Summary
Den tredimensionale kultur beskrevet i denne protokol metode sammenfatter bugspytkirtlen udvikling fra spredte embryonale mus bugspytkirtel stamfædre, herunder deres betydelige ekspansion, differentiering og morfogenese i en forgrenet orgel. Denne metode er modtagelig for billedbehandling, funktionelle indblanding og manipulation af den niche.
Introduction
Organ kultur giver en nyttig model, der bygger bro mellem det komplekse, men yderst relevante in vivo undersøgelser og bekvem men omtrentlige simulering af cellelinje modeller. I tilfælde af bugspytkirtlen, der er helt svarer til bugspytkirtel progenitorer selvom der transformeres cellelinjer simulerer endokrine og eksokrine celler ikke cellelinie. Den voksne hele bugspytkirtlen kan ikke dyrkes; isolerede endokrine øer kan opretholdes for få uger uden celleproliferation og vævssnit kan opbevares in vitro i få timer 5. Embryonale bugspytkirtel kultur har været meget anvendt til ikke blot at studere dens udvikling, men også at undersøge epitel-mesenkymale interaktioner 4,6,7, til billede processer 8 eller kemisk forstyrre dem 9.. To orgel dyrkningsmetoder anvendes hovedsageligt: Den første består i dyrkning af pancreas knopper på fibronectincoatede coatede plader 2, som er bekvemfår du let til billeddiagnostiske formål; den anden mulighed er at dyrke organer på filtre på luft-væske grænsefladen 3,4, som bedst bevarer morfogenese. Selvom meget nyttigt, disse metoder fører til en vis grad af udfladning; udvidelse af progenitorer er meget begrænset i forhold til den normale udvikling og starte befolkning er kompleks, der omfatter alle typer af pancreasceller og mesenchymale celler.
Evnen til kultur og udvide spredte primære celler er værdifuldt at studere afstamning relationer og afdække de iboende egenskaber af isolerede celletyper 10. Sugiyama m.fl. 11. Kunne opretholde bugspytkirtel stamfædre og hormonforstyrrende forfædre at tilbageholdte nogle funktionelle tegn i 3-5 dage i kultur på feeder lag. Pancreatospheres, beslægtet med neurosfærer 12 og mammospheres 13 er blevet udvidet fra voksne øer og duktale celler, selv om arten af de stamceller / stamcellerat generere disse kugler er ikke klart. Desuden, i modsætning til fysiologisk udvikling, pancreatospheres indeholdt nogle neuroner 14,15. Sfærer blev også for nylig produceret fra embryonale bugspytkirtel stamfædre 16,17 og regenererende pancreata 18 med god stamfader ekspansion og efterfølgende differentiering, men undlod at rekapitulere morfogenese.
3D-modeller fra spredte og ofte definerede celler, der selv-organisere i miniaturiserede organer har for nylig blomstrede og simulere udviklingen eller voksen omsætning af flere organer, såsom tarmen 19,20, maven 21, lever 22, prostata 23 og luftrøret 24.. I nogle tilfælde har udviklingsmæssige morfogenese og differentiering er sammenfattet i 3D fra ES-celler, som det er tilfældet af optiske kopper 25, tarme 26 eller hjerne 27.
Her har vi desCribe en metode til at udvide dissocierede multipotente bugspytkirtlen forfædre i en 3D Matrigel stillads, hvor de kan differentiere og selv-organisere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol har til formål at dyrke pancreas organoids stammer fra murine E10.5 dissocierede epiteliale bugspytkirtlen celler.
Protokollen kræver etisk godkendelse til dyreforsøg.
1. Dissektion af Dorsal Pancreas Bud fra E10.5 musefostre
- Sacrifice tidsbestemt drægtige mus ved embryonal dag (E) 10,5 åbne maven med en saks, fjerne de to Uterushornene og placere dem i en 10 cm petriskål fyldt med kold fosfatbuffer saltvand (PBS) eller Dulbeccos modificerede essentielle medium (DMEM) holdt på is. Den samlede eksperiment fra offer til cellepodning sker i 60-90 min for at forebygge celleskader.
