Summary
इस प्रोटोकॉल में वर्णित तीन आयामी संस्कृति विधि एक branched अंग में उनकी पर्याप्त विस्तार, भेदभाव और morphogenesis सहित छितरी भ्रूण माउस अग्न्याशय विनियमन से अग्न्याशय विकास स्मरण दिलाता है. इस विधि इमेजिंग, आला के कार्यात्मक हस्तक्षेप और हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी है.
Introduction
अंग संस्कृति विवो जांच में जटिल लेकिन बहुत प्रासंगिक बीच अंतराल और सेल लाइन मॉडल के सुविधाजनक लेकिन लगभग सिमुलेशन कि पुल एक उपयोगी मॉडल उपलब्ध कराता है. अग्न्याशय के मामले में, एंडोक्राइन और बहि कोशिकाओं का अनुकरण सेल लाइनों से बदल रहे हैं, हालांकि अग्न्याशय progenitors के लिए पूरी तरह से बराबर कोई सेल लाइन है. वयस्क पूरे अग्न्याशय सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता; पृथक अंत: स्रावी टापू सेल प्रसार के बिना कुछ हफ्तों के लिए रखा जा सकता है और ऊतक स्लाइस कुछ घंटे 5 के लिए इन विट्रो में रखा जा सकता है. भ्रूण अग्न्याशय संस्कृति को व्यापक रूप से इसके विकास का अध्ययन करने के लिए न केवल इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह भी 8 प्रक्रियाओं छवि को, उपकला-mesenchymal बातचीत 4,6,7 जांच करने के लिए या रासायनिक उन्हें 9 के साथ हस्तक्षेप करने के लिए. दो अंग संस्कृति तरीकों मुख्य रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं: पहला conve है जो fibronectin लेपित प्लेट 2, पर अग्नाशय कलियों संवर्धन में होते हैंइमेजिंग प्रयोजनों के लिए nient; दूसरा विकल्प संस्कृति को सर्वश्रेष्ठ morphogenesis को बरकरार रखता है, जो हवा तरल इंटरफेस 3,4 पर फिल्टर पर अंगों है. बहुत उपयोगी हालांकि, इन तरीकों सपाट की एक निश्चित डिग्री करने के लिए नेतृत्व; सामान्य विकास की तुलना में और शुरू जनसंख्या अग्नाशय कोशिकाओं और mesenchymal कोशिकाओं के सभी प्रकार के शामिल जटिल है के रूप में progenitors के विस्तार बहुत सीमित है.
संस्कृति करने की क्षमता और छितरी प्राथमिक कोशिकाओं का विस्तार वंश संबंधों का अध्ययन करने और पृथक सेल प्रकार 10 के आंतरिक गुणों को उजागर करने के लिए मूल्यवान है. सुगियामा एट अल. 11 अग्न्याशय progenitors और फीडर परतों पर संस्कृति में 3-5 दिनों के लिए कुछ कार्यात्मक पात्रों को बरकरार रखा कि अंत: स्रावी progenitors बनाए रखने सकता है. Progenitors की प्रकृति / स्टेम कोशिकाओं हालांकि neurospheres 12 और 13 mammospheres करने जैसा Pancreatospheres, वयस्क टापू और ductal कोशिकाओं से विस्तारित किया गया हैइन क्षेत्रों उत्पन्न कि स्पष्ट नहीं है. इसके अलावा, शारीरिक विकास के साथ इसके विपरीत, pancreatospheres कुछ न्यूरॉन्स 14,15 निहित. क्षेत्रों में भी हाल ही में भ्रूण अग्न्याशय progenitors 16,17 और अच्छा पूर्वज विस्तार और बाद में भेदभाव के साथ pancreata 18 regenerating से उत्पादित लेकिन morphogenesis पुनरावृत्ति करने में विफल रहे थे.
छोटी अंगों में स्वयं को संगठित कि फैलाया और अक्सर परिभाषित कोशिकाओं से 3D मॉडल हाल ही में विकसित हुई और इस तरह आंत 19,20, पेट 21, जिगर 22, प्रोस्टेट 23 और ट्रेकिआ के रूप में कई अंगों के विकास या वयस्क कारोबार अनुकरण किया है 24. ऑप्टिक कप 25, आंत 26 या मस्तिष्क 27 के मामले के रूप में कुछ मामलों में, विकास morphogenesis और भेदभाव, ES कोशिकाओं से 3 डी में recapitulated किया गया है.
यहाँ, हम desवे अंतर और स्वयं को संगठित कर सकते हैं एक 3 डी Matrigel पाड़ में अलग multipotent अग्नाशय के progenitors विस्तार करने के लिए एक विधि cribe.
