل الآبار مع 60 ميكرولتر RNAlater وإضافة المحتويات المتبقية لنفس أنبوب إيبندورف.
- تدور الأنابيب لمدة 5 دقائق في 500-1،000 XG في 4 درجات مئوية.
- إزالة طاف، ولم يتبق سوى 20-30 ميكرولترمن RNAlater في الأنبوب جنبا إلى جنب مع بيليه. لالكيمياء الحيوية، وتخزين العينات جافة قدر الإمكان.
- لا تجميد العينات في RNAlater فورا؛ تخزينها في 4 درجات ثاني / N (للسماح RNAlater لاختراق الأنسجة بدقة). ويمكن تخزين الأنسجة في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل ويمكن أن تتم معالجتها في وقت لاحق لتعطيل الأنسجة واستخراج كميات صغيرة من الحمض النووي الريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E10.5 الظهرية الأسلاف البنكرياس فصلها والمصنفة في 3D Matrigel ألخص التنمية البنكرياس. الأسلاف يمكن اتباعها بسهولة أكثر مع صحفيين الفلورسنت. في حالتنا استخدمنا الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين GFP النووية التي تسيطر عليها Pdx1 المروج (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (فيلم 1) في غياب تاموكسيفين، وبالتالي دون تفعيل Neurog3 4 (الشكل 2).
مع عضوي المتوسطة، والضغط الأولي من مجموعات صغيرة من الخلايا يحدث في الساعات الأولى. ويمكن بعد ذلك يتم الكشف عن التوسع من توسيع مجموعات في ال 4 الأيام الأولى (الشكل 2A). من يوم 5، تشكيل فروع في 20٪ أكبر من organoids. الخلايا وحيدة لا تفقد Pdx1 توسيع والتعبير في حين أن مجموعات كبيرة الاحتفاظ Pdx1 التعبير 28.
في هذه الظروف، الأسلاف الخضوع لالمواصفاتtacular التشكل مع ظهور هياكل الظهارية تشعبت. هذه العملية تتم فقط عندما يتم المصنفة الأسلاف في ≥ 4 مجموعات الخلايا، مما يدل على شرط قوي للإشارات المجتمع. يكشف التحليل النسيجي أنه بعد يوم 7 من الثقافة، وتتكون الناتجة مصغرة أجهزة الأسلاف البنكرياس (SOX9 + / HNF1B + / + الخلايا Pdx1: الشكل 3B) وخلايا متباينة معربا إما خارجية الإفراز (الأميليز +) أو الغدد الصماء (+ أو الأنسولين الجلوكاجون +) علامات (الشكل 3A، C). تمايز إلى خلايا الغدد الصماء هو أقل مما كانت عليه في البنكرياس الذاتية (حوالي 0.1٪)، ولكن يتم زيادة إلى 1٪ عندما لا يتم إضافة FGF1 إلى مستنبت 28. بشكل ملحوظ، ليس فقط الأسلاف المصنف تفرق في الأنساب البنكرياس المتوقع، ولكنها أيضا تعتمد بشكل عفوي العمارة البنكرياس الطبيعي. على الرغم Eلم يتم الاستقطاب 10.5 الأسلاف البنكرياس متعددة القدرات، والخلايا في الثقافة استقطاب كما يتضح من الفصل بين Mucin1 وaPKC في الغشاء التي تواجه التجويف المركزي وينظمون إلى شبكة أنبوبية متفرعة. إقليميا "غيض والجذع" المجالات الظهور: يتم ترجمة HNF1B + الأسلاف وخلايا الغدد الصماء في المنطقة الوسطى، في حين تقع خلايا عنيبية في محيط بمثابة تاج جزئية أو كاملة من الخلايا. يمكن الحفاظ على organoids في الثقافة لمدة 10 يوما؛ بعد هذه الفترة، فإنها تفقد عموما منظمتهم المعمارية وتصبح الكيسي (لا يظهر). ويمكن أن يتم الركض بعد التفكك الجزئي ولكن سرعان ما يؤدي إلى تشكل كيس، وهي الظاهرة التي يتم تقليل بإضافة من BMP المانع رأس 28.