- Adskil livmoderen i individuelle embryo segmenter ved hjælp af en lille saks. Overfør ét embryon til en 35 mm petriskål med kold PBS og visualisere det under et dissektionsmikroskop med belysning fra oven. Med dissektion pincet fjerne den omgivende muskler, decidua og æggeblomme sac og eksponere embryoet. Placer embryo tilbage i kold DMEM-medium. Embryoner kan nemt overføres ved hjælp af en 3 ml plastik overførselspipetten / dropper. Isoler hver enkelt foster på en lignende måde, før du fortsætter.
- Placer et foster i en ren 35 mm petriskål i PBS.
- Brug tynde pincet (0,05 mm bredde) for at fjerne forelimb. Sæt forsigtigt tangen i åbningen for at frigøre fordøjelseskanalen fra rygmarven region (figur 1). Valgfrit: Hvis du mere bekvemt se maven, fjerne overkroppen af embryonet, ned til hjertet og haleregionen under blommesækken stilk.
- Find mave, lever og tarm. Ved hjælp af pincet, isolere mave-tarmkanalen fra maven til tarmen og placere den i koldt DMEM på is (Figur 1). Den dorsale pancreas knop er fastgjort dorsalt, posterior til maven (figur 1).
- Isoler hver enkelt mavetarmkanalen i en simiLAR måde, før du fortsætter. Hvis embryoner skal genotypebestemmes, indsamle halen på tidspunktet for dissektion og holde hver enkelt mave-tarmkanalen i en anden brønd i en 24-brønds plade med kold DMEM på is.
- Placer en mave-tarmkanalen i en ren 35 mm petriskål i koldt PBS. Nu bruger belysning nedefra i lyse felt til at visualisere og dissekere den dorsale bugspytkirtlen opløbet under dissektion mikroskop. Disse betingelser vil optimere visualisering af mængder. Brug elektrolytisk slebne tungsten nåle eller 20 G injektionsnåle isolere pancreas knop med så lidt mesenkym som muligt omkring epitel (figur 1).
- Overfør isoleret knop i en petriskål indeholdende en kold dispase opløsning (1,25 mg / ml) i 2-3 min. Fra dette punkt, kan overføre mest bekvemt ske med flamme-trukket 50 ul glaskapillarer knyttet til en mund-kontrollerede fleksibelt rør. Alternativt, men med flere risk miste opløbet, skal du bruge en 10 ul automatisk pipette (Pipetman) med passende plastik tip.
- Udfør bugspytkirtlen opløbet aspiration og udslyngning under mikroskopisk kontrol. Sæt pancreas opløbet tilbage i PBS. Yderligere rengøre isoleret pancreas knop fra mesenkym med nåle og blid aspiration ved hjælp af kapillarrøret (figur 1).
- Når hele mesenchyme er fjernet, skylles pancreas opløbet i koldt PBS; overføre hver knop til kold DMEM i individuelle brønde (60-brønds mini-bakker fyldt med 10 pi kold DMEM). Det er vigtigt ikke at fjerne mesenchyme i dispase, hvilket gør vævet meget klistret.
2.. Plating og Kultur dispergerede celler
- Overfør det dissekerede epiteler fra alle embryoner med en flamme-trukket glas kapillar i koniske brønde af 60-brønds mini-bakker fyldt med 10 pi PBS til skylning.
- Overfør opløbet i 10 pi trypsin 0,05% and lad det inkuberes ved 37 ° C i 4 min. Inaktivere trypsin ved at overføre knop i en brønd med 10 pi DMEM + 10% føtalt kalveserum (FCS).
