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Biology

In Vitro pancréas organogenèse du dispersées progéniteurs embryonnaires de souris

doi: 10.3791/51725 Published: July 19, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Le procédé de culture en trois dimensions décrite dans ce protocole récapitule le développement du pancréas de progéniteurs embryonnaires dispersées de pancréas de souris, y compris leur expansion substantielle, la morphogenèse et la différenciation dans un organe ramifié. Ce procédé se prête à l'imagerie, la perturbation fonctionnelle et la manipulation de la niche.

Introduction

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culture d'organes constitue un modèle utile qui comble le fossé entre le complexe mais très pertinente dans les enquêtes in vivo et la simulation pratique mais approximative de modèles de lignées cellulaires. Dans le cas du pancréas, il n'y a pas de ligne parfaitement équivalente à progéniteurs pancréatiques bien qu'il existe des lignées cellulaires transformées simulant des cellules endocrines et exocrines cellule. L'adulte pancréas entier ne peut pas être cultivé; îlots endocrines isolées peuvent être maintenus pendant quelques semaines sans prolifération cellulaire et des tranches de tissu peuvent être conservées in vitro pendant 5 quelques heures. Culture de pancréas embryonnaire a été largement utilisé non seulement pour étudier son développement, mais aussi pour étudier les interactions épithéliales-mésenchymateuses 4,6,7, à l'image des processus 8 ou interférer chimiquement avec eux 9. Deux méthodes de culture d'organes sont principalement utilisés: la première consiste à cultiver des bourgeons pancréatiques sur la fibronectine plaques enduites de 2, ce qui est convenient à des fins d'imagerie; la deuxième option est la culture des organes sur les filtres à l'interface air-liquide qui préserve mieux 3,4 morphogenèse. Bien que très utiles, ces procédés conduisent à un certain degré d'aplatissement; l'expansion des progéniteurs est très limité par rapport au développement normal et à la population de départ est complexe comprenant tous les types de cellules pancréatiques et des cellules mésenchymateuses.

La capacité de la culture et de développer des cellules primaires dispersées est précieux pour étudier les relations de lignage et de découvrir les propriétés intrinsèques des types de cellules isolées 10. Sugiyama et al. 11 pourrait maintenir les progéniteurs du pancréas et des progéniteurs endocrines qui ont conservé certains caractères fonctionnels pour 3-5 jours de culture sur des couches nourricières. Pancreatospheres, semblables à neurosphères 12 et mammospheres 13, ont été élargies de îlots adultes et les cellules canalaires bien que la nature des progéniteurs / cellules souchesqui génèrent ces sphères n'est pas claire. De plus, en contraste avec le développement physiologique, les pancreatospheres contenaient certains neurones 14,15. Sphères ont été récemment produites à partir de progéniteurs pancréatiques embryonnaires 16,17 et régénération pancréas 18 avec une bonne extension des progéniteurs et la différenciation ultérieure, mais n'ont pas réussi à récapituler la morphogenèse.

Des modèles 3D à partir de cellules dispersées et souvent définis que l'auto-organisent dans les organes miniaturisés ont récemment fleuri et simuler le développement ou adulte chiffre d'affaires de plusieurs organes tels que l'intestin 19,20, l'estomac 21, le foie 22, la prostate 23 et la trachée 24. Dans certains cas, la morphogenèse et la différenciation de développement ont été récapitulé en 3D à partir de cellules ES, comme c'est le cas de coupes optiques 25, de l'intestin ou du cerveau 26 27.

Ici, nous avons desCribe un moyen d'étendre progéniteurs pancréatiques multipotentes dissociées dans un échafaudage 3D Matrigel où ils peuvent se différencier et s'auto-organiser.

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Protocol

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Ce protocole a pour but de développer organites pancréatiques murines dérivées de E10.5 dissociées des cellules épithéliales pancréatiques.

Le protocole exige l'approbation éthique pour l'expérimentation animale.

