Summary
De driedimensionale cultuur methode beschreven in dit protocol recapituleert pancreas ontwikkeling van verspreide embryonale muis alvleesklier progenitoren, waaronder hun grote expansie, differentiatie en morfogenese in een vertakte orgaan. Deze methode is vatbaar voor beeldvorming, functiestoringen en manipulatie van de niche.
Introduction
Orgelcultuur biedt een bruikbaar model dat de kloof tussen het complex, maar zeer relevante in-vivo-onderzoek en de handige maar bij benadering simulatie van cellijn modellen overbrugt. Bij de pancreas, is er geen cellijn volkomen gelijkwaardig pancreas voorlopercellen hoewel er getransformeerde cellijnen simuleren endocriene en exocriene cellen. De volwassen gehele alvleesklier kan niet worden gekweekt; endocriene geïsoleerde eilandjes kunnen worden gehandhaafd gedurende enkele weken zonder celproliferatie en weefselplakken kan in vitro worden gedurende enkele uren 5. Embryonale pancreas cultuur is op grote schaal gebruikt niet alleen om de ontwikkeling ervan te bestuderen, maar ook om epitheliale-mesenchymale interacties 4,6,7 onderzoeken, op de foto verwerkt 8 of chemisch bemoeien met hen 9. Twee orgelcultuur methoden worden voornamelijk gebruikt: de eerste bestaat uit het kweken van alvleesklier knoppen op fibronectine gecoate platen 2, dat is Convenient voor grafische doeleinden; de tweede optie is om de cultuur van de organen filters bij de lucht-water grensvlak 3,4 die het beste bewaart morfogenese. Hoewel nuttig, deze methoden leiden tot een zekere mate van afvlakking; de uitbreiding van voorlopercellen is zeer beperkt in vergelijking met de normale ontwikkeling en uitgangspopulatie complex omvattende alle typen pancreatische cellen en mesenchymale cellen.
De mogelijkheid om de cultuur en uitbreiden verspreide primaire cellen is waardevol voor lineage relaties bestuderen en ontdekken de intrinsieke eigenschappen van geïsoleerde celtypen 10. Sugiyama et al.. 11 kon pancreas voorlopercellen en endocriene voorouders dat een aantal functionele tekens bewaard gedurende 3-5 dagen in cultuur op de feeder lagen behouden. Pancreatospheres, verwant aan neurospheres 12 en mammospheres 13, zijn uitgebreid van volwassen eilandjes en ductale cellen, hoewel de aard van de voorlopers / stamcellendat deze sferen te genereren is niet duidelijk. Bovendien, in tegenstelling fysiologische ontwikkeling, de pancreatospheres bevatte neuronen 14,15. Bollen werden onlangs ook uit embryonale pancreas voorlopercellen 16,17 en regenererende pancreata 18 met goede voorlopercellen expansie en de daaropvolgende differentiatie, maar niet om morfogenese recapituleren.
3D-modellen van verspreide en vaak gedefinieerd cellen die zichzelf organiseren in geminiaturiseerde organen onlangs bloeide en simuleren van de ontwikkeling of volwassene omzet van meerdere organen zoals de darm 19,20, de maag 21, lever 22, de prostaat 23 en de luchtpijp 24. In sommige gevallen zijn ontwikkelings morfogenese en differentiatie zijn samengevat in 3D van ES-cellen, zoals bij optische koppen 25, 26 darm of de hersenen 27.
Hier hebben we desCribe een methode om gedissocieerde multipotente pancreas voorlopercellen uit te breiden in een 3D Matrigel steiger waar ze kunnen differentiëren en zichzelf te organiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol heeft als doel om te groeien pancreas organoids afgeleid van muizen E10.5 gedissocieerde epitheliale cellen de alvleesklier.
Het protocol vereist ethische goedkeuring voor dierproeven.
1. Dissectie van Dorsale Alvleesklierkanker Bud uit E10.5 muizenembryo's
- Sacrifice getimed-zwangere muizen op embryonale dag (E) 10.5, opent de buik met een schaar, verwijder de twee baarmoederhoorns en leg ze in een schotel van 10 cm Petri gevuld met koud fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) of Dulbecco gemodificeerd essentieel medium (DMEM) op ijs gehouden. De totale experiment van het offer naar cel zaaien gebeurt in 60-90 min naar cel schade te voorkomen.