- Dissociér cellesuspensionen ved opsugning gennem et tyndt kapillarrør trukket med en pipette aftrækker. Det er vigtigt at undgå bobler på dette stadium, mens pipettering op og ned for at dissociere cellerne. Pancreas organoids optimalt starte fra små grupper af 5-15 celler og derfor delvis dissociation anbefalet (figur 1).
- Pool celler fra flere embryoner i et Eppendorf-rør for at minimere forskelle på grund af individuel behandling. Cellesuspensionen fortyndes i afkølet Matrigel på forholdet 1:3. Alikvot denne blanding til en 96-brønds plade, 8 gl / brønd eller en plade optimeret til billeddannelse (se nedenfor).
- Inkubér pladen ved 37 ° C i 5 minutter, således at Matrigel fortykkes. Fyld brøndene med 70 pi foretrukne medie (organoide eller sfære, se tables 1 og 2) og efterlade i en befugtet miljø, der indeholder 5% CO2 og 95% luft ved 37 ° C.
- Udskift mediet hver 4. dag. Overvåg de voksende pancreas kolonier dagligt og dokumentere processen ved billeddannelse.
- Små molekyler eller proteiner af interesse kan føjes til mediet på dette stadium for interferens eksperimenter, som rapporteret tidligere 28.
Tabel 1: organoide medium.
| Navn på Material | Stock Concentration | Koncentration i den endelige medium | Volumen af lager |
| Penicillin-streptomycin | 100% | 1% | 50 pi |
| KnockOut Serum udskiftning (tillæg) | 100% | 10% | 500 pi |
| 2-mercaptoethanol | 14,3 M 0.1 mM | 1 pi | |
| Phorbolmyristatacetat (PMA) | 16 uM | 16 nM | 5 mikroliter |
| Y-27632 (ROCK-hæmmer) | 50 mM | 10 uM | 1 pi |
| EGF | 50 ug / ml | 25 ng / ml | 2,5 pi |
| Rekombinant human R-spondin 1 | 250 ug / ml | 500 ng / ml | 10 pi |
| - Eller - | |||
| Rekombinant Mouse R-spondin 1 | 250 ug / ml | 500 ng / ml | 10 pi |
| Rekombinant human FGF1 (aFGF) | 100 ug / ml | 25 ug / ml | 1,25 pi |
| Heparin (Liquemin) | 2500 U / ml | 2,5 U / ml | 2 pi |
| Recombinat Menneskelige FGF10 | 100 ug / ml | 100 ng / ml | 5 mikroliter |
| DMEM/F-12 | 4,412.25 pi | ||
| Samlet | 5.000 pi |
Tabel 2: Sphere medium.
| Navn på Material | Stock Concentration | Koncentration i den endelige medium | Volumen af lager |
| Penicillin-streptomycin | 100% | 1% | 50 pi |
| B27 x50 (tillæg) | 100% | 10% | 100 pi |
| Rekombinant human FGF2 (bFGF) | 100 ug / ml | 64 ng / ml | 3.2 pi |
| Y-27632 (ROCK-hæmmer) | 50 mM | 10 uM | 1 pi |
| DMEM/F-12 | 4845,8 pi | ||
| Samlet | 5000 pi |
3.. Imaging af Progression af organoide Development
- Billede organoids enten dagligt eller ved tidsforskydningen mikroskopi ved hjælp af et fluorescerende time-lapse mikroskop. For tid bortfalder billeddannelse, bruge en XY (Z) automatiseret inverteret fluorescerende mikroskop.
- Depositum små dråber af 3 ul i 4-brønds plader eller glasbund plader fyldt med 2-5 ml medium. Billede med en 10x langdistance mål. Bemærk: Transgene mus, der udtrykker fluorescerende sporstoffer kan anvendes. Movie 1 viser for eksempel den første udvidelse af organoids fra Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + mus 4. Det nukleare GFP giver brugeren mulighed for at spore celler som individuelle objekter, men lignende principper kan anvendes til at spore celler med membran fluorescens sådansom mT / mG mus 29.