1. Dissection de Dorsale pancréatique Bud de E10.5 embryons de souris

  1. Moyen essentiel sacrifier souris expiré enceintes à jour embryonnaire (E) 10.5, ouvrez l'abdomen avec une paire de ciseaux, enlever les deux cornes utérines et les placer dans une boîte de 10 cm de Pétri remplie avec du phosphate froid tampon salin (PBS) ou Dulbecco modifié (DMEM) conservé dans la glace. L'expérience totale du sacrifice à l'ensemencement des cellules est réalisé en 60 à 90 min pour prévenir les dommages cellulaires.
  2. Séparer l'utérus en segments d'embryons individuels à l'aide de petits ciseaux. Transférer un embryon dans une boîte de Petri de 35 mm avec du PBS froid et le visualiser sous un microscope à dissection avec l'illumination d'en haut. Avec des pinces à dissection enlever le muscle, caduque et jaune entourant sac et exposer l'embryon. Placez l'embryon de retour dans le milieu de DMEM froid. Les embryons peuvent être facilement transférées en utilisant un 3 ml transfert de plastique pipette / compte-gouttes. Isoler chaque embryon individuel d'une manière similaire avant de poursuivre.
  3. Placez un embryon dans une boîte de 35 mm propre Petri dans du PBS.
    1. Utilisez une pince fine (0,05 mm de largeur) pour enlever la patte antérieure. Insérer doucement la pince dans l'ouverture pour détacher le tube digestif, de la région de la moelle épinière (figure 1). OPTION: Pour voir plus facilement l'estomac, retirez la partie supérieure du corps de l'embryon, dans le vif et la région de la queue en dessous de la tige de jaune.
    2. Localiser l'estomac, le foie et l'intestin. Utilisation de la pince, d'isoler le tractus gastro-intestinal entre l'estomac et l'intestin et le placer dans du DMEM froid sur de la glace (figure 1). Le bourgeon pancréatique dorsal est attaché le dos, postérieur à l'estomac (Figure 1).
    3. Isoler tous les tractus gastro-intestinal individu dans une similar manière avant de poursuivre. Si les embryons doivent être génotypés, recueillir la queue au moment de la dissection et de garder tous les tractus gastro-intestinal individu dans une bien différente dans une plaque de 24 puits avec du DMEM froid sur la glace.
  4. Placez un tractus gastro-intestinal dans une boîte de 35 mm propre Petri dans du PBS froid. Maintenant, utilisez un éclairage par le dessous dans le champ lumineux de visualiser et de disséquer le bourgeon pancréatique dorsal sous le microscope de dissection. Ces conditions permettent d'optimiser la visualisation des volumes. En utilisant des aiguilles de tungstène affûtées par voie électrolytique ou 20 g des aiguilles de seringues, d'isoler le bourgeon pancréatique avec aussi peu que possible mésenchyme autour de l'épithélium (figure 1).
    1. Transférer l'œuf isolé dans une boîte de Pétri contenant une solution de dispase froid (1,25 mg / ml) pendant 2-3 min. De ce point, le transfert peut être effectué le plus commodément par des capillaires en verre 50 ul de flamme tiré attachés à un tube flexible bouche contrôlée. Alternativement, mais avec plus de risk de perdre l'œuf, utiliser une pipette 10 ul automatique (Pipetman) avec des pointes en plastique appropriées.
    2. Effectuer pancréatique aspiration des bourgeons et l'éjection sous contrôle microscopique. Mettez le bourgeon pancréatique retour dans PBS. Nettoyer en outre le bourgeon pancréatique isolé du mésenchyme avec les aiguilles et les aspiration douce à l'aide du capillaire en verre (Figure 1).
    3. Lorsque l'ensemble du mésenchyme est enlevée, rincer le bourgeon pancréatique dans du PBS froid; transférer chaque bourgeon de DMEM froid dans des puits individuels (60 et mini-plateaux remplis de 10 ul de DMEM froid). Il est important de ne pas enlever le mésenchyme dans dispase, ce qui rend le tissu très collant.

