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Biology

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

doi: 10.3791/51725 Published: July 19, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Die in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Kulturverfahren rekapituliert Bauchspeicheldrüse Entwicklung von verteilten embryonalen Maus-Pankreasvorläuferzellen, einschließlich ihrer erheblichen Ausweitung, Differenzierung und Morphogenese in einem verzweigten Organ. Dieses Verfahren ist zugänglich Bildgebung, funktionelle Störungen und Manipulationen der Nische.

Introduction

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Orgelkultur bietet ein nützliches Modell, das die Lücken zwischen der komplexen, aber sehr relevant in-vivo-Untersuchungen und die bequeme, aber ungefähre Simulation von Zelllinie Modelle überbrückt. Im Falle der Bauchspeicheldrüse, gibt es keine Zelllinie perfekt entspricht Pankreas-Vorläufer, obwohl es sind transformierte Zellinien Simulation endokrine und exokrine Zellen. Die erwachsenen ganze Bauchspeicheldrüse kann nicht kultiviert werden; endokrinologischen Inseln können für einige Wochen beibehalten werden, ohne die Zellproliferation und Gewebeschnitten können in vitro für einige Stunden 5 gehalten werden. Embryonale Bauchspeicheldrüse Kultur ist weit verbreitet, nicht nur ihre Entwicklung zu studieren, sondern auch epitheliale-mesenchymale Interaktionen 4,6,7 untersuchen, Bild verarbeitet 8 oder 9, um mit ihnen chemisch stören. Zwei Orgelkultur Methoden werden hauptsächlich verwendet: Die erste besteht in der Kultivierung von Bauchspeicheldrüsenknospen auf Fibronektin-beschichtete Platten 2, das ist komfortabler zur Bildgebung; Die zweite Möglichkeit ist die Kultur die Organe über Filter an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, die 3,4 am besten bewahrt Morphogenese. Obwohl sehr nützlich führen diese Verfahren zu einem gewissen Grad der Abflachung; der Ausbau der Vorläufer sehr begrenzt im Vergleich zu der normalen Entwicklung und der Ausgangspopulation Komplex, alle Typen von pankreatischen Zellen und mesenchymalen Zellen.

Die Fähigkeit, Kultur und erweitern verteilten Primärzellen ist wertvoll für Linie Beziehungen zu studieren und entdecken Sie die intrinsischen Eigenschaften von isolierten Zelltypen 10. Sugiyama et al 11. Könnte Pankreas-Vorläufern und endokrine Vorläuferzellen, die einige funktionale Zeichen für 3-5 Tage in Kultur auf Feeder-Schichten beibehalten zu halten. Pancreatospheres, ähnlich Neurosphären mammospheres 12 und 13 sind aus adulten Inseln und duktalen Zellen erweitert worden, obwohl die Art der Vorläufer / Stammzellen, die diese Kugeln zu erzeugen, ist nicht klar. Darüber hinaus im Gegensatz physiologische Entwicklung enthielten die pancreatospheres einige Neuronen 14,15. Kugeln wurden vor kurzem auch aus embryonalen Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse 16,17 und regenerierende Bauchspeicheldrüsen 18 mit guten Vorläufer Expansion und nachfolgende Differenzierung produziert aber nicht Morphogenese rekapitulieren.

3D-Modelle aus dispergierten, oft definierte Zellen, die durch Selbstorganisation miniaturisierten Organen mit blühten und simulieren die Entwicklung oder Erwachsener Umsatz von mehreren Organen, wie dem Darm 19,20, dem Magen 21, Leber 22, die Prostata 23 und die Trachea 24. In einigen Fällen wurden Entwicklungs Morphogenese und Differenzierung von ES-Zellen 3D rekapituliert wurde, wie im Fall der Augenbecher 25, 26 Darm, Gehirn 27.

Hier haben wir describe eine Methode, um multi dissoziierten Pankreas-Vorläuferzellen in einer 3D-Matrigel Gerüst, wo sie differenzieren können und selbst zu organisieren, zu erweitern.