- Scheid de baarmoeder in afzonderlijke embryo segmenten met behulp van een klein schaartje. Transfer een embryo tot een 35 mm petrischaal met koude PBS en visualiseren onder een dissectie microscoop met verlichting van bovenaf. Met dissectie pincet verwijder de omliggende spieren, decidua en dooier sac en het embryo bloot. Plaats de embryo terug in koude DMEM medium. Embryo's kunnen gemakkelijk worden overgedragen met behulp van een 3 ml plastic overdracht pipet / druppelaar. Isoleer elk individu embryo soortgelijke wijze alvorens verder.
- Plaats een embryo in een schone 35 mm petrischaal in PBS.
- Gebruik dunne tang (0,05 mm breed) aan de voorpoot te verwijderen. Steek voorzichtig de tang in de opening om het spijsverteringskanaal van het ruggenmerg (Figuur 1) los. Optioneel: Als u meer gemakkelijk zien de maag, verwijder het bovenlichaam van het embryo, tot aan het hart en de staart gebied onder de dooier stengel.
- Zoek de maag, lever en darm. De tang isoleren het maagdarmkanaal van de maag naar de darmen en deze in koude DMEM op ijs (figuur 1). De dorsale pancreas knop wordt dorsaal, posterior naar de maag (figuur 1) bevestigd.
- Isoleer elk individu maagdarmkanaal in een similar manier voordat u verder gaat. Wanneer de embryo's moeten genotyperen, verzamel de staart bij de dissectie en houdt elk individu maagdarmkanaal in een andere put in een 24-wells plaat met koud DMEM op ijs.
- Plaats een maagdarmkanaal in een schone 35 mm petrischaal in koud PBS. Nu gebruik verlichting van onderen in heldere veld te visualiseren en te ontleden de dorsale pancreas knop onder de dissectie microscoop. Deze voorwaarden zullen de visualisatie van volumes te optimaliseren. Met elektrolytisch geslepen wolfraam naalden of 20 G injectienaalden, isoleren de pancreas kiem met zo weinig mogelijk mesenchym in het epitheel (figuur 1).
- Breng de geïsoleerde kiem in een petrischaaltje met een koude dispase-oplossing (1,25 mg / ml) gedurende 2-3 minuten. Vanaf dit punt, kan de overdracht meeste gemakkelijk worden gedaan met vlam getrokken 50 pl glas haarvaten verbonden met een mond-gecontroleerde flexibele buis. Als alternatief, maar met meer risk van het verliezen van de knop, gebruik dan een 10 ul automatische pipet (Pipetman) met de juiste plastic tips.
- Voer alvleesklier bud aspiratie en ejectie onder microscopische controle. Zet de alvleesklier kiem terug in PBS. Verder reinigen van de geïsoleerde alvleesklier kiem van het mesenchym met de naalden en behoedzame aspiratie met behulp van de glazen capillair (figuur 1).
- Als de hele mesenchym wordt verwijderd, spoel de alvleesklier kiem in koude PBS; breng elke knop te koud DMEM in individuele putten (60-en mini-trays gevuld met 10 ul van koude DMEM). Het is belangrijk niet te vergeten de mesenchym in dispase verwijderen, die het weefsel zeer kleverig maakt.
2. Plating en cultuur van Dispersed Cells
- Breng de ontleed epitheel van alle embryo's met een vlam getrokken glas capillair in kegelvormige putjes van 60-en mini-trays gevuld met 10 ul PBS voor het spoelen.
- Breng de kiem in 10 ul van trypsine 0,05% eennd laten incuberen bij 37 ° C gedurende 4 minuten. Inactivatie van het trypsine in door de knop in een well 10 pi DMEM + 10% foetaal kalfsserum (FCS).