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Protocol
इस प्रोटोकॉल murine E10.5 से व्युत्पन्न अग्नाशय organoids उपकला अग्नाशय कोशिकाओं अलग विकसित करने के लिए करना है.
प्रोटोकॉल पशु प्रयोग के लिए नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता है.
E10.5 माउस भ्रूण से पृष्ठीय अग्नाशय बड के 1. विच्छेदन
- कैंची की एक जोड़ी के साथ पेट खोल, भ्रूण दिन (ई) 10.5 पर समय गर्भवती चूहों बलिदान, दो गर्भाशय सींग हटाने और ठंड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) या Dulbecco से भरा एक 10 सेमी पेट्री डिश में उन्हें जगह संशोधित आवश्यक मध्यम (DMEM) बर्फ पर रखा. सेल बोने के लिए बलिदान से कुल प्रयोग कोशिका क्षति को रोकने के लिए 60-90 मिनट में किया जाता है.
- छोटे कैंची का उपयोग व्यक्तिगत भ्रूण खंडों में गर्भाशय से अलग करें. ठंड पीबीएस के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश के लिए एक भ्रूण स्थानांतरण और ऊपर से रोशनी के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत यह कल्पना. विच्छेदन संदंश के साथ आसपास के मांसपेशियों, पतनिका और जर्दी सा हटानेसी और भ्रूण को बेनकाब. वापस ठंड DMEM मध्यम में भ्रूण रखें. भ्रूण आसानी से एक 3 मिलीलीटर की प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक / ड्रॉपर का उपयोग कर स्थानांतरित किया जा सकता है. आगे बढ़ने से पहले एक समान तरीके से हर व्यक्ति भ्रूण अलग.
- पीबीएस में एक स्वच्छ 35 मिमी पेट्री डिश में एक भ्रूण रखें.
- Forelimb दूर करने के लिए पतली संदंश (0.05 मिमी चौड़ाई) का प्रयोग करें. धीरे रीढ़ की हड्डी क्षेत्र से पाचन तंत्र (चित्रा 1) को अलग करने के लिए खोलने में संदंश डालें. वैकल्पिक: और अधिक सुविधाजनक, पेट देख नीचे जर्दी डंठल नीचे दिल और पूंछ क्षेत्र के लिए, भ्रूण के शरीर के ऊपरी हिस्से को निकालने के लिए.
- पेट, जिगर और आंत का पता लगाएँ. संदंश का प्रयोग, आंत पेट से जठरांत्र संबंधी मार्ग अलग और चित्रा (1) बर्फ पर ठंड DMEM में जगह है. पृष्ठीय अग्नाशय कली पेट के लिए पीछे की ओर, पीछे (चित्रा 1) से जुड़ा हुआ है.
- एक सिमी में हर व्यक्ति के जठरांत्र संबंधी मार्ग को अलगआगे बढ़ने से पहले LAR तरीके से. भ्रूण genotyped किए जाने की जरूरत है, विच्छेदन के समय पूंछ को इकट्ठा करने और बर्फ पर ठंड DMEM के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में एक अलग और साथ में हर व्यक्ति के जठरांत्र संबंधी मार्ग रहते हैं.
- ठंड पीबीएस में एक स्वच्छ 35 मिमी पेट्री डिश में एक जठरांत्र संबंधी मार्ग रखें. अब विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे पृष्ठीय अग्नाशय कली कल्पना और काटना उज्ज्वल क्षेत्र में नीचे से रोशनी का उपयोग करें. इन स्थितियों के संस्करणों के दृश्य को अनुकूलित करेंगे. Electrolytically तेज टंगस्टन सुई या 20 जी सिरिंज सुई का प्रयोग, उपकला के आसपास संभव के रूप में छोटे mesenchyme साथ अग्नाशय कली (चित्रा 1) अलग.
- 2-3 मिनट के लिए एक ठंडा dispase समाधान (1.25 मिलीग्राम / एमएल) युक्त एक पेट्री डिश में पृथक कली स्थानांतरण. इस बिंदु से, स्थानांतरण सबसे सुविधा मुंह नियंत्रित लचीला ट्यूब से जुड़ी फ्लेम खींचा 50 μl कांच capillaries के साथ किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, लेकिन अधिक आरआई के साथकली को खोने का SK, उपयुक्त प्लास्टिक सुझावों के साथ एक 10 μl स्वत: पिपेट (Pipetman) का उपयोग करें.
- सूक्ष्म नियंत्रण में अग्नाशय कली आकांक्षा और इंजेक्शन प्रदर्शन करना. वापस पीबीएस में अग्नाशय कली रखो. इसके अलावा गिलास केशिका (चित्रा 1) का उपयोग सुइयों और कोमल आकांक्षा के साथ mesenchyme से अलग अग्नाशय कली साफ.