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Protocol

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Dieses Protokoll zielt darauf ab, zu wachsen Bauchspeicheldrüsen Organoide aus murinen E10.5 abgeleitet dissoziiert epithelialen Zellen der Bauchspeicheldrüse.

Das Protokoll erfordert ethische Genehmigung für Tierversuche.

1. Präparation der dorsalen Pankreas-Knospe von E10.5 Maus Embryonen

  1. Sacrifice timed-schwangeren Mäusen an embryonalen Tag (E) 10.5, öffnen Sie den Bauch mit einer Schere entfernen Sie die beiden Uterushörner und legen Sie sie in einem 10-cm-Petrischale mit kaltem Phosphat-Pufferlösung (PBS) gefüllt oder Dulbecco modifiziertem essentiellen Medium (DMEM) auf Eis gehalten. Die Gesamt Experiment aus dem Opfer zu Zellaussaat ist in 60-90 Minuten durchgeführt, um Zellschäden zu verhindern.
  2. Trennen Sie die Gebärmutter in einzelne Segmente Embryo mit einer kleinen Schere. Übertragen eines Embryos auf eine 35 mm Petrischale mit kaltem PBS und visualisieren sie unter einem Binokular mit Beleuchtung von oben. Mit einer Pinzette entfernen Dissektion der umliegenden Muskeln, decidua und Dotter sac und setzen den Embryo. Setzen Sie den Embryo wieder in kaltem DMEM Medium. Embryonen kann leicht mit Hilfe eines 3-ml-Plastiktransferpipette / Dropper übertragen werden. Isolieren jedes einzelnen Embryos in ähnlicher Weise vor dem Fortfahren.
  3. Legen Sie einen Embryo in eine saubere 35-mm-Petrischale in PBS.
    1. Verwenden dünnen Pinzette (0,05 mm Breite), um die Vordergliedmaße zu entfernen. Sanft die Zange im Öffnungseinsatz um den Verdauungstrakt aus dem Rückenmark Region (Fig. 1) zu lösen. Optional: Um bequemer sehen den Magen, entfernen Sie den Oberkörper des Embryos, bis hin zu Herz-und Heckbereich unterhalb des Dotter Stiel.
    2. Suchen Sie den Magen, Leber und Darm. Mit den Zangen, isolieren die Magen-Darmtrakt aus dem Magen in den Darm und legen Sie sie in kaltem DMEM auf Eis (Abbildung 1). Die dorsale Pankreas Knospe dorsal angebracht, hinter dem Magen (Abbildung 1).
    3. Isolieren Sie jeden einzelnen Magen-Darm-Trakt in einer ähnlar Weise, bevor Sie fortfahren. Wenn die Embryonen müssen genotypisierende, sammeln den Schwanz zum Zeitpunkt der Präparation und halten jeden einzelnen Magen-Darm-Trakt in einem anderen auch in einer 24-Well-Platte mit kaltem DMEM auf Eis.
  4. Legen Sie ein Magen-Darm-Trakt in einem sauberen 35 mm Petrischale in kaltem PBS. Jetzt benutze Beleuchtung von unten in Hellfeld unter der Dissektionsmikroskop visualisieren und sezieren die dorsalen Pankreas Knospe. Diese Bedingungen werden die Visualisierung von Volumen zu optimieren. Mit elektrolytisch geschärften Wolfram Nadeln oder 20 G Spritzennadeln, isolieren das Pankreas Knospe mit so wenig wie möglich um Mesenchym des Epithels (Abbildung 1).
    1. Übertragen der isolierten Knospe in eine Petrischale mit einem kalten Dispase-Lösung (1,25 mg / ml) für 2-3 min. Von diesem Punkt kann die Übertragung am einfachsten mit flamm gezogen 50 ul Glaskapillaren mit einem Mund-gesteuerten flexiblen Schlauch befestigt erfolgen. Alternativ, aber mit mehr risk verlieren die Knospe, verwenden Sie eine 10 ul automatischen Pipette (Pipetman) mit entsprechenden Kunststoffspitzen.
    2. Führen Pankreas Knospe Aspiration und Ausstoß unter mikroskopischer Kontrolle. Setzen Sie den Pankreas Knospe zurück in PBS. Weitere aus dem Mesenchym mit den Nadeln und leichtes Ansaugen mit der Glaskapillare (Abbildung 1) reinigen die isolierte Pankreasknospe.
    3. Wenn das gesamte Mesenchym entfernt ist, spülen Sie die Pankreas Knospe in kaltem PBS; Übertragen Sie jede Knospe zu kalt DMEM in einzelnen Vertiefungen (60-well Mini-Trays mit 10 ul kalten DMEM gefüllt). Es ist wichtig, das Mesenchym in Dispase zu entfernen, die das Gewebe sehr klebrig macht.