- Distantiëren de celsuspensie door aspiratie door een dunne capillaire getrokken met een pipet trekker. Het is belangrijk om luchtbellen te voorkomen in dit stadium tijdens en neer te pipetteren aan de cellen dissociëren. Pancreas organoids optimaal gaan van kleine groepen van 5-15 cellen en derhalve gedeeltelijke dissociatie aanbevolen (figuur 1).
- Verzamel de cellen van diverse embryo's in een eppendorfbuisje om verschillen door individuele verwerkingseenheden minimaliseren. Verdun de celsuspensie in gekoeld Matrigel bij een 1:03 verhouding. Aliquot dit mengsel aan de 96-well plaat, 8 ul / putje in een plaat of geoptimaliseerd voor afbeelden (zie hieronder).
- Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 5 min, waardoor de Matrigel dikker. Vul het putten met 70 ul van medium bij uitstek (organoïde of sfeer, zie Tables 1 en 2) en laat in een bevochtigde omgeving met 5% CO2 en 95% lucht bij 37 ° C.
- Vervang het medium elke 4 e dag. Toezicht houden op de groeiende alvleesklier kolonies dagelijks en documenteren van het proces door beeldvorming.
- Kleine moleculen of eiwitten van belang kan aan het medium in dit stadium worden toegevoegd voor interferentie experimenten, zoals eerder gemeld 28.
Tabel 1: organoïde medium.
| Stofnaam | Stock Concentratie | Concentratie in eindmedium | Volume op voorraad |
| Penicilline-streptomycine | 100% | 1% | 50 gl |
| KnockOut Serum vervanging (supplement) | 100% | 10% | 500 pi |
| 2-mercaptoethanol | 14.3 M 0,1 mM | 1 pi | |
| Forbolmyristaatacetaat (PMA) | 16 uM | 16 nM | 5 pi |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | 50 mM | 10 uM | 1 pi |
| EGF | 50 ug / ml | 25 ng / ml | 2,5 pl |
| Recombinant Human R-spondin 1 | 250 ug / ml | 500 ng / ml | 10 gl |
| - Of - | |||
| Recombinant Mouse R-spondin 1 | 250 ug / ml | 500 ng / ml | 10 gl |
| Recombinant humaan FGF1 (aFGF) | 100 ug / ml | 25 ug / ml | 1.25 pi |
| Heparine (Liquemin) | 2500 U / ml | 2,5 U / ml | 2 pi |
| Recombinant Human FGF10 | 100 ug / ml | 100 ng / ml | 5 pi |
| DMEM/F-12 | 4,412.25 pi | ||
| Totaal | 5000 pi |
Tabel 2: Sphere medium.
| Stofnaam | Stock Concentratie | Concentratie in eindmedium | Volume op voorraad |
| Penicilline-streptomycine | 100% | 1% | 50 gl |
| B27 x50 (supplement) | 100% | 10% | 100 pl |
| Recombinant humaan FGF2 (bFGF) | 100 ug / ml | 64 ng / ml | 3.2 pl |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | 50 mM | 10 uM | 1 pi |
| DMEM/F-12 | 4.845,8 pi | ||
| Totaal | 5000 pi |
3. Beeldvorming van de progressie van organoïde Development
- Afbeelding organoids dagelijks of door time lapse microscopie met behulp van een fluorescerende time-lapse microscoop. Voor time lapse imaging, gebruik een XY (Z) geautomatiseerde omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
- Borg kleine druppeltjes van 3 ui in 4-well platen of glas-bodemplaten gevuld met 2-5 ml medium. Beeld met een 10x lange afstand doel. Opmerking: Transgene muizen die fluorescerende tracers worden gebruikt. Film 1 toont bijvoorbeeld de eerste uitbreiding van organoids van Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + muizen 4. De nucleaire GFP kan de gebruiker cellen volgen als afzonderlijke objecten maar vergelijkbare principes kunnen worden toegepast op cellen volgen met membraan fluorescentie dergelijkeals mT / mG muizen 29.
- Start time-lapse imaging 3 uur na het zaaien van de cellen om zich te concentreren afwijkingen te voorkomen en stel de software regelen van automatisering tot 1 foto / uur duren voor 3 of meer dagen bij handmatig gedefinieerde posities. Voor iedere plaats verkrijgen van een differentiële interferentie contrast beeld (DIC) en het GFP-signaal rapporteert fluorescente merker expressie.