- पूरे mesenchyme निकाल दिया जाता है, ठंड पीबीएस में अग्नाशय कली कुल्ला; (60 अच्छी तरह से मिनी ट्रे ठंड DMEM के 10 μl से भरा) व्यक्तिगत कुओं में ठंड DMEM के लिए हर कली हस्तांतरण. यह ऊतक बहुत चिपचिपा बना देता है, जो dispase में mesenchyme दूर करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है.
बिखरे कोशिकाओं के 2. चढ़ाना और संस्कृति
- धोने के लिए 10 μl पीबीएस के साथ भरा 60 अच्छी तरह से मिनी ट्रे की शंक्वाकार कुओं में एक लौ खींच लिया गिलास केशिका साथ सभी भ्रूण से विच्छेदित epithelia स्थानांतरण.
- Trypsin 0.05% एक के 10 μl में कली स्थानांतरणND यह 4 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते करते हैं. 10 μl DMEM + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ एक कुएं में कली के हस्तांतरण से trypsin निष्क्रिय.
- एक विंदुक खींचने के साथ खींच एक पतली केशिका के माध्यम से आकांक्षा से सेल निलंबन अलग कर देना. यह कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए ऊपर और नीचे pipetting जबकि इस स्तर पर बुलबुले से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. अग्न्याशय organoids बेहतर 5-15 कोशिकाओं के छोटे समूहों से शुरू है और इसलिए आंशिक हदबंदी (चित्रा 1) की सिफारिश की है.
- व्यक्तिगत प्रसंस्करण की वजह से मतभेदों को कम करने के क्रम में एक Eppendorf ट्यूब में कई भ्रूण से कोशिकाओं पूल. एक 01:03 के अनुपात में ठंडा Matrigel में सेल निलंबन पतला. विभाज्य एक 96 अच्छी तरह से थाली, 8 μl / अच्छी तरह से या इमेजिंग के लिए अनुकूलित एक थाली में (नीचे देखें) के लिए इस मिश्रण.
- Matrigel गाढ़ा करने के लिए अनुमति देता है, 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं. चुनाव के माध्यम के 70 μl के साथ कुओं भरें (organoid या क्षेत्र, टैब देखेंलेस 1 और 2) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 और 95% हवा युक्त एक humidified वातावरण में छोड़
- हर 4 वें दिन मध्यम बदलें. प्रतिदिन बढ़ रहा है अग्नाशय कालोनियों पर नजर रखने और इमेजिंग द्वारा प्रक्रिया दस्तावेज़.
- पहले 28 रिपोर्ट में ब्याज के छोटे अणुओं या प्रोटीन, हस्तक्षेप प्रयोगों के लिए इस स्तर पर के माध्यम से जोड़ा जा सकता है.
तालिका 1: Organoid मध्यम.
| सामग्री के नाम | शेयर एकाग्रता | अंतिम माध्यम में एकाग्रता | स्टॉक की मात्रा |
| पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन | 100% | 1% | 50 μl |
| पीटा सीरम रिप्लेसमेंट (पूरक) | 100% | 10% | 500 μl |
| 2-mercaptoethanol | 14.3 एम 0.1 मिमी | 1 μl | |
| Phorbol Myristate एसीटेट (पीएमए) | 16 माइक्रोन | 16 एनएम | 5 μl |
| वाई 27,632 (रॉक अवरोध करनेवाला) | 50 मिमी | 10 माइक्रोन | 1 μl |
| EGF | 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर | 25 एनजी / एमएल | 2.5 μl |
| संयोजक मानव 1 आर spondin | 250 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर | 500 एनजी / एमएल | 10 μl |
| - या - | |||
| संयोजक माउस आर spondin 1 | 250 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर | 500 एनजी / एमएल | 10 μl |
| संयोजक मानव FGF1 (aFGF) | 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर | 25 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर | 1.25 μl |
| हेपरिन (Liquemin) | 2500 यू / मिलीलीटर | 2.5 यू / मिलीलीटर | 2 μl |
| सिफारिशbinant मानव FGF10 | 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर | 100 एनजी / एमएल | 5 μl |
| DMEM/F-12 | 4,412.25 μl | ||
| संपूर्ण | 5000 μl |
तालिका 2: क्षेत्र मध्यम.
| सामग्री के नाम | शेयर एकाग्रता | अंतिम माध्यम में एकाग्रता | स्टॉक की मात्रा |
| पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन | 100% | 1% | 50 μl |
| B27 X50 (पूरक) | 100% | 10% | 100 μl |
| संयोजक मानव FGF2 (bFGF) | 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर | 64 एनजी / एमएल | 3.2 μl |
| वाई 27,632 (रॉक अवरोध करनेवाला) | 50 मिमी | 10 माइक्रोन | 1 μl |
| DMEM/F-12 | 4845.8 μl | ||
| संपूर्ण | 5000 μl |
Organoid विकास की प्रगति की 3. इमेजिंग
- छवि organoids किसी दैनिक या समय व्यतीत माइक्रोस्कोपी द्वारा एक फ्लोरोसेंट समय चूक माइक्रोस्कोप का उपयोग. समय चूक इमेजिंग के लिए, xy (जेड) स्वचालित औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें.