2. Placage et de la culture de cellules dispersées

  1. Transférer l'épithélium disséqué à partir de tous les embryons avec un capillaire de verre à la flamme tiré dans des puits coniques de 60 puits mini-plateaux remplis avec 10 ul de PBS pour le rinçage.
    1. Transférer l'œuf dans 10 ul de trypsine 0,05% unee laisser incuber à 37 ° C pendant 4 min. Inactiver la trypsine par le transfert de l'œuf dans un puits avec 10 ul de DMEM + 10% de sérum foetal de veau (FCS).
    2. Dissocier la suspension cellulaire par aspiration à travers un capillaire mince tiré avec un extracteur de pipette. Il est important d'éviter les bulles à ce stade tout en aspiration et refoulement de dissocier les cellules. organites du pancréas commencent optimale de petits groupes de 5-15 cellules et donc dissociation partielle est recommandé (Figure 1).
  2. Réunir les cellules provenant de plusieurs embryons dans un tube Eppendorf afin de minimiser les différences dues au traitement individuel. Diluer la suspension de cellules dans le Matrigel refroidi dans un rapport 1:3. Aliquote de ce mélange sur une plaque de 96 puits, 8 pl / puits ou dans une plaque optimisé pour l'imagerie (voir ci-dessous).
  3. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 5 min, ce qui permet d'épaissir le Matrigel. Remplir les puits avec 70 pi de milieu de choix (organoïde ou une sphère, voir Tables figures 1 et 2) et laisser dans un environnement humidifié contenant 5% de CO2 et 95% d'air à 37 ° C.
  4. Remplacez le support tous les 4 e jour. Surveiller les colonies du pancréas augmente chaque jour et documenter le processus par imagerie.
  5. Les petites molécules ou des protéines d'intérêt peuvent être ajoutés au milieu à ce stade, pour des expériences d'interférence, comme 28 indiqué précédemment.

Tableau 1: moyen Organoid.

Nom de la matière Stock Concentration Concentration finale dans le milieu Volume de stock
Pénicilline-streptomycine 100% 1% 50 pl
Sérum remplacement KnockOut (supplément) 100% 10% 500 pl
2-mercaptoéthanol 14,3 M 0,1 mM 1 pl
Phorbol myristate acétate (PMA) 16 uM 16 nM 5 pl
Y-27632 (inhibiteur de ROCK) 50 mM 10 uM 1 pl
EGF 50 pg / ml 25 ng / ml 2,5 pl
Humaine recombinante R-1 Spondin 250 pg / ml 500 ng / ml 10 pl
- Ou -
Recombinant de souris R-1 Spondin 250 pg / ml 500 ng / ml 10 pl
Recombinant humain FGF1 (aFGF) 100 pg / ml 25 pg / ml 1,25 pi
Héparine (Liquemin) 2500 U / ml 2,5 U / ml 2 pl
RecomFGF10 humaine recombinante 100 pg / ml 100 ng / ml 5 pl
DMEM/F-12 4,412.25 pi
Total 5000 pi

Tableau 2: moyen Sphère.

Nom de la matière Stock Concentration Concentration finale dans le milieu Volume de stock
Pénicilline-streptomycine 100% 1% 50 pl
B27 x50 (supplément) 100% 10% 100 pl
FGF2 recombinant humain (bFGF) 100 pg / ml 64 ng / ml 3,2 pl
Y-27632 (inhibiteur de ROCK) 50 mM 10 uM 1 pl
DMEM/F-12 4845,8 ul
Total 5000 pi

3. Imagerie de la progression du développement Organoid

  1. organoïdes Image soit quotidienne ou par faute de temps microscopie fluorescente utilisant un time-lapse microscope. Pour lapse imagerie en temps, utiliser un XY (Z) automatisé du microscope à fluorescence inversé.
  2. De dépôt de petites gouttelettes de 3 ul dans des plaques à 4 puits ou des plaques à fond de verre remplies de 2-5 ml de milieu. Image avec un objectif 10x longue distance. Remarque: Les souris transgéniques exprimant des traceurs fluorescents peuvent être utilisés. Film 1 montre par exemple l'expansion initiale de organoïdes de Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-NGFP + souris 4. La GFP nucléaire permet à l'utilisateur de suivre les cellules sous forme d'objets individuels, mais les mêmes principes peuvent être appliqués pour suivre les cellules présentant une fluorescence de membrane tellecomme mT / mG souris 29.
  3. Lancer imagerie time-lapse 3 heures après l'ensemencement des cellules pour éviter les dérives de discussion et configurer le logiciel d'automatisation de contrôle pour prendre une photo / h pendant 3 jours ou plus à des positions définies manuellement. Pour chaque position, l'acquisition d'une interférence de contraste de l'image différentielle (DIC) ainsi que le signal de la GFP, de rapports expression du marqueur fluorescent.

4. Recouvrement des organites pour histologie

  1. Placer la plaque de 96 puits sur la glace et retirez le support, le remplacer par PBS glacé. Cette dépolymérise partiellement Matrigel.
  2. Aspirer doucement chaque individu organoïde, retirer le Matrigel entourant l'aide d'une pointe de 1000 pi afin de ne pas perturber l'architecture globale. Transférer chaque organoïde à un bien avec le froid de la glace PBS. Conservez la plaque sur la glace. Fixation directe dans le Matrigel est également possible.
  3. Fixer le organoïde pendant 15 min dans du paraformaldéhyde 4% (PFA), la cryoconservation en saccharose et l'intégrer dans la gélatine. Traiter chaqueorganoïde pour cryosectioning et histologie comme décrit précédemment (Johansson et al., 2007) 4.

5. Recouvrement des organites pour la PCR et de biochimie

  1. Placer la plaque de 96 puits sur la glace et retirez le support. Ajouter 60 ul de RNAlater par puits afin de stabiliser et de protéger l'ARN cellulaire.
  2. Perturber le gel dans chaque puits mécaniquement par dépolymérisation partielle sur la glace. Soit récupérer organites individuels en utilisant une pointe de 1000 pi afin de ne pas perturber l'architecture globale ou de récupérer la totalité de bien (avec Matrigel) en perturbant le gel mécaniquement avec une pointe de 200 pi. Utilisez une pointe de 1000 pi de transférer le contenu de puits dans un libre-non-collant le tube Eppendorf RNAse conservé dans la glace.
  3. Laver les puits avec 60 pi RNAlater et ajouter le contenu restant dans le même tube Eppendorf.
  4. Faites tourner les tubes pendant 5 min à 500-1000 g à 4 ° C.
  5. Retirer le surnageant, ne laissant 20-30 pide RNAlater dans le tube en même temps que la pastille. Pour la biochimie, stocker les échantillons secs que possible.
  6. Ne pas congeler les échantillons dans RNAlater immédiatement; conserver à 4 ° CO / N (pour permettre KNAlater de pénétrer en profondeur le tissu). Le tissu peut être conservé à -20 ° C pour une conservation à long terme et peut ensuite être traité pour la rupture des tissus et de l'extraction de petites quantités d'ARN.

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Representative Results

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E10.5 dorsales progéniteurs pancréatiques dissociées et ensemencées en 3D Matrigel récapitulent le développement du pancréas. Progéniteurs peuvent être le plus facilement suivies avec les journalistes fluorescentes. Dans notre cas nous avons utilisé une souris transgénique qui exprime une protéine GFP nucléaire contrôlée par Pdx1 promoteur (Pdx1-Ngn3-ER TM-NGFP) (Film 1) en l'absence de tamoxifène et donc sans activation Neurog3 4 (figure 2).

Avec le milieu organoïde, une compaction initiale de petits amas de cellules se produit dans les premières heures. L'expansion peut alors être détectée par l'élargissement des amas dans les 4 premiers jours (Figure 2A). De jour 5, les branches forment dans les 20% plus grands organites. Les cellules individuelles ne s'étendent pas et perdent l'expression de Pdx1 tandis que les grands groupes conservent expression Pdx1 28.

Dans ces conditions, les progéniteurs subissent une spécificationtacular morphogenèse avec l'émergence de structures épithéliales ramifiés. Ce processus a lieu seulement lorsque les progéniteurs sont ensemencées dans ≥ 4 cellules-groupes, indiquant une forte exigence pour les signaux de la communauté. L'analyse histologique révèle que après jour 7 de la culture, les mini-organes obtenues sont composées de progéniteurs pancréatiques (Sox9 + / HNF1B + / PDX1 + cellules: la figure 3B) et cellules différenciées exprimant soit exocrine (amylase +) ou endocrinien (insuline + ou Glucagon +) des marqueurs (figure 3A, C). La différenciation en cellules endocrines est plus faible que dans le pancréas endogène (environ 0,1%), mais est augmentée à 1% lorsque FGF1 n'est pas ajouté au milieu de culture 28. Remarquablement, non seulement les progéniteurs graines se différencier en lignées pancréatiques attendus, mais ils adoptent aussi spontanément l'architecture pancréatique normale. Bien que E10.5 progéniteurs du pancréas multipotentes ne sont pas polarisés, les cellules en culture polarisent comme démontré par la ségrégation des Mucin1 et aPKC dans la membrane vers la lumière centrale et ils s'organisent en un réseau tubulaire ramifiée. Régionalisés "pointe" et le tronc domaines émergent: HNF1B + progéniteurs et les cellules endocrines sont localisés dans la région centrale, tandis que les cellules acineuses sont situés à la périphérie comme une couronne partielle ou complète des cellules. Les organites peuvent être maintenues en culture pendant 10 jours; après cette période, ils perdent généralement leur organisation architecturale, et deviennent kystique (non représenté). Le repiquage se fait après dissociation partielle, mais conduit à la formation de kystes, un phénomène qui est réduite par l'addition de l'inhibiteur de BMP noggine 28 rapidement.

Avec le support de la sphère, l'expansion est plus fréquente et est considérée de 2% de cellules individuelles; néanmoins l'efficacité de la formation de la sphère est en corrélation avec la taille de la postéritépôles d 28. Au jour 2/3, une lumière est détectée dans les petits agrégats se dilate et par la suite, ce qui conduit à des sphères creuses en grande partie mono-couches avec des couches multiples zones locales ponctuelles (Figure 2B). Ces sphères s'effondrer lors de la récupération de Matrigel (figure 3D-H). Dans ces conditions, les structures résultantes sont principalement composées de progéniteurs pancréatiques, avec un petit pourcentage de cellules exocrines et endocrines différenciées au jour 7 (figure 3D-H). Progéniteurs dans les domaines deviennent également apicale polarisée, comme démontré par la ségrégation des aPKC à la membrane vers la lumière centrale de toutes les cellules (figure 3F). Pancreatospheres peuvent être soumises à des passages au moins deux fois (non représenté).

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique de la procedure. L'tractus gastro-intestinal est initialement disséquée à partir de l'embryon et ensuite le bourgeon pancréatique dorsal est isolé. Le mesenchyme est éliminé et les progéniteurs pancréatiques sont dissociées à l'aide de la trypsine. Les cellules partiellement dispersées résultantes sont ensuite ensemencées à faible densité dans le facteur de croissance appauvri Matrigel. Échelle bars:. 1,00 mm, sauf pour l'image organoïde résultant où la barre d'échelle est de 200 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Progrès de la culture au fil du temps. (A) Un petit groupe de progéniteurs pancréatiques adultes avec le milieu organoïde et suivies par microscopie time-lapse de 3 heures après l'étalement, pour 60 h. Dans la bopanneaux de TTOM, un organoïde après 7 jours de culture. Barre d'échelle: 200 um; s'applique à tous les panneaux en A. (B) Exemple d'une sphère suivi en 60 h time-lapse et capturé au jour 7 de la culture. Barre d'échelle: 200 um; s'applique à tous les panneaux dans B. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Histologie. (AC) Des coupes en série d'un jour 7 organoïde colorées pour ancêtre (B - HNF1B) et la différenciation (A - amylase, C - insuline) marqueurs. Le organoïde est composé des cellules épithéliales (A - E-cadhérine) et apicale polarisée (B - mucin1) cellules. La ligne en pointillés correspond à la région centrale non-acineuse (A), où(-; H - Sox9 HNF1B G) et endocriniens (D - insuline et le glucagon) marqueurs des cellules HNF1B (B) et endocrinien (C) sont (DH) Sections de sphères 7-jour colorés pour ancêtre détectés.. Les sphères sont composées de l'apex polarisée (D, F - aPKC) - cellules (E-cadhérine E) épithéliale. Barre d'échelle:. 50 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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La production à grande échelle de cellules bêta fonctionnelles in vitro est encore inefficace 1. Dans ce contexte difficile, les études de biologie du développement peuvent aider à déchiffrer les signaux exactes qui sont nécessaires à la différenciation des cellules bêta fonctionnelles. Ce protocole permet le maintien, l'expansion et la différenciation des progéniteurs pancréatiques embryonnaires in vitro. Cela comprend la formation des cellules bêta productrices d'insuline qui ne co-expriment pas d'autres hormones du système endocrinien, ont des niveaux élevés de Pdx1, exprimer les pro-convertases qui matures insuline et avoir de l'insuline traitée 28. Facteurs clés importants au sein du système sont l'activité du FGF (exogène stimulée par FGF ajouté potentialisée par l'héparine) et Notch (endogène) les voies de signalisation, ainsi que ROCK-inhibition par Y-27632: en l'absence de ces facteurs, pas ou très un nombre limité de domaines organites et 28 ont été générés. L'obligation pour le FGF et nonactivité ch est facile à comprendre en fonction de leur importance pour le développement du pancréas in vivo 28. inhibiteur de ROCK peut être substitué par blebbistatin, révélant ainsi que l'hyperactivation de la dynamique de microfilaments lors de la dissociation conduit à la fois à la mort cellulaire accrue, une forte inhibition du facteur de transcription Pdx1 progénitrices et un manque d'expansion. Chose intéressante, de nombreux composants supplémentaires du milieu organoïde ont été révélés être inutile individuellement, mais leur absence combinés ont abouti à la perte de l'épithélium de branchement 28. En plus de certains des composants essentiels de la moyenne, il est important de contrôler le taux de dissociation de progéniteurs. En effet, la prolifération des progéniteurs et la maintenance de Pdx1 sont considérablement favorisé par groupes de plus de quatre cellules. Un compactage peut être observée dans les 12 premières heures et l'absence de résultats compacts à défaut de maintenir et d'élargir Pdx1. L'inhibiteur de ROCK est essentielle pour ceprocessus.