2. Überzug und Kultur der dispergierten Zellen

  1. Übertragen Sie die seziert Epithelien aus allen Embryonen mit einem flamm gezogen Glaskapillare in konische Vertiefungen der 60-Well-Mini-Trays mit 10 ul PBS gefüllt zum Spülen.
    1. Übertragen Sie die Knospe in 10 ul Trypsin 0,05% einnd lassen Sie es bei 37 ° C inkubieren 4 min. Inaktivierung des Trypsins durch Übertragen der Keim in einem gut mit 10 &mgr; l DMEM + 10% fötales Kälberserum (FCS).
    2. Distanzieren Sie die Zellsuspension durch Aspiration durch eine dünne Kapillare mit einer Pipette Puller gezogen. Es ist wichtig, um Blasen zu vermeiden, in dieser Phase, während und Abpipettieren, um die Zellen zu distanzieren. Bauchspeicheldrüse Organoide optimal vor kleinen Gruppen von 5-15 Zellen beginnen und deshalb teilweise Dissoziation empfohlen (Abbildung 1).
  2. Pool der Zellen aus mehreren Embryonen in ein Eppendorf-Röhrchen, um die Unterschiede aufgrund der individuellen Verarbeitung zu minimieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension in gekühlten Matrigel bei einem Verhältnis von 1:3. Aliquote dieser Mischung in eine 96-Well-Platte, 8 &mgr; l / Vertiefung in einer Platte oder für die Abbildung optimiert (siehe unten).
  3. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 5 Minuten, so dass die Matrigel zu verdicken. Füllen Sie die Vertiefungen mit 70 ul Medium der Wahl (Organoid oder Kugel, siehe Tab.les 1 und 2) und lassen in einer befeuchteten Umgebung mit 5% CO 2 und 95% Luft bei 37 ° C.
  4. Jeden 4. Tag Ersetzen Sie das Medium. Überwachen Sie die wachsenden Kolonien Bauchspeicheldrüsen täglich und dokumentieren den Prozess durch Bildgebung.
  5. Kleine Moleküle oder Proteine ​​von Interesse können dem Medium zu diesem Zeitpunkt für Interferenzexperimente hinzugefügt werden, wie vorher 28 gemeldet.

Tabelle 1: Organoide Medium.

Name des Materials Auf Konzentration Konzentration in endgültige Medium Volumen der Stamm
Penicillin-Streptomycin 100% 1% 50 ul
KnockOut Serum Ersatz (Ergänzung) 100% 10% 500 ul
2-Mercaptoethanol 14,3 M 0,1 mM 1 ul
Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) 16 uM 16 nM 5 ul
Y-27632 (ROCK-Inhibitor) 50 mM 10 uM 1 ul
EGF 50 &mgr; g / ml 25 ng / ml 2,5 ul
Rekombinantem humanem R-1 Spondin 250 &mgr; g / ml 500 ng / ml 10 ul
- Oder -
Recombinant Mouse R-1 Spondin 250 &mgr; g / ml 500 ng / ml 10 ul
Rekombinantem humanem FGF1 (aFGF) 100 &mgr; g / ml 25 &mgr; g / ml 1,25 ul
Heparin (Liquemin) 2500 U / ml 2,5 U / ml 2 ul
Recomnante Menschen FGF10 100 &mgr; g / ml 100 ng / ml 5 ul
DMEM/F-12 4,412.25 ul
Gesamt 5000 ul

Tabelle 2: Sphere Medium.