- Start time-lapse imaging 3 timer efter podning af cellerne for at undgå fokus driver og indstille softwaren kontrollerende automatisering til at tage 1 billede / time i 3 eller flere dage ved manuelt definerede positioner. I enhver stilling, erhverver en kontrast differential interferens (DIC) billedet samt GFP signal, rapportering fluorescerende markør ekspression.
4.. Inddrivelse af Organoids til histologi
- Anbring 96-brønds plade på is og fjerne mediet og erstatte den med iskold PBS. Dette depolymeriserer Matrigel delvist.
- Forsigtigt aspireres enkelte organoide fjerne det omgivende Matrigel under anvendelse af en 1.000 pi spids for ikke at forstyrre den overordnede struktur. Overfør hver organoide til en brønd med iskold PBS. Hold pladen på is. Direkte fiksering i Matrigel er også muligt.
- Fastgør organoide i 15 min i 4% paraformaldehyd (PFA), Cryopreservering det i saccharose og integrere det i gelatine. Proces hverorganoide for cryosectioning og histologi som tidligere beskrevet (Johansson et al. 2007) 4.
5.. Inddrivelse af Organoids til PCR og biokemi
- Anbring 96-brønds plade på is og fjerne mediet. Tilføj 60 pi RNAlater per brønd for at stabilisere og beskytte cellulært RNA.
- Sprænges gelen i hver brønd mekanisk ved delvis depolymerisering den på is. Enten gendanne individuelle organoids hjælp af en 1.000 ul spids for ikke at forstyrre den overordnede arkitektur eller inddrive hele godt (med Matrigel) ved at forstyrre gelen mekanisk med en 200 ul spids. Brug en 1.000 gl tip til at overføre indholdet godt ind en RNAse frit ikke-klæbende Eppendorf rør holdes på is.
- Brøndene vaskes med 60 pi RNAlater og tilføje de resterende indhold til samme Eppendorf rør.
- Spin rør til 5 minutter ved 500-1000 xg ved 4 ° C.
- Supernatanten fjernes, kun efterlader 20-30 piaf RNAlater i røret sammen med pellet. For biokemi, opbevare prøverne så tør som muligt.
- Må ikke fryses prøver i RNAlater samme; Opbevares ved 4 ° CO / N (for at tillade RNAlater grundigt trænge ind i væv). Vævet kan opbevares ved -20 ° C til langtidsopbevaring og kan senere behandles til vævsødelæggelse og udvinding af små mængder af RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E10.5 dorsale bugspytkirtlen progenitorer dissocieret og programlister i 3D Matrigel rekapitulere bugspytkirtlen udvikling. Stamfædre kan lettest følges med fluorescerende journalister. I vores tilfælde har vi brugt en transgen mus, der udtrykker en nuklear GFP protein styres af Pdx1 promotor (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Movie 1) i fravær af tamoxifen, og dermed uden at aktivere Neurog3 4 (figur 2).
Med organoide medium, en første komprimering af små klynger af celler finder sted i de første timer. Ekspansion kan derefter påvises ved udvidelsen af klyngerne i de første 4 dage (figur 2A). Fra dag 5, grene dannes i 20% største organoids. Enkelte celler ikke udvider og miste Pdx1 udtryk mens de store klynger bevarer Pdx1 udtryk 28.