4. Herstel van Organoids voor Histologie
- Plaats de 96-well plaat op ijs en verwijder het medium, te vervangen door ijskoud PBS. Dit depolymeriseert gedeeltelijk Matrigel.
- Zuig elke afzonderlijke organoïde, de omringende Matrigel verwijderen met een 1.000 III tip om de architectuur niet verstoren. Breng elke organoïde om een goed met ijskoude PBS. Houd de plaat op het ijs. Directe fixatie in Matrigel is mogelijk.
- Bevestig de organoïde gedurende 15 minuten in 4% paraformaldehyde (PFA), cryopreserve in sucrose en insluiten in gelatine. Verwerk elkorganoïde voor cryosectioning en histologie zoals eerder beschreven (Johansson et al., 2007). 4.
Herstel van Organoids voor PCR en Biochemie 5.
- Plaats de 96-well plaat op ijs en verwijder het medium. Voeg 60 ul van RNAlater per goed in om te stabiliseren en te beschermen cellulaire RNA.
- Verstoren de gel in elk putje mechanisch door het gedeeltelijk depolymeriseren het op ijs. Ofwel herstellen individuele organoids met behulp van een 1000 ui tip om de algemene architectuur niet verstoren of de gehele goed (met Matrigel) herstellen door het verstoren van de gel mechanisch met een 200 ul tip. Gebruik een 1000 pi tip om de inhoud goed te zetten in een RNAse vrij-niet-kleverige Eppendorf buis op ijs bewaard.
- Was de putjes met 60 ul RNAlater en voeg de resterende inhoud aan dezelfde Eppendorf buis.
- Draai de buizen gedurende 5 min bij 500-1000 x g bij 4 ° C.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof, waardoor er slechts 20-30 ulvan RNAlater in de buis met de pellet. Voor biochemie monsters worden zo droog mogelijk.
- Heeft monsters in RNAlater niet onmiddellijk te bevriezen; bewaren bij 4 ° CO / N (om RNAlater grondig doordringen in de weefsels). Het weefsel kan worden opgeslagen bij -20 ° C voor lange termijn opslag en later worden verwerkt voor weefselverstoring en productie van kleine hoeveelheden RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E10.5 dorsale pancreas voorlopercellen los en gezaaid in 3D Matrigel recapituleren ontwikkeling van de pancreas. Voorouders kan heel eenvoudig worden gevolgd met fluorescerende verslaggevers. In ons geval gebruikten we een transgene muis die een nucleaire GFP-eiwit gecontroleerd door Pdx1 promotor (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Film 1) in de afwezigheid van tamoxifen en dus zonder activering Neurog3 4 (figuur 2) uitdrukt.
Met het organoïde medium, een eerste verdichting van kleine clusters van cellen gebeurt in de eerste uren. Expansie kan vervolgens worden gedetecteerd door de uitbreiding van de clusters in de eerste 4 dagen (Figuur 2A). Vanaf dag 5, takken vormen in de 20% grootste organoids. Enkele cellen niet uitbreiden en verliezen Pdx1 expressie, terwijl de grote clusters behouden Pdx1 expressie 28.