Lors des organites de moment ne forment pas après le tri par FACS, mais l'efficacité du système pourrait être amélioré par une réagrégation nombre contrôlé de progéniteurs. Un autre élément essentiel de ce système de culture est la matrice 3D. Les cellules mises sur Matrigel ou dans le Matrigel trop près de la partie inférieure de la plaque de diffusion et perdent l'expression de Pdx1. Matrigel fournit probablement composants biochimiques, notamment la laminine ainsi que des indices mécanique 28. En effet, la rigidité de la matrice joue un rôle central. Hydrogels raides ne sont pas permissives pour progéniteurs pancréatiques entretien et l'extension 28 et dilué Matrigel est pas non plus. Lorsque Matrigel est dilué 1:10 pancréas ancêtre ne peut pas être cultivé.

Le système organoïde peut être utilisé pour tester les effets de petites molécules et de protéines recombinantes sur les progéniteurs pancréatiques en termes de survie, la prolifération, la différenciation, la polarisation et la ramification28. Elle peut également être utilisée pour tester la coopération de différents types cellulaires au cours du développement du pancréas 28. Nous sommes convaincus que l'accessibilité des cellules souches pancréatiques permettra également manipulations génétiques, telles que le ciblage virale, comme on le voit dans d'autres systèmes organoïdes 17,27. Ceci pourrait être utilisé pour le criblage de 17 avec un système qui permet à la différence de la morphogenèse des sphères précédemment décrites ici, ainsi que 16,17,28. Les conditions de culture, nous avons développé également présenter l'avantage d'être dépourvu de sérum, et dépourvue de mésenchyme et les vaisseaux sanguins réduisant ainsi la complexité cellulaire et biochimique sans chargeur. Cependant, il existe une limitation à la capacité de passage des organites et donc d'obtenir de grandes quantités de précurseurs. Cela pourrait être contournée à l'avenir par des adaptations du protocole de stades ultérieurs de développement où les progéniteurs sont plus abondantes, à des sources de progéniteurs pancréatiques produites à partir embryonic souches (ES) des cellules ou souches pluripotentes induites (iPS). Cela ouvre la voie à un modèle 3D du développement du pancréas humain.