- 4 अच्छी तरह प्लेटें या 2-5 एमएल मध्यम से भरा गिलास नीचे प्लेटों में 3 μl की जमा छोटी बूंदों. एक 10x लंबी दूरी उद्देश्य के साथ छवि. नोट: फ्लोरोसेंट tracers व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों का इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए 1 मूवी शो Pdx1-Ngn3-ईआर टीएम IRES-nGFP + चूहों 4 से organoids के प्रारंभिक विस्तार. परमाणु GFP व्यक्तिगत वस्तुओं लेकिन इसी तरह के सिद्धांतों झिल्ली प्रतिदीप्ति के साथ कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए लागू किया जा सकता है के रूप में कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है ऐसेमाउंट / एमजी चूहों के रूप में 29.
- फोकस drifts से बचने और स्वयं भी परिभाषित पदों पर 3 या उससे अधिक दिनों के लिए 1 तस्वीर / घंटा लेने के लिए सॉफ्टवेयर को नियंत्रित स्वचालन सेट करने के लिए कोशिकाओं को बोने के बाद समय चूक इमेजिंग 3 घंटा प्रारंभ करें. हर स्थिति के लिए, फ्लोरोसेंट मार्कर अभिव्यक्ति रिपोर्टिंग, एक अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवि के साथ ही GFP संकेत प्राप्त.
प्रोटोकॉल के लिए Organoids के 4. रिकवरी
- बर्फ पर 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और बर्फ ठंड पीबीएस के साथ की जगह, मध्यम निकालें. यह आंशिक रूप से Matrigel depolymerizes.
- धीरे समग्र वास्तुकला को बाधित नहीं करने के क्रम में एक 1000 μl टिप का उपयोग आसपास के Matrigel हटाने, प्रत्येक व्यक्ति organoid aspirate. बर्फ के ठंडे पीबीएस के साथ एक अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक organoid स्थानांतरण. बर्फ पर थाली रखें. Matrigel में प्रत्यक्ष निर्धारण भी संभव है.
- , 4% paraformaldehyde (पीएफए) में 15 मिनट के लिए organoid फिक्स सुक्रोज में यह cryopreserve और जिलेटिन में एम्बेड. प्रत्येक प्रक्रियाorganoid पहले (जोहानसन एट अल., 2007) 4 के रूप में वर्णित cryosectioning और ऊतक विज्ञान के लिए.
पीसीआर और जैव रसायन के लिए Organoids के 5. वसूली
- बर्फ पर 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और मध्यम निकालें. सेलुलर शाही सेना को स्थिर करने और रक्षा करने के लिए अच्छी तरह से प्रति RNAlater के 60 μl जोड़ें.
- आंशिक रूप से बर्फ पर यह depolymerizing से प्रत्येक अच्छी तरह यंत्रवत् में जेल बाधित. समग्र वास्तुकला बाधित या एक 200 μl टिप के साथ यंत्रवत् जेल में बाधा पहुँचा द्वारा (Matrigel साथ) पूरे अच्छी तरह से ठीक नहीं करने के क्रम में एक 1000 μl टिप का उपयोग कर व्यक्ति organoids की वसूली या तो. एक RNase मुक्त गैर चिपचिपा Eppendorf ट्यूब में अच्छी तरह से सामग्री के हस्तांतरण के लिए एक 1000 μl टिप का उपयोग करें बर्फ पर रखा.
- 60 μl RNAlater साथ कुओं धो लें और एक ही Eppendorf ट्यूब के लिए शेष सामग्री जोड़ें.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 500-1,000 XG पर 5 मिनट के लिए ट्यूब स्पिन
- केवल 20-30 μl छोड़ने, सतह पर तैरनेवाला निकालेंएक साथ गोली के साथ ट्यूब में RNAlater की. जैव रसायन के लिए संभव के रूप में के रूप में सूखी नमूनों की दुकान.
- तुरंत RNAlater में नमूने फ्रीज नहीं है; 4 डिग्री सीओ / एन पर दुकान (RNAlater अच्छी तरह से ऊतक घुसना करने की अनुमति के लिए). ऊतक लंबे समय तक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में ऊतक विघटन और आरएनए की छोटी मात्रा की निकासी के लिए कार्रवाई की जा सकती.