مع المتوسطة المجال، والتوسع هو أكثر تواترا وينظر من 2٪ من الخلايا واحد؛ ومع ذلك كفاءة تشكيل المجال يرتبط حجم سيدىد 28 مجموعات. في يوم 2/3، تم الكشف عن التجويف في مجموعات صغيرة ويوسع بعد ذلك، مما أدى إلى حد كبير المجالات جوفاء أحادية الطبقات مع مناطق متعددة الطبقات المحلية عرضية (الشكل 2B). هذه المجالات تنهار عند استردادها من Matrigel (الشكل 3D-H). في ظل هذه الظروف، وتتكون الهياكل الناتجة أساسا من الأسلاف البنكرياس، مع نسبة مئوية صغيرة من إفرازات الغدد الصماء وخلايا متباينة في يوم 7 (الشكل 3D-H). تصبح الأسلاف في مجالات الاستقطاب أيضا apically، كما يتبين من الفصل بين aPKC في الغشاء التي تواجه التجويف المركزي لجميع الخلايا (الشكل 3F). Pancreatospheres يمكن passaged مرتين على الأقل (لا يظهر).
الشكل 1. تمثيل تخطيطي من الاجراءه. يتم تشريح القناة الهضمية في البداية من الجنين، وبعد ذلك يتم عزل برعم البنكرياس الظهرية. تتم إزالة اللحمة المتوسطة وفصلها الأسلاف البنكرياس باستخدام التربسين. ثم يتم المصنفة الناتجة الخلايا فرقت جزئيا في انخفاض كثافة في النمو المنضب عامل Matrigel. مقياس القضبان: 1.00 ملم باستثناء الناجمة الصورة عضوي حيث شريط المقياس هو 200 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تقدم الثقافة على مر الزمن. (A) كتلة صغيرة من الأسلاف البنكرياس نمت مع عضوي المتوسطة واتباعها مع مرور الزمن المجهري من 3 ساعة بعد الطلاء، لمدة 60 ساعة. في بولوحات ttom، وعضوي بعد 7 أيام من الثقافة. شريط مقياس: 200 ميكرون؛ ينطبق على جميع لوحات في A. (B) مثال على المجال تليها في 60 ساعة الوقت الفاصل بين والقبض على يوم 7 من الثقافة. شريط مقياس: 200 ميكرون؛ ينطبق على جميع لوحات في B. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. الأنسجة. (AC) المقاطع من المسلسل لمدة 7 أيام لعضوي الملون السلف (B - HNF1B) والتمايز (A - الأميليز، C - الانسولين) علامات. يتكون من عضوي الظهارية (A - E-كادهيرين) والاستقطاب apically (B - mucin1) الخلايا. خط متقطع يتوافق مع المنطقة المركزية غير عنيبية (A)، حيثتم الكشف عن HNF1B (B) والغدد الصماء (C) خلايا (DH) أقسام من المجالات لمدة 7 أيام لالملون السلف. (G - HNF1B؛ H - SOX9) والغدد الصماء (D - الأنسولين والجلوكاجون) علامات. وتتكون مجالات الاستقطاب apically (D، F - aPKC) الظهارية (E - E-كادهيرين) الخلايا. شريط النطاق: 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإنتاج على نطاق واسع من خلايا بيتا وظيفية في المختبر لا تزال غير فعالة 1. في هذا السياق الصعب، قد تساعد الدراسات البيولوجيا التطورية فك رموز الإشارات الدقيقة التي مطلوبة من أجل تمايز الخلايا بيتا وظيفية. هذا البروتوكول يسمح للصيانة وتوسعة والتفريق بين الأسلاف البنكرياس الجنينية في المختبر. وهذا يشمل تكوين خلايا بيتا المنتجة للانسولين التي لا تشارك في التعبير عن هرمونات الغدد الصماء الأخرى، ومستويات عالية من Pdx1، والتعبير عن المؤيد لconvertases التي تستحق الانسولين والانسولين لديهم معالجة 28. العوامل الرئيسية الهامة داخل النظام هي نشاط جمعية جيل المستقبل (جمعية جيل المستقبل من خلال حفز خارجيا أضاف potentiated بواسطة الهيبارين) والشق (الذاتية) مسارات الإشارات، فضلا عن ROCK-تثبيط بواسطة Y-27632: في حالة عدم وجود هذه العوامل، لا غاية أو تم إنشاء عدد محدود من المجالات وorganoids 28. شرط لجمعية جيل المستقبل وليسومن المفهوم النشاط الفصل بسهولة على أساس أهميتها للتنمية البنكرياس في الجسم الحي 28. ROCK المانع يمكن أن تكون بديلا عن طريق blebbistatin، وبذلك تكشف أن hyperactivation ديناميات خييط على التفكك يؤدي إلى زيادة كل من موت الخلايا، وتثبيط قوية من السلف النسخ عامل Pdx1 وعدم التوسع. ومن المثير للاهتمام، وقد أثبتت العديد من المكونات الإضافية من المتوسطة عضوي ليكون لا لزوم لها بشكل فردي، ولكن أدى غيابهم مجتمعة في فقدان الظهارية المتفرعة 28. بالإضافة إلى بعض المكونات الأساسية للوسط، من المهم للسيطرة على مستوى تفارق من الأسلاف. في الواقع، يتم الترويج انتشار السلف وصيانة Pdx1 بشكل ملحوظ في مجموعات من أكثر من 4 الخلايا. ويمكن ملاحظة الضغط داخل ساعة 12 الأولى والفشل في النتائج المدمجة إلى الفشل في الحفاظ على Pdx1 والتوسع. المانع ROCK أمر ضروري لهذاالعملية.
في organoids حظة لا تشكل بعد الفرز FACS ولكن من المحتمل أن يتم تحسين كفاءة النظام عن طريق reaggregating عدد رقابة من الأسلاف. آخر عنصر حاسم من هذا النظام الثقافة هي مصفوفة 3D. الخلايا أو وضعت على Matrigel في Matrigel قريبة جدا من الجزء السفلي من لوحة انتشار وتفقد Pdx1 التعبير. على الأرجح يوفر Matrigel المكونات الكيميائية الحيوية، لا سيما laminin فضلا عن العظة الميكانيكية 28. في الواقع، وصلابة من المصفوفة يلعب دورا محوريا. الهلاميات المائية شديدة ليست متساهلة للالأسلاف البنكرياس صيانة وتوسيع 28 والمخففة Matrigel ليس سواء. عندما يتم تخفيف Matrigel 01:10 البنكرياس السلف لا يمكن أن يكون مثقف.
نظام عضوي يمكن استخدامها لاختبار آثار من الجزيئات الصغيرة والبروتينات المؤتلف على الأسلاف البنكرياس من حيث البقاء على قيد الحياة، وانتشار، والتمايز، والاستقطاب والمتفرعة28. يمكن أيضا أن تستخدم لاختبار تعاون أنواع مختلفة من الخلايا أثناء التطور البنكرياس 28. ونحن واثقون من أن إمكانية الحصول على خلايا البنكرياس السلف سيسمح أيضا التلاعب الجيني، مثل استهداف الفيروسية، كما رأينا في أنظمة عضوي أخرى 17،27. ويمكن استخدام هذا لفحص 17 مع النظام الذي يتيح التشكل على النقيض من المجالات التي سبق وصفها وكذلك هنا 16،17،28. شروط الثقافة وضعنا أيضا تقديم ميزة كونها خالية من الدم، وخالية من اللحمة المتوسطة والأوعية الدموية مما يقلل من تعقيد الخلوية والكيمياء الحيوية خالية من وحدة التغذية. ومع ذلك، هناك قيود في القدرة على تمرير organoids وبالتالي الحصول على كميات كبيرة من الأسلاف. هذا يمكن التحايل عليها في المستقبل من خلال التعديلات على بروتوكول لمراحل لاحقة من التطور حيث الأسلاف هي أكثر وفرة، إلى مصادر الأسلاف البنكرياس المنتجة من embryonالجذعية جيم (ES) الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها أو (آي بي إس) الخلايا. هذا يمهد الطريق لنموذج 3D التنمية البشرية البنكرياس.
هذا النظام يمكن أيضا يحتمل أن تستخدم لإنتاج خلايا البنكرياس في المستقبل المنظور من العلاج. في هذا السياق، فإن إنتاج خلايا بيتا وظيفية للزرع أن تساعد في علاج مرض السكري. ان التعديلات للنظام لES الإنسان أو خلايا الجذع من المهم لهذا الغرض. فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كان عضوي أو المجال الشروط التي ينبغي استخدامها. الظروف تسمح عضوي لإنتاج الخلايا التي لديها عدة خصائص خلايا بيتا الناضجة لكنها لا تزال وظيفتها لفحصها. ومع ذلك، وهذه الخلايا هي حاليا لا العديدة ويتم خلط بين الخلايا الأخرى. ومن المرجح أيضا أن ظهور مبكر من عدم التجانس في نظام عضوي غير المنضبط يؤدي إلى إشارات بين الخلايا وبالتالي فهو يضر الإنتاج.
Tانه نظام المجال الذي يحافظ الأسلاف من حيث المبدأ الأفضل للتوسع للرقابة والركض من الأسلاف ولكن يبقى التمايز في وقت لاحق أن يكون للرقابة. أنتجت مؤخرا pancreatospheres الآخرين التي يمكن أن تكون متمايزة بكفاءة. سيكون من المهم للمقارنة بين طبيعة المجالات التي تم الحصول عليها في البروتوكول الحالي يخلو من مغذيات والمصل إلى المجالات التي تم الحصول عليها مع غيرها من البروتوكولات 16،17. من جهة نظر علاجية، ومدى تعقيد وأصل بيولوجي من Matrigel قد تشكل مسألة استنساخ والصحة وتطويره. وقد أظهرت النتائج الأولية أن الهلاميات المائية لينة بين functionalized مع laminin تبيحه للتوسع السلف البنكرياس في المختبر. مطلوب مزيد من التحسين حيث أن هذه المواد الهلامية ليست فعالة مثل Matrigel 28 حتى الآن.
إنتاج خلايا بيتا في سياقها الطبيعي ويمكن أيضا يحتمل أن تكون مفيدة لاختبار العقاقير التي تعزز بيتانشاط الخلايا أو زيادة بقائهم على قيد الحياة أو انتشار لهذا الغرض ولكن سيكون من المهم لاختبار أول درجة نضج خلايا بيتا، لزيادة كفاءة التمايز وإلى اختبار ما إذا كانت الظروف الثقافة المقدمة هنا أفضل الحفاظ على الجزر من الحالية التعليق الثقافات. يمكن أن تنتج إفرازات البنكرياس تكون مفيدة في تطوير عقاقير لاستهداف سرطان البنكرياس والتهاب البنكرياس أيضا. هنا مرة أخرى، يحتاج درجة من النضج من الخلايا الإفرازية المنتجة ليتم التحقيق بدقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل بالتتابع حدود NCCR في جائزة رائد علم الوراثة، الأحداث السكري أبحاث مؤسسة جرانت 41-2009-775 والمنح 12-126875 من ديت Frie Forskningsråd / Sundhed عوج Sygdom. المؤلفين أشكر مختبر Spagnoli لاستضافة تصوير الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock kept at -20 °C |
| KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock kept at -20 °C |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock kept at 4 °C |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock kept at -20 °C |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems. |
| EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production |
| Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock kept at 4 °C | |
| Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock kept at -80 °C |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock kept at -20 °C |
| B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock kept at -20 °C |
| Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock kept at -80 °C |
| Matrigel | Corning | 356231 | Stock kept at -20 °C |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock kept at 4 °C |
| RNAlater - RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at RT |
| Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C |
| BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines - stock kept at -20 °C |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock kept at -20 °C |
| 60-well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | |
| Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | |
| Disposal glass micropipettes | Blaubrand | 708745 | |
| Microscope | Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box. Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface. |
||
| Objective | Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance; Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance |
References
- Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
- Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Attali, M., et al. Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme. Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).
- Johansson, K. A., et al. Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types. Dev Cell. 12, 457-465 (2007).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).
- Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Dev Biol. 4, 242-255 (1962).
- Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development. Development. 125, 1017-1024 (1998).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , 3979 (2012).
- Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).
- Hope, K., Bhatia, M. Clonal interrogation of stem cells. Nat Methods. 8, 36-40 (2011).
- Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Sugiyama, T., et al. Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. , (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. , (2009).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 10, (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