In deze omstandigheden, voorouders ondergaan een spectacular morfogenese met de opkomst van vertakte epitheliale structuren. Dit proces vindt plaats wanneer de voorouders worden gezaaid bij ≥ 4-cellen clusters, wat wijst op een sterke behoefte aan gemeenschap signalen. Histologische analyse blijkt dat na dag 7 van de cultuur, de resulterende mini-organen zijn samengesteld uit de pancreas voorlopercellen (SOX9 + / HNF1B + / Pdx1 + cellen: Figuur 3B) en gedifferentieerde cellen die ofwel exocriene (Amylase +) of endocriene (Insuline + of Glucagon +) markers (Fig. 3A, C). De differentiatie in endocrine cellen is lager dan in de endogene pancreas (ongeveer 0,1%), maar verhoogd tot 1% wanneer FGF1 niet toegevoegd aan het kweekmedium 28. Opmerkelijk, niet alleen de zaadjes voorlopercellen differentiëren tot de verwachte alvleesklier geslachten, maar ze ook spontaan nemen de normale alvleesklier architectuur. Hoewel E10.5 multipotente pancreas voorlopercellen zijn niet gepoold en de cellen in cultuur polariseren zoals blijkt uit de scheiding van Mucin1 en aPKC in het membraan tegenover het centrale lumen en ze organiseren in een vertakte buisvormige netwerk. Geregionaliseerde "tip en trunk" domeinen ontstaan: HNF1B + voorlopers en endocriene cellen gelokaliseerd in het centrale gebied, terwijl acinaire cellen zich aan de rand als een gedeeltelijke of volledige kroon cellen. De organoids kan in kweek worden gehouden gedurende 10 dagen; Na deze periode, zij over het algemeen verliezen hun architectonische organisatie en worden cystic (niet getoond). Passage kan na gedeeltelijke dissociatie maar snel leidt tot cysten, een fenomeen dat wordt verminderd door de toevoeging van de BMP-remmer Noggin 28.
Met het gebied medium uitbreiding frequenter en wordt vanuit 2% van afzonderlijke cellen; echter het rendement van bol vorming correleert met de grootte van het zaadd clusters 28. Op dag 2/3 wordt een lumen gedetecteerd in de kleine clusters en breidt vervolgens leidt grotendeels mono-gelaagde holle bolletjes met incidentele lokale meerlaagse gebieden (figuur 2B). Deze bollen instorten wanneer opgehaald uit Matrigel (Figuur 3D-H). Onder deze omstandigheden worden de resulterende structuur voornamelijk uit alvleesklier progenitoren met een klein percentage van gedifferentieerde exocriene en endocriene cellen op dag 7 (Figuur 3D-H). Voorouders in de sferen ook apicaal gepolariseerd, zoals blijkt uit de scheiding van aPKC op het membraan tegenover de centrale lumen van alle cellen (Figuur 3F). Pancreatospheres kunnen ten minste tweemaal (niet getoond) gepasseerd.
Figuur 1. Schematische weergave van de PROCEDUREe. Het maagdarmkanaal wordt initieel ontleed uit het embryo en vervolgens de dorsale pancreas kiem wordt geïsoleerd. Het mesenchym wordt verwijderd en de pancreas voorlopercellen kunnen worden gescheiden met behulp van trypsine. De resulterende gedeeltelijk gedispergeerde cellen worden vervolgens geënt bij lage dichtheid in door groeifactor verarmd Matrigel. Schaal bars:. Behalve voor de resulterende organoïde foto waar de schaal bar is 200 micrometer 1,00 mm klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Voortgang van cultuur in de tijd. (A) Een kleine cluster van pancreas voorlopercellen gegroeid met de organoïde medium en volgde met time-lapse microscopie van 3 uur na plating, voor 60 uur. In de bottom panelen, een organoïde na 7 dagen van de cultuur. Schaal bar: 200 micrometer; geldt voor alle panelen in A. (B) Voorbeeld van een bol volgde in een 60 hr time-lapse en veroverde op dag 7 van de cultuur. Schaal bar: 200 micrometer; geldt voor alle panelen in B. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Histologie. (AC) Seriële secties van een 7-daagse organoïde gekleurd voor voorlopercellen (B - HNF1B) en differentiatie (A - amylase, C - insuline) markers. De organoïde is samengesteld uit epitheliale (A - E-cadherine) en apicaal gepolariseerd (B - mucin1) cellen. De streeplijn komt overeen met de niet-acinaire centrale gebied (A), waarbijHNF1B (B) en endocriene (C) cellen worden gedetecteerd (DH) Delen van 7 dagen bollen gekleurd voor voorlopercellen. (G - HNF1B, H - SOX9) en endocriene (D - insuline en glucagon) markers. De bollen zijn samengesteld uit apicaal gepolariseerd (D, F - aPKC) epitheel (E - E-cadherine) cellen. Schaalbalk:. 