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Representative Results
3 डी Matrigel में अलग और वरीयता प्राप्त E10.5 पृष्ठीय अग्नाशय के progenitors अग्न्याशय विकास पुनरावृत्ति. Progenitors सबसे आसानी से फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ पीछा किया जा सकता. हमारे मामले में हम चित्रा (2) Neurog3 4 सक्रिय किए बिना tamoxifen के अभाव में और इस तरह Pdx1 प्रमोटर (Pdx1-Ngn3-ईआर टीएम nGFP) (1 मूवी) द्वारा नियंत्रित एक परमाणु GFP प्रोटीन व्यक्त करता है कि एक ट्रांसजेनिक माउस का इस्तेमाल किया.
Organoid माध्यम के साथ, कोशिकाओं के छोटे समूहों के एक प्रारंभिक संघनन पहले घंटे में ही होता है. विस्तार तो पहले 4 दिनों में समूहों की वृद्धि (2A चित्रा) से पता लगाया जा सकता है. सुबह 5 से, शाखाओं में 20% सबसे बड़ी organoids में फार्म. एकल कक्षों का विस्तार और बड़े समूहों Pdx1 अभिव्यक्ति 28 को बनाए रखने, जबकि Pdx1 अभिव्यक्ति नहीं खोना है.
इन स्थितियों में, पूर्वज एक कल्पना से गुजरनाbranched उपकला संरचनाओं के उद्भव के साथ Tacular morphogenesis. Progenitors समुदाय संकेतों के लिए एक मजबूत आवश्यकता का संकेत है, ≥ 4 कोशिकाओं समूहों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं केवल जब यह प्रक्रिया जगह लेता है. बहि (एमाइलेस +) या अंत: स्रावी (इंसुलिन + या या तो व्यक्त और विभेदित कोशिकाओं: histological विश्लेषण संस्कृति के दिन 7 के बाद, जिसके परिणामस्वरूप मिनी अंगों अग्नाशय के पूर्वज (3B चित्रा SOX9 + / HNF1B + / Pdx1 + कोशिकाओं) से बना रहे हैं कि पता चलता है ग्लूकागन +) मार्कर (चित्रा 3 ए, सी). अंत: स्रावी कोशिकाओं में भेदभाव (0.1% के आसपास) अंतर्जात अग्न्याशय की तुलना में कम है लेकिन FGF1 संस्कृति के माध्यम से 28 में नहीं जोड़ा जाता है, जब 1% की वृद्धि हुई है. उल्लेखनीय है, वरीयता प्राप्त progenitors उम्मीद अग्नाशय प्रजातियों में अंतर ही नहीं, लेकिन वे भी अनायास सामान्य अग्नाशय वास्तुकला अपनाने. हालांकि ई10.5 multipotent अग्न्याशय progenitors केंद्रीय लुमेन का सामना करना पड़ झिल्ली में Mucin1 और aPKC के अलगाव के द्वारा प्रदर्शन किया और वे एक branched ट्यूबलर नेटवर्क में व्यवस्थित रूप में संस्कृति में कोशिकाओं फूट डालना, polarized नहीं कर रहे हैं. Regionalized "टिप और ट्रंक" डोमेन उभरने: कोष्ठकी कोशिकाओं कोशिकाओं की एक आंशिक या पूर्ण मुकुट के रूप में परिधि पर स्थित हैं, जबकि HNF1B + progenitors और अंत: स्रावी कोशिकाओं, मध्य क्षेत्र में स्थानीयकृत हैं. organoids 10 दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है; इस अवधि के बाद, वे आम तौर पर उनके वास्तु संगठन खोना और पित्ताशय () नहीं दिखाया हो जाते हैं. Passaging आंशिक हदबंदी के बाद किया है, लेकिन जल्दी पुटी गठन, बीएमपी अवरोध करनेवाला नोगिन 28 के अलावा द्वारा कम है कि एक घटना की ओर जाता है किया जा सकता है.
क्षेत्र के माध्यम से, विस्तार और अधिक लगातार और एकल कक्षों के 2% से देखा जाता है; फिर भी क्षेत्र के गठन की दक्षता seede के आकार के साथ संबद्धडी समूहों 28. दिन 2/3 में, एक लुमेन कभार स्थानीय बहुस्तरीय क्षेत्रों (चित्रा 2 बी) के साथ काफी हद तक मोनो स्तरों पर खोखले क्षेत्रों के लिए अग्रणी, उसके बाद छोटे समूहों में पता लगाया है और फैलता है. Matrigel (चित्रा 3 डी एच) से लिया गया है जब इन क्षेत्रों पतन. इन शर्तों के तहत, जिसके परिणामस्वरूप संरचनाओं मुख्य रूप से सुबह 7 बजे भेदभाव बहि और अंत: स्रावी कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत (चित्रा 3 डी एच) के साथ, अग्नाशय के progenitors से बना रहे हैं. सभी कोशिकाओं (चित्रा 3F) के केंद्रीय लुमेन का सामना करना पड़ झिल्ली पर aPKC के अलगाव के द्वारा प्रदर्शन के रूप में क्षेत्रों में progenitors भी, ऊर्ध्वस्थ होते हुए ध्रुवीकृत हो जाते हैं. Pancreatospheres कम से कम दो बार () नहीं दिखाया passaged किया जा सकता है.
चित्रा 1. Procedur के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्वई. आंतों शुरू में भ्रूण से विच्छेदित कर रहा है और बाद में पृष्ठीय अग्नाशय कली अलग है. mesenchyme निकाल दिया जाता है और अग्नाशय के progenitors trypsin का उपयोग कर अलग कर रहे हैं. जिसके परिणामस्वरूप आंशिक रूप से छितरी हुई कोशिकाओं को फिर वृद्धि कारक समाप्त Matrigel में कम घनत्व पर वरीयता प्राप्त हैं. सलाखों के स्केल:. पैमाने बार 200 मीटर है, जहां परिणामस्वरूप organoid तस्वीर के लिए छोड़कर 1.00 मिमी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
समय के साथ संस्कृति की चित्रा 2. प्रगति. (ए) organoid माध्यम के साथ हो गई है और 60 घंटे के लिए, चढ़ाना के बाद 3 घंटे से समय चूक माइक्रोस्कोपी के साथ पीछा किया अग्नाशय के progenitors के एक छोटे समूह. बो मेंttom पैनलों, संस्कृति के 7 दिनों के बाद एक organoid. स्केल पट्टी: 200 माइक्रोन; ए में सभी पैनलों पर लागू होता है एक क्षेत्र (बी) उदाहरण एक 60 घंटा समय व्यतीत पर पीछा किया और संस्कृति की सुबह 7 पर कब्जा कर लिया. स्केल पट्टी: 200 माइक्रोन; बी में सभी पैनलों पर लागू होता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. प्रोटोकॉल. एक 7 दिन की (एसी) धारावाहिक वर्गों पूर्वज (बी - HNF1B) के लिए दाग organoid और भेदभाव (ए - amylase, सी - इंसुलिन) मार्करों. organoid उपकला से बना है (ए - ई cadherin) और ऊर्ध्वस्थ होते हुए (बी - mucin1) polarized कोशिकाओं. धराशायी लाइन गैर कोष्ठकी केंद्रीय क्षेत्र (ए), से मेल खाती है, जहांHNF1B (बी) और अंत: स्रावी (सी) कोशिकाओं का पता चला रहे पूर्वज के लिए दाग 7 दिन के क्षेत्रों (डीएच) वर्गों. (जी - HNF1B, एच - SOX9) और अंत: स्रावी (डी - इंसुलिन और ग्लूकागन) मार्करों. उपकला (ई - ई cadherin) कोशिकाओं - क्षेत्रों ऊर्ध्वस्थ होते हुए (aPKC डी, एफ) polarized से बना रहे हैं. स्केल बार:. 50 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
इन विट्रो में कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं का बड़े पैमाने पर उत्पादन अभी भी 1 अप्रभावी है. इस चुनौतीपूर्ण संदर्भ में, विकास जीव विज्ञान के अध्ययन कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं के भेदभाव के लिए आवश्यक हैं सटीक संकेतों का गूढ़ रहस्य मदद मिल सकती है. इस प्रोटोकॉल विट्रो में भ्रूण अग्नाशय के progenitors के रखरखाव, विस्तार और भेदभाव के लिए अनुमति देता है. यह अन्य endocrine हार्मोन सह व्यक्त नहीं करते कि इंसुलिन के उत्पादन की बीटा कोशिकाओं के निर्माण में शामिल हैं, Pdx1 के उच्च स्तर, इंसुलिन परिपक्व और प्रसंस्कृत इंसुलिन 28 है कि समर्थक convertases व्यक्त किया है. प्रणाली के भीतर ही महत्वपूर्ण कारकों (exogenously हेपरिन द्वारा potentiated गयी FGF द्वारा प्रेरित) FGF की गतिविधि कर रहे हैं और निशान (अंतर्जात) रास्ते संकेतन, साथ ही वाई 27,632 द्वारा रॉक निषेध: उन कारकों के अभाव में नहीं या बहुत organoids और क्षेत्रों की सीमित संख्या 28 उत्पन्न किया गया. FGF के लिए और न आवश्यकताचर्चा गतिविधि आसानी विवो 28 में अग्न्याशय के विकास के लिए उनके महत्व के आधार पर समझा जाता है. रॉक अवरोध करनेवाला हदबंदी दोनों में वृद्धि हुई कोशिका मृत्यु, पूर्वज प्रतिलेखन कारक Pdx1 के एक मजबूत अवरोध और विस्तार की कमी की ओर जाता है पर इस प्रकार microfilament गतिशीलता की कि hyperactivation खुलासा blebbistatin द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. दिलचस्प है, organoid माध्यम के कई अतिरिक्त घटकों को व्यक्तिगत रूप से अनावश्यक होना सिद्ध, लेकिन उनके संयुक्त अभाव में 28 शाखाओं में उपकला के नुकसान के परिणामस्वरूप थे. मध्यम से कुछ आवश्यक घटकों के अलावा, यह progenitors की हदबंदी के स्तर को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है. दरअसल, पूर्वज प्रसार और Pdx1 रखरखाव काफी अधिक से अधिक 4 कोशिकाओं के समूह में पदोन्नत कर रहे हैं. एक संघनन Pdx1 बनाए रखने और विस्तार करने के लिए विफलता में कॉम्पैक्ट परिणाम के लिए पहले 12 घंटे और विफलता के भीतर देखा जा सकता है. रॉक अवरोध करनेवाला इस के लिए आवश्यक हैप्रक्रिया.