Under disse betingelser, stamfædre gennemgå en spectacular morfogenese med fremkomsten af forgrenede epitelial strukturer. Denne proces foregår kun, når stamfædre udsås i ≥ 4-celler klynger, hvilket indikerer en stærk krav til EF-signaler. Histologisk analyse viser, at efter dag 7 kultur, er de resulterende mini-organer bestående af pancreas stamfædre (Sox9 + / HNF1B + / Pdx1 + celler: figur 3B) og differentierede celler, der udtrykker enten exocrine (Amylase +) eller endokrine (Insulin + eller Glucagon +) markører (figur 3A, C). Differentieringen i endokrine celler er lavere end i den endogene bugspytkirtlen (omkring 0,1%), men steg til 1%, når FGF1 ikke tilsat til dyrkningsmediet 28. Bemærkelsesværdigt, ikke kun de seedede stamfædre differentiere sig til de forventede pancreas slægter, men også spontant vedtage den normale pancreas arkitektur. Selvom E10.5 multipotente bugspytkirtel stamfædre ikke polariseret, cellerne i kultur polarisere som påvist af adskillelse af Mucin1 og aPKC i membranen vender den centrale lumen og de organisere sig i en forgrenet rørformet net. Regionaliserede "tip og trunk" domæner emerge: HNF1B + stamfædre og endokrine celler er lokaliseret i den centrale region, mens acinusceller er placeret i periferien som en delvis eller fuldstændig krone af celler. De organoids kan opretholdes i kultur i 10 dage; efter denne periode, er de generelt mister deres arkitektoniske organisation og blive cystisk (ikke vist). Passage kan ske efter delvis dissociation men hurtigt fører til cystedannelse, et fænomen, der reduceres ved tilsætning af BMP-inhibitoren Noggin 28.
Med kuglen medium ekspansion er hyppigere og ses fra 2% af enkelte celler; ikke desto mindre effektivitet af kugle dannelse korrelerer med størrelsen af seedeU-klynger 28. På dag 2/3 er en lumen påvist i små klynger og udvider derefter, hvilket fører til stort set mono-lags hule kugler med lejlighedsvise lokale flerlagede områder (figur 2b). Disse kugler sammen, når der hentes fra Matrigel (figur 3D-H). Under disse betingelser er de resulterende strukturer hovedsagelig består af pancreas stamceller med en lille procentdel af differentierede exokrine og endokrine celler på dag 7 (figur 3D-H). Stamfædre i sfærerne også blevet apikalt polariseret, hvilket fremgår af den adskillelse af aPKC på membranen vender den centrale lumen i alle celler (Figur 3F). Pancreatospheres kan passeres mindst to gange (ikke vist).
Fig. 1. Skematisk repræsentation af procedure. mave-tarmkanalen indledningsvis dissekeret fra embryonet og efterfølgende den dorsale pancreas knop isoleres. Mesenchyme fjernes, og pancreatiske progenitorer dissocieres ved hjælp af trypsin. De resulterende delvist dispergerede celler podes derefter ved lav tæthed i vækstfaktor-udtømte Matrigel. Skalapanelerne:. 1,00 mm, bortset fra den resulterende organoide billede, hvor skalalinjen er 200 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Fremskridt i kultur over tid. (A) En lille klynge af pancreas stamfædre dyrkes med organoide medium og følges med time-lapse mikroskopi fra 3 timer efter plating for 60 timer. I BOttom paneler, en organoide efter 7 dages kultur. Skala bar: 200 m; gælder for alle paneler i A. (B) Eksempel på en kugle fulgt i en 60 timers time-lapse og erobrede på dag 7 i kultur. Skala bar: 200 m; gælder for alle paneler i B. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 3. Histologi. (AC) Serielle sektioner af en 7-dages organoide farvet for stamfader (B - HNF1B) og differentiering (A - amylase, C - insulin) markører. Den organoide er sammensat af epitelial (A - E-cadherin) og apikalt polariseret (B - mucin1) celler. Den stiplede linje svarer til den ikke-acinære midterområdet (A), hvorDetekteres HNF1B (B) og endokrine (C)-celler (DH) Snit af 7-dages kugler farvet for progenitor. (G - HNF1B, H - SOX9) og endokrine (D - insulin og glucagon) markører. Kuglerne er sammensat af apikalt polariseret (D, F - aPKC) epithelial (E - E-cadherin) celler. Skala bar:. 