50 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Grootschalige productie van functionele beta-cellen in vitro nog ineffectief 1. In deze uitdagende context kan ontwikkelingsbiologie studies helpen ontcijferen exacte signalen die vereist zijn voor de differentiatie van functionele beta-cellen. Dit protocol maakt het onderhoud, groei en differentiatie van embryonale pancreatische voorlopercellen in vitro. Dit omvat de vorming van insuline producerende beta-cellen die geen co-expressie andere endocriene hormonen, hebben hoge niveaus van Pdx1, drukken de pro-convertases dat insuline rijpen en de verwerkte insuline 28. Belangrijke belangrijkste factoren binnen het systeem zijn de activiteit van FGF (exogeen gestimuleerd door toegevoegde FGF versterkt door heparine) en Notch (endogene) signaalwegen, evenals de ROTS-remming door Y-27632: bij afwezigheid van deze factoren, geen of zeer beperkt aantal organoids en bollen werden gegenereerd 28. De eis voor FGF en Notch Activiteit begrijpelijk gebaseerd op het belang ervan voor ontwikkeling van de pancreas in vivo 28. ROCK inhibitor kan worden gesubstitueerd door blebbistatin, waardoor onthullen dat hyperactivation van gloeidraad dynamieken dissociatie leidt tot zowel verhoogde celdood, een sterke remming van de voorlopercellen transcriptiefactor Pdx1 en gebrek aan expansie. Interessant vele bijkomende bestanddelen van het organoïde medium bleken afzonderlijk overbodig, maar hun gecombineerde afwezigheid resulteerde in het verlies van epitheliale vertakking 28. Naast bepaalde essentiële bestanddelen van het medium, is het belangrijk om het niveau van dissociatie van voorlopers controleren. Inderdaad, progenitor proliferatie en Pdx1 onderhoud aanzienlijk bevorderd in groepen van meer dan 4 cellen. Een verdichting kan worden waargenomen binnen de eerste 12 uur en niet compact resultaten niet Pdx1 behouden en uitbreiden. De ROCK inhibitor is van essentieel belang voor dezeproces.
Momenteel organoids geen vorm na FACS sortering maar de doeltreffendheid van het systeem zou kunnen worden verbeterd door reaggregating een gecontroleerde aantal voorlopercellen. Een ander essentieel onderdeel van deze cultuur systeem is de 3D-matrix. Cellen zetten Matrigel of de Matrigel te dicht bij de bodem van de plaat verspreid en verliezen Pdx1 expressie. Matrigel waarschijnlijk over biochemische componenten, zoals laminine en mechanische signalen 28. Inderdaad, de stijfheid van de matrix speelt een cruciale rol. Stiff hydrogelen zijn niet tolerant voor alvleesklier voorlopers onderhoud en uitbreiding 28 en verdund Matrigel ook niet. Wanneer Matrigel wordt verdund 01:10 pancreas voorlopercellen kan niet gekweekt.
Het organoïde systeem kan worden gebruikt om de effecten van kleine moleculen en recombinante eiwitten op pancreatische voorlopercellen testen termen van overleving, proliferatie, differentiatie, polarisatie en vertakking28. Het kan ook worden gebruikt om de samenwerking van verschillende celtypes tijdens ontwikkeling van de pancreas 28 testen. Wij zijn ervan overtuigd dat de toegankelijkheid van de pancreas voorlopercellen ook genetische manipulaties, zoals virale targeting, zoals gezien in andere organoïde systemen 17,27 zal toestaan. Dit kan worden gebruikt voor het screenen van 17 een systeem dat morfogenese kunnen in tegenstelling tot de eerder beschreven, evenals hier 16,17,28 bollen. De kweekomstandigheden ontwikkelen wij hebben het voordeel dat ze serumvrij, voedingsvrije en zonder mesenchym en bloedvaten waardoor de cellulaire en biochemische complexiteit verminderen. Er is echter een beperking in de mogelijkheid om de doorgang organoids en aldus grote hoeveelheden voorlopers vinden. Dit kan in de toekomst worden omzeild door aanpassingen van het protocol bij latere stadia van ontwikkeling waar voorlopers zijn overvloediger, bronnen van de pancreas voorlopercellen geproduceerd uit embryonic stamcellen (ES) cellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen. Dit effent de weg voor een 3D-model van de ontwikkeling van de pancreas mens.