Ce système peut également être utilisé potentiellement pour la production de cellules pancréatiques dans la perspective de la future thérapie. Dans ce contexte, la production de cellules bêta fonctionnelles pour une transplantation pourrait potentiellement aider dans le traitement du diabète. Les adaptations du système aux ES humaines ou des cellules iPS serait important à cet effet. Il est encore difficile de savoir si les conditions de organoïdes ou sphère doivent être utilisés. Les conditions organoïdes permettent la production de cellules qui ont plusieurs caractéristiques des cellules bêta matures mais leur fonction reste à tester. Cependant, ces cellules ne sont pas actuellement nombreux et sont mélangés entre autres cellules. Il est également probable que l'apparition précoce de l'hétérogénéité dans le système organoïde conduit à la signalisation incontrôlée entre les cellules et est donc préjudiciable à la production.

Te système de sphère qui maintient les progéniteurs est en principe préférable pour l'expansion contrôlée des passages et des progéniteurs mais leur différenciation subséquente doit encore être contrôlée. D'autres ont récemment produit pancreatospheres qui peuvent être efficacement différenciées. Il sera important de comparer la nature des sphères obtenues dans le protocole actuel dépourvu de mangeoires et de sérum à des sphères obtenues avec les autres protocoles 16,17. D'un point de vue thérapeutique, la complexité et l'origine biologique de Matrigel peuvent constituer un problème de reproductibilité, de la santé et de l'évolutivité. Les résultats préliminaires ont montré que les hydrogels mous fonctionnalisés avec la laminine sont permissives pour l'expansion progénitrices pancréatiques in vitro. Poursuite de l'optimisation est nécessaire que ces gels ne sont pas encore aussi efficace que Matrigel 28.

La production de cellules bêta dans leur contexte naturel pourrait également être potentiellement utiles pour tester des médicaments qui stimulent la bêtal'activité des cellules ou augmenter leur survie ou la prolifération, mais pour ce faire, il sera important de d'abord tester le degré de maturité des cellules bêta, d'accroître l'efficacité de leur différenciation et de vérifier si les conditions de culture présentées ici mieux maintenir îlots que le courant des cultures en suspension. Produire du pancréas exocrine pourrait également être utile pour développer des médicaments pour cibler les cancers du pancréas et la pancréatite. Là encore, le degré de maturité des cellules exocrines produits doit être soigneusement étudiée.

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Acknowledgments

Ce travail a été financé par une séquence PRN Frontiers in Genetics attribution du pilote, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant et Grant 41-2009-775 12-126875 de Sygdom de Det Frie Forskningsråd / Sundhed. Les auteurs remercient le laboratoire Spagnoli pour accueillir le tournage vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
KnockOut Serum replacement (supplement) Gibco 10828-028 Stock kept at -20 °C
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich 3148-25ML Stock kept at 4 °C
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Calbiotech 524400-1MG Stock kept at -20 °C
Y-27632 (ROCK inhibitor) Sigma Aldrich ab120129 Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems.
EGF Sigma Aldrich E9644-2MG Stock kept at -80 °C
Recombinant Human R-spondin 1 R&D 4645-RS-025/CF Stock kept at -80 °C
Recombinant Mouse R-spondin 1 R&D 3474-RS-050 Stock kept at -80 °C
Recombinant Human FGF1 (aFGF) R&D 232-FA-025 Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin) Drossapharm Stock kept at 4 °C
Recombinant Human FGF10 R&D 345-FG-025 Stock kept at -80 °C
DMEM/F-12 Gibco 21331-020
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
B27 x50 (supplement) Gibco 17504-044 Stock kept at -20 °C
Recombinant Human FGF2 (bFGF) R&D 233-FB-025 Stock kept at -80 °C
Matrigel Corning 356231 Stock kept at -20 °C
Trypsin 0.05% Gibco 25300-054 Stock kept at 4 °C
RNAlater - RNA stabilizing reagent Qiagen 76104 Store at RT
Dispase  Sigma Aldrich D4818-2MG Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C
BSA for reconstitution Milipore 81-068 For reconstituition of cytokines  - stock kept at -20 °C
Fetal calf serum (FCS) Gibco 16141079 Stock kept at -20 °C
60-well MicroWell trays Sigma Aldrich M0815-100EA
4-well plates Thermo Scientific 176740
95-well plates F bottom Greiner Bio 6555180
Glas bottom plates Ibidi 81158
Disposal glass micropipettes Blaubrand 708745
Microscope Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box.
Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface.
Objective Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance

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References

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<em>In Vitro</em> pancréas organogenèse du dispersées progéniteurs embryonnaires de souris
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Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).More

Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).

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