Name des Materials Auf Konzentration Konzentration in endgültige Medium Volumen der Stamm
Penicillin-Streptomycin 100% 1% 50 ul
B27 x50 (Ergänzung) 100% 10% 100 ul
Recombinant Human FGF2 (bFGF) 100 &mgr; g / ml 64 ng / ml 3.2 ul
Y-27632 (ROCK-Inhibitor) 50 mM 10 uM 1 ul
DMEM/F-12 4845,8 ul
Gesamt 5000 ul

3. Imaging der Progression der Organoide Entwicklung

  1. Bild Organoide mit einem fluoreszierenden Zeitraffer-Mikroskop entweder täglich oder Zeitraffer-Mikroskopie. Für Zeitreihen-Aufnahmen, verwenden Sie ein XY (Z) automatisierte invertierten Fluoreszenzmikroskop.
  2. Kaution kleine Tröpfchen von 3 ul in 4-Well-Platten oder Glasbodenplatten mit 2-5 ml Medium gefüllt ist. Bild mit einem 10-fach Fernziel. Hinweis: Transgene Mäuse, die fluoreszierenden Indikatoren verwendet werden. Film 1 zeigt zum Beispiel die anfängliche Expansion Organoide von Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + 4 Mäuse. Die Kern GFP ermöglicht dem Benutzer, Zellen zu verfolgen als einzelne Objekte aber ähnliche Prinzipien angewendet werden, um Zellen mit Membran Fluoreszenz verfolgt werden,als mT / mg Mäuse 29.
  3. Starten Zeitraffer-Bildgebung 3 Stunden nach dem Aussäen der Zellen, um den Fokus Verwehungen zu vermeiden und setzen die Software die Steuerung Automatisierung, um ein Bild / h für 3 oder mehr Tage bei manuell definierten Positionen zu nehmen. Für jede Position, erwerben eine Differentialinterferenzkontrast (DIC), als auch die GFP-Signal, Reporting Fluoreszenzmarker Ausdruck.

4. Wiederherstellung von Organoide für Histologie

  1. Legen Sie die 96-Well-Platte auf Eis und entfernen Sie das Medium, mit eiskaltem PBS ersetzt. Diese teilweise depolymerisiert Matrigel.
  2. Vorsichtig absaugen jedes einzelne OBs, das Entfernen der umgebenden Matrigel mit einem 1000 ul Spitze, um die Gesamtarchitektur nicht zu stören. Übertragen Sie jede Organoid zu einem gut mit eiskaltem PBS. Halten Sie die Platte auf Eis. Direktbefestigung in Matrigel ist ebenfalls möglich.
  3. Befestigen Sie die Organoid für 15 min in 4% Paraformaldehyd (PFA), Kryokonservierung in Saccharose und binde sie in Gelatine. An jederorganoiden für Kryoschneiden und Histologie wie zuvor beschrieben (Johansson et al., 2007) 4.

5. Organoide Erholung der für die PCR und Biochemie

  1. Legen Sie die 96-Well-Platte auf Eis und entfernen Sie das Medium. In 60 ul pro RNAlater auch zur Stabilisierung und zum Schutz zellulärer RNA.
  2. Stört Sie das Gel in jedem gut mechanisch durch teilweise Depolymerisation es auf Eis. Entweder erholen einzelnen Organoide mit einem 1000 ul Spitze, um die Gesamtarchitektur nicht stören oder Wiederherstellung der kompletten gut (mit Matrigel) durch Unterbrechung der Gel mechanisch mit einer 200 ul Spitze. Verwenden Sie ein 1.000 ul Spitze, die auch Inhalt in ein RNase-frei nicht klebrig Eppendorf-Röhrchen übertragen auf Eis gehalten.
  3. Waschen Sie die Vertiefungen mit 60 ul RNAlater und das restliche Inhalt zum gleichen Eppendorf-Röhrchen.
  4. Dreh die Röhrchen für 5 min bei 500-1.000 x g bei 4 ° C.
  5. Entfernen Sie den Überstand, so dass nur 20-30 ulRNAlater in das Rohr zusammen mit dem Pellet. Für Biochemie, speichern Sie die Proben so trocken wie möglich.
  6. Proben in RNAlater sofort nicht einfrieren; bei 4 ° CO / N (damit RNAlater, um das Gewebe gründlich zu durchdringen). Das Gewebe kann bei -20 ° C zur Langzeitspeicher gespeichert werden und können später zur Gewebezerstörung und Extraktion von kleinen Mengen von RNA verarbeitet werden.