Dit systeem kan ook potentieel worden gebruikt voor de productie van pancreatische cellen in de toekomst perspectief van de therapie. In deze context zou de productie van functionele beta cellen voor transplantatie mogelijk helpen bij diabetes therapie. De aanpassingen van het systeem menselijke embryonale of iPS cellen zou belangrijk zijn voor dit doel. Het is nog onduidelijk of de organoïde of de sfeer voorwaarden moeten worden gebruikt. De organoïde omstandigheden de productie mogelijk van cellen die verschillende kenmerken van rijpe beta-cellen maar hun functie nog worden getest. Echter, deze cellen zijn nog niet talrijk en gemengd onder andere cellen. Het is ook waarschijnlijk dat de vroege verschijning van heterogeniteit in de organoïde systeem leidt tot ongecontroleerde signalering tussen cellen en derhalve schadelijk voor productie.
THij bol systeem voorlopers handhaaft in beginsel voorkeur spreiding en passage voorlopercellen maar hun verdere differentiatie nog worden gecontroleerd. Anderen hebben onlangs pancreatospheres die efficiënt kunnen worden gedifferentieerd. Het zal belangrijk zijn om te vergelijken met de aard van de resultaten die in het huidige protocol verstoken van feeders en serum te bollen verkregen met de andere protocollen 16,17 bollen. Vanuit een therapeutisch standpunt kan de complexiteit en biologische oorsprong van Matrigel een kwestie van reproduceerbaarheid, gezondheid en schaalbaarheid vormen. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat zachte hydrogels gefunctionaliseerd met laminine zijn facultatief voor pancreatische voorlopercellen expansie in vitro. Verdere optimalisering is nodig omdat deze gelen nog niet zo efficiënt als Matrigel 28.
De productie van beta-cellen in hun natuurlijke context zou ook nuttig kunnen zijn om te testen medicijnen die beta boost zijncelactiviteit of verhogen hun overleving of proliferatie, maar voor dit doel zal het belangrijk zijn om eerst te testen de mate van rijpheid van de beta-cellen, om de efficiëntie van hun differentiatie te vergroten en om te testen of de kweekomstandigheden hier gepresenteerde beter handhaven eilandjes dan de huidige suspensiecultures. Produceren van de exocriene pancreas kan ook nuttig om drugs te pancreaskanker en pancreatitis richten ontwikkelen. Ook hier, de mate van rijpheid van de exocriene cellen geproduceerd moet grondig worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door achtereenvolgens een NCCR Frontiers in Genetics pilot-award, de Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 41-2009-775 en Grant 12-126875 van Det Frie Forskningsråd / Sundhed og Sygdom. De auteurs danken de Spagnoli lab voor het hosten van de video-opnamen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock kept at -20 °C |
| KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock kept at -20 °C |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock kept at 4 °C |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock kept at -20 °C |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems. |
| EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production |
| Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock kept at 4 °C | |
| Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock kept at -80 °C |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock kept at -20 °C |
| B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock kept at -20 °C |
| Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock kept at -80 °C |
| Matrigel | Corning | 356231 | Stock kept at -20 °C |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock kept at 4 °C |
| RNAlater - RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at RT |
| Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C |
| BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines - stock kept at -20 °C |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock kept at -20 °C |
| 60-well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | |
| Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | |
| Disposal glass micropipettes | Blaubrand | 708745 | |
| Microscope | Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box. Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface. |
||
| Objective | Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance; Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance |
References
- Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
- Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Attali, M., et al. Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme. Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).
- Johansson, K. A., et al. Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types. Dev Cell. 12, 457-465 (2007).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).
- Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Dev Biol. 4, 242-255 (1962).
- Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development. Development. 125, 1017-1024 (1998).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , 3979 (2012).
- Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).
- Hope, K., Bhatia, M. Clonal interrogation of stem cells. Nat Methods. 8, 36-40 (2011).
- Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Sugiyama, T., et al. Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. , (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. , (2009).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 10, (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