FACS छँटाई लेकिन प्रणाली की दक्षता संभावित progenitors के एक नियंत्रित संख्या reaggregating द्वारा सुधार किया जा सकता है के बाद पल organoids पर फार्म नहीं है. इस संस्कृति प्रणाली का एक अन्य महत्वपूर्ण घटक 3 डी मैट्रिक्स है. कोशिकाओं Matrigel पर या थाली प्रसार की तह तक भी बंद Matrigel में डाल दिया है और Pdx1 अभिव्यक्ति खो देते हैं. Matrigel सबसे अधिक संभावना जैव रासायनिक घटकों, विशेषकर laminin के साथ ही यांत्रिक cues 28 प्रदान करता है. दरअसल, मैट्रिक्स की कठोरता एक निर्णायक भूमिका निभाता है. कड़ी हाइड्रोजेल अग्नाशय के progenitors रखरखाव और विस्तार 28 के लिए अनुमोदक नहीं कर रहे हैं और पतला Matrigel या तो नहीं है. Matrigel पतला है जब 01:10 अग्न्याशय पूर्वज सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता.
organoid प्रणाली अस्तित्व, प्रसार, भेदभाव, ध्रुवीकरण के संदर्भ में अग्नाशय के progenitors पर छोटे अणुओं और पुनः संयोजक प्रोटीन के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया और शाखाओं में किया जा सकता है28. यह भी अग्न्याशय विकास 28 के दौरान विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के सहयोग का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं की पहुंच भी अन्य organoid सिस्टम 17,27 में देखा जैसे वायरल लक्ष्यीकरण के रूप में आनुवंशिक जोड़तोड़, की अनुमति देगा कि विश्वास कर रहे हैं. यह यहां 16,17,28 के रूप में पहले के रूप में अच्छी तरह से वर्णित क्षेत्रों के विपरीत morphogenesis सक्षम बनाता है एक प्रणाली के साथ 17 स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम भी विकसित संस्कृति शर्तों सीरम मुक्त होने का फायदा पेश, फीडर से मुक्त और इस तरह सेलुलर और जैव रासायनिक जटिलता को कम करने mesenchyme और रक्त वाहिकाओं से रहित. हालांकि, वहाँ बीतने organoids करने की क्षमता में एक सीमा है और इस प्रकार progenitors की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए. यह गर्भावस्था के दूसरे सप्ताह से 8 वे सप्ताह का बढ़ता हुआ भ्रूण से उत्पादित अग्नाशय के progenitors के सूत्रों के, progenitors अधिक प्रचुर मात्रा में हैं, जहां विकास के बाद के चरणों के लिए प्रोटोकॉल के रूपांतरों द्वारा भविष्य में धोखा दिया जा सकता हैआईसी स्टेम कोशिकाओं (ते) या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) कोशिकाओं. यह मानव अग्न्याशय विकास के एक 3D मॉडल के लिए मार्ग प्रशस्त.
इस प्रणाली को भी संभावित चिकित्सा के भविष्य के परिप्रेक्ष्य में अग्नाशय कोशिकाओं के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस संदर्भ में, प्रत्यारोपण के लिए कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं का उत्पादन संभावित मधुमेह के उपचार में मदद मिलेगी. मानव तों या आईपीएस कोशिकाओं को सिस्टम के रूपांतरों इस उद्देश्य के लिए महत्वपूर्ण होगा. यह organoid या क्षेत्र की स्थिति में इस्तेमाल किया जाना चाहिए या नहीं यह अभी स्पष्ट नहीं है. organoid की स्थिति परिपक्व बीटा कोशिकाओं की कई विशेषताएं हैं लेकिन उनके कार्य परीक्षण किया जाना बना रहता है कि कोशिकाओं के उत्पादन के लिए अनुमति देते हैं. हालांकि, इन कोशिकाओं को वर्तमान में कई नहीं कर रहे हैं और अन्य कोशिकाओं के बीच मिश्रित कर रहे हैं. यह organoid प्रणाली में विविधता के प्रारंभिक उपस्थिति की कोशिकाओं के बीच अनियंत्रित संकेतन की ओर जाता है और इसलिए उत्पादन के लिए हानिकारक है कि यह भी संभावना है.
टीprogenitors का कहना है कि वह क्षेत्र प्रणाली सिद्धांत में progenitors के नियंत्रित विस्तार और passaging के लिए बेहतर है लेकिन उनके बाद भेदभाव से नियंत्रित किया जाना बना रहता है. दूसरों को हाल ही कुशलता से भेदभाव किया जा सकता है कि pancreatospheres का उत्पादन किया है. यह अन्य प्रोटोकॉल 16,17 के साथ प्राप्त क्षेत्रों को भक्षण और सीरम से रहित मौजूदा प्रोटोकॉल में प्राप्त क्षेत्रों की प्रकृति तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण होगा. देखने के एक चिकित्सकीय दृष्टि से, जटिलता और Matrigel की जैविक मूल reproducibility, स्वास्थ्य और scalability का एक मुद्दा बना सकता है. प्रारंभिक परिणाम laminin साथ क्रियाशील मुलायम हाइड्रोजेल विट्रो में अग्नाशय के पूर्वज विस्तार के लिए अनुमोदक हैं कि पता चला है. इन जैल अभी तक Matrigel 28 के रूप में कुशल नहीं हैं के रूप में आगे अनुकूलन की आवश्यकता है.
उनके प्राकृतिक संदर्भ में बीटा कोशिकाओं का उत्पादन भी संभावित बीटा को बढ़ावा देने कि परीक्षण दवाओं के लिए उपयोगी हो सकता हैसेल गतिविधि या उनके अस्तित्व या प्रसार में वृद्धि, लेकिन इस उद्देश्य के लिए यह पहली बार उनके भेदभाव की दक्षता बढ़ाने के लिए और यहाँ प्रस्तुत संस्कृति की स्थिति बेहतर वर्तमान से टापू बनाए रखने परीक्षण है कि क्या, बीटा कोशिकाओं की परिपक्वता की डिग्री का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण होगा निलंबन संस्कृतियों. बहि अग्न्याशय का निर्माण भी अग्नाशय के कैंसर और pancreatitis लक्षित करने के लिए दवाओं के विकास के लिए उपयोगी हो सकता है. यहां भी उत्पादन बहि कोशिकाओं की परिपक्वता की डिग्री अच्छी तरह से जांच करने की आवश्यकता है.
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Acknowledgments
इस काम डेट frie Forskningsråd / Sundhed ओग Sygdom से एक जेनेटिक्स पायलट पुरस्कार में NCCR फ्रंटियर्स, किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन अनुदान 41-2009-775 और अनुदान 12-126875 से क्रमिक रूप से वित्त पोषित किया गया. लेखकों वीडियो शूटिंग की मेजबानी के लिए स्पैगनॉली प्रयोगशाला धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock kept at -20 °C |
| KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock kept at -20 °C |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock kept at 4 °C |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock kept at -20 °C |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems. |
| EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production |
| Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock kept at 4 °C | |
| Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock kept at -80 °C |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock kept at -20 °C |
| B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock kept at -20 °C |
| Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock kept at -80 °C |
| Matrigel | Corning | 356231 | Stock kept at -20 °C |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock kept at 4 °C |
| RNAlater - RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at RT |
| Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C |
| BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines - stock kept at -20 °C |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock kept at -20 °C |
| 60-well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | |
| Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | |
| Disposal glass micropipettes | Blaubrand | 708745 | |
| Microscope | Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box. Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface. |
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| Objective | Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance; Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance |
References
- Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
- Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Attali, M., et al. Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme. Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).
- Johansson, K. A., et al. Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types. Dev Cell. 12, 457-465 (2007).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).
- Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Dev Biol. 4, 242-255 (1962).
- Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development. Development. 125, 1017-1024 (1998).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , 3979 (2012).
- Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).
- Hope, K., Bhatia, M. Clonal interrogation of stem cells. Nat Methods. 8, 36-40 (2011).
- Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Sugiyama, T., et al. Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. , (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. , (2009).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 10, (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