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Representative Results

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E10.5 dorsalen Pankreasvorläuferzellen dissoziiert und in 3D Matrigel ausgesät rekapitulieren Bauchspeicheldrüse Entwicklung. Vorläufer lassen sich am einfachsten mit fluoreszierenden Reporter verfolgt werden. In unserem Fall haben wir eine transgene Maus, die ein Kernprotein mit GFP Pdx1 Promotor (Pdx1-Ngn3-ER-nGFP TM) (Film 1) in Abwesenheit von Tamoxifen und so gesteuert ohne Aktivierung NEUROG3 4 (Fig. 2) drückt.

Mit dem organoiden Medium tritt eine anfängliche Kompaktierung kleine Cluster von Zellen in den ersten Stunden. Expansion kann dann durch die Erweiterung der Cluster in den ersten 4 Tagen (2A) festgestellt werden. Von Tag 5, bilden Filialen in den größten 20% Organoide. Einzelzellen nicht erweitern und verlieren Pdx1 Ausdruck, während die großen Cluster behalten Pdx1 Ausdruck 28.

Unter diesen Bedingungen Vorläuferzellen durchlaufen eine spectacular Morphogenese mit der Entstehung von verzweigten epithelialen Strukturen. Dieser Prozess erfolgt nur, wenn die Vorfahren sind in ≥ 4-Zellen-Cluster ausgesät, was auf eine starke Voraussetzung für Community-Signale. Die histologische Analyse zeigt, dass nach Tag 7 der Kultur, die daraus resultierenden Mini-Organe werden von Pankreas-Vorläuferzellen (SOX9 + / HNF1B + / +-Zellen Pdx1: 3B) zusammengesetzt und differenzierten Zellen entweder exokrinen (Amylase +) oder endokrine (Insulin + oder ausdrücken Glucagon +) Markierungen (3A, C). Die Differenzierung in endokrinen Zellen ist geringer als in der endogenen Pankreas (etwa 0,1%), ist jedoch auf 1% erhöht, wenn FGF1 wird nicht zu dem Kulturmedium 28 aufgenommen. Bemerkenswert ist, nicht nur die Vorläuferzellen ausgesät differenzieren sich in der erwarteten Pankreas-Linien, aber sie sind auch spontan die normale Pankreas-Architektur verabschieden. Obwohl E10.5 multipotente Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse nicht polarisiert ist, die Zellen in Kultur zu polarisieren, wie durch die Trennung der Mucin1 und aPKC in der Membran zugewandten zentralen Lumens gezeigt und sie in einem verzweigten Rohrnetz anzuordnen. Regionalisierte "Spitze und Stamm" Domänen entstehen: HNF1B +-Vorläuferzellen und endokrinen Zellen sind in der zentralen Region lokalisiert, während Azinuszellen an der Peripherie als eine teilweise oder vollständige Krone Zellen. Die Organoide in Kultur für 10 Tage aufrecht erhalten werden; nach dieser Zeit, sie in der Regel verlieren ihre architektonische Organisation und werden zystische (nicht gezeigt). Passagieren können nach teilweiser Dissoziation getan werden, aber führt zu einer Zystenbildung, ein Phänomen, das durch die Zugabe des Inhibitors BMP Noggin 28 schnell verringert wird.