50 mM Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Storstilet produktion af funktionelle betaceller in vitro er stadig ineffektiv 1. I denne udfordrende sammenhæng kan Developmental Biology undersøgelser hjælpe decifrere de nøjagtige signaler, der kræves for differentieringen af funktionelle betaceller. Denne protokol giver mulighed for vedligeholdelse, udbygning og differentiering af embryonale pancreas stamfædre in vitro. Dette omfatter dannelsen af insulin-producerende beta-celler, der ikke co-udtrykke andre endokrine hormoner, har høje niveauer af Pdx1, udtrykker pro-convertases der udløber insulin og har behandlet insulin 28. Vigtige nøglefaktorer i systemet er aktiviteten af FGF (eksogent stimuleret af ekstra FGF forstærkes af heparin) og Notch (endogene) signalveje, samt ROCK-hæmning af Y-27632: i mangel af disse elementer, ingen eller meget begrænset antal organoids og sfærer blev genereret 28. Kravet om FGF og Notch aktivitet er let at forstå ud fra deres betydning for bugspytkirtlen udvikling in vivo 28. ROCK-inhibitor kan være substitueret med blebbistatin, hvilket viser, at hyperaktivering af filamenter dynamik ved dissociation fører til både øget celledød, en kraftig inhibering af stamfader transkriptionsfaktor Pdx1 og manglende ekspansion. Interessant nok var der mange yderligere bestanddele af det organoide medium vist sig at være individuelt unødvendigt, men deres samlede fravær resulterede i tab af epitel forgrening 28. Ud over visse væsentlige bestanddele i mediet, er det vigtigt at kontrollere niveauet af dissociering af stamceller. Faktisk er stamfader spredning og Pdx1 vedligeholdelse væsentligt fremmet i grupper på mere end 4 celler. En komprimering kan observeres inden for de første 12 timer og manglende kompakte resultater i manglende vedligeholdelse Pdx1 og udvide. Den ROCK inhibitor er afgørende for denneproces.
I det øjeblik organoids ikke danner efter FACS-sortering, men effektiviteten af systemet kan eventuelt forbedres ved genaggregere en kontrolleret antallet af stamceller. En anden vigtig komponent i dette dyrkningssystem er 3D matrix. Celler sat på Matrigel eller Matrigel for tæt på bunden af pladen spredning og mister Pdx1-ekspression. Matrigel sandsynligvis giver biokemiske komponenter, især laminin samt mekanisk tidskoder 28. Faktisk stivheden af matricen spiller en afgørende rolle. Stive hydrogeler er ikke eftergivende for pancreas stamfædre vedligeholdelse og udbygning 28 og fortyndet Matrigel er heller ikke. Når Matrigel fortyndes 1:10 bugspytkirtlen progenitor ikke kan dyrkes.
Den organoide systemet kan bruges til at teste effekten af små molekyler og rekombinante proteiner på bugspytkirtlen forfædre i form af overlevelse, proliferation, differentiering, polarisering og forgrening28.. Den kan også bruges til at teste samarbejdet mellem forskellige celletyper i bugspytkirtlen udvikling 28. Vi er overbeviste om, at tilgængeligheden af pancreasstamfaderceller også vil tillade genetiske manipulationer, såsom viral målretning, som set i andre organoide systemer 17,27. Dette kunne anvendes til screening af 17 med et system, der gør det muligt for morfogenese i modsætning til de områder, der er beskrevet tidligere såvel som her 16,17,28. De dyrkningsbetingelser Vi udviklede også fremlægge den fordel, at serum-fri, feeder-fri og blottet for mesenchyme og blodkar og dermed reducere den cellulære og biokemiske kompleksitet. Der er imidlertid en begrænsning i evnen til passage af organoids og dermed at opnå store mængder af stamceller. Dette kunne omgås i fremtiden ved tilpasninger af protokollen til senere faser af udvikling, hvor forfædre er mere rigelige, at kilderne til pancreas forfædre fremstillet af embryonic stamceller (ES) celler eller induceret pluripotente stamceller (iPS-celler). Dette baner vejen for en 3D-model af den menneskelige udvikling bugspytkirtlen.
Dette system kan også potentielt anvendes til fremstilling af pancreasceller i fremtiden perspektiv af behandlingen. I denne sammenhæng ville produktionen af funktionelle beta celler til transplantation potentielt hjælpe med diabetes terapi. De tilpasninger af systemet til humane ES-eller iPS celler ville være vigtigt for dette formål. Det er stadig uklart, om der skal bruges organoide eller sfære forhold. De organoide betingelser giver mulighed for produktion af celler, der har flere egenskaber af modne betaceller, men deres funktion er endnu ikke afprøvet. Imidlertid er disse celler i øjeblikket ikke talrige og blandes blandt andre celler. Det er også sandsynligt, at den tidlige udseende heterogenitet i organoide systemet fører til ukontrolleret signalering mellem celler og er derfor til skade for produktionen.
Than sfære, der fastholder progenitorer er i princippet foretrække kontrolleret ekspansion og passage af stamceller, men deres efterfølgende differentiering fortsat skal kontrolleres. Andre har for nylig udarbejdet pancreatospheres der effektivt kan differentieres. Det vil være vigtigt at sammenligne karakteren af de områder der er opnået i den nuværende protokol blottet for foderautomater og serum til kugler opnået med de andre protokoller 16,17. Fra et terapeutisk synspunkt, kan kompleksiteten og biologisk oprindelse Matrigel udgøre et problem for reproducerbarhed, sundhed og skalerbarhed. Foreløbige resultater har vist, at bløde hydrogeler funktionaliseret med laminin er vejledende for pancreasstamfadercelle ekspansion in vitro. Yderligere optimering er nødvendig, da disse geler er endnu ikke så effektivt som Matrigel 28.
Produktionen af beta-celler i deres naturlige kontekst kan også potentielt være nyttigt at testlægemidler der øger betacelle aktivitet eller øge deres overlevelse eller spredning men til dette formål vil det være vigtigt først at teste graden af modenhed af betaceller, for at øge effektiviteten af deres differentiering og at teste, om de dyrkningsbetingelser præsenteret her vedligeholde bedre holme end det nuværende suspensionskulturer. Produktion af eksokrine pancreas kunne også være nyttigt at udvikle lægemidler til at målrette pancreascancer og pancreatitis. Også her skal undersøges grundigt graden af modenhed af eksokrine celler produceret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret sekventielt af en NCCR Frontiers in Genetics pilot award, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 41-2009-775 og Grant 12-126875 fra There Frie Forskningsråd / health and Sygdom. Forfatterne takker Spagnoli laboratorium for hosting video optagelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock kept at -20 °C |
| KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock kept at -20 °C |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock kept at 4 °C |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock kept at -20 °C |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems. |
| EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production |
| Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock kept at 4 °C | |
| Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock kept at -80 °C |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock kept at -20 °C |
| B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock kept at -20 °C |
| Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock kept at -80 °C |
| Matrigel | Corning | 356231 | Stock kept at -20 °C |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock kept at 4 °C |
| RNAlater - RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at RT |
| Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C |
| BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines - stock kept at -20 °C |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock kept at -20 °C |
| 60-well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | |
| Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | |
| Disposal glass micropipettes | Blaubrand | 708745 | |
| Microscope | Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box. Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface. |
||
| Objective | Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance; Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance |
References
- Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
- Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Attali, M., et al. Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme. Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).
- Johansson, K. A., et al. Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types. Dev Cell. 12, 457-465 (2007).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).
- Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Dev Biol. 4, 242-255 (1962).
- Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development. Development. 125, 1017-1024 (1998).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , 3979 (2012).
- Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).
- Hope, K., Bhatia, M. Clonal interrogation of stem cells. Nat Methods. 8, 36-40 (2011).
- Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Sugiyama, T., et al. Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. , (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. , (2009).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 10, (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