Mit der Kugel Medium, ist die Expansion häufiger und wird von 2% der Einzelzellen gesehen; Dennoch ist die Effizienz der Kugelbildung korreliert mit der Größe des seeded Cluster 28. An Tag 2/3, ist ein Lumen in den kleinen Clustern erkannt und danach erweitert, was zu weitgehend einschichtigen Hohlkugeln mit gelegentlichen lokalen vielschichtigen Bereichen (Abbildung 2B). Diese Kugeln zusammenbrechen, wenn sie von Matrigel (3D-H) abgerufen werden. Unter diesen Bedingungen werden die resultierenden Strukturen, die hauptsächlich aus Bauchspeicheldrüsenvorläuferzellen besteht, mit einem kleinen Prozentsatz der differenzierten exokrinen und endokrinen Zellen am Tag 7 (Fig. 3D-H). Vorläuferzellen in den Sphären auch apikal polarisiert werden, wie durch die Trennung der aPKC an der Membran zugewandten zentralen Lumens aller Zellen (Abbildung 3F) gezeigt. Pancreatospheres mindestens zweimal (nicht gezeigten) passagiert werden.

Figur 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der InverE. Die Magen-Darm-Trakt wird zunächst aus dem Embryo seziert und anschließend die dorsale Pankreas Knospe isoliert. Mesenchym wird entfernt und die Pankreas-Vorläuferzellen werden mit Trypsin dissoziiert. Die resultierende teilweise dispergierten Zellen werden dann bei geringer Dichte in einem Wachstumsfaktor-abgereicherte Matrigel ausgesät. Maßstabsbalken:. 1,00 mm, außer für die resultierende Organoid Bild, wo der Maßstab beträgt 200 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
2. Fortschritt der Kultur über die Zeit. (A) Eine kleine Gruppe von Pankreas-Vorläufer mit dem organoiden Medium gezüchtet und anschließend mit Zeitraffer-Mikroskopie von 3 Stunden nach dem Ausstreichen, für 60 Stunden. In der bottom Platten organoiden nach 7 Tagen Kultur. Maßstabsbalken: 200 um; gilt für alle Platten in A (B) Beispiel einer Kugel, die in einem 60-Stunden-Zeitraffer-und am Tag 7 der Kultur eingefangen. Maßstabsbalken: 200 um; gilt für alle Platten in B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 3
Abbildung 3. Histologie. (AC) Serienschnitte von einer 7-tägigen Organoid für Vorläufer (B - HNF1B) gefärbt und Differenzierung (A - Amylase, C - Insulin) Marker. Die Organoid wird von Epithelzellen aus (A - E-Cadherin) und apikal polarisierten (B - mucin1)-Zellen. Die gestrichelte Linie entspricht dem nicht-acinar mittleren Bereich (A), wobeiHNF1B (B) und endokrine (C)-Zellen erkannt (DH) Abschnitte von 7-Tage-Kugeln für Vorläufer gefärbt. (G - HNF1B, H - SOX9) und endokrine (D - Insulin und Glukagon)-Markern. Epithelzellen (E - E-Cadherin)-Zellen - die Kugeln aus apikal polarisierten (aPKC D, F) zusammengesetzt ist. Maßstab:. Um 50 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Großtechnische Produktion von Funktions Beta-Zellen in vitro ist immer noch ineffektiv ein. In diesem schwierigen Kontext kann der Entwicklungsbiologie Studien helfen, die Entschlüsselung der Signale, die exakte für die Differenzierung von funktionellen Beta-Zellen benötigt werden. Dieses Protokoll ermöglicht die Erhaltung, Expansion und Differenzierung der Pankreas-Vorläuferzellen in embryonalen vitro. Dazu gehören die Bildung von Insulin-produzierenden Beta-Zellen, die nicht mit-exprimieren anderen endokrinen Hormone, haben hohe Pdx1, drücken die pro-Konvertasen, die Insulin reifen und die Insulin 28 verarbeitet. Wichtige Schlüsselfaktoren innerhalb des Systems sind die Aktivität von FGF (exogen aufgenommen von FGF durch Heparin potenziert stimuliert) und Notch (endogene) Signalwege, sowie ROCK-Inhibition durch Y-27632: In Abwesenheit dieser Faktoren keine oder nur sehr begrenzte Anzahl von Organoide und Kugeln erzeugt wurden 28. Die Voraussetzung für FGF und nichtch Aktivität ist leicht anhand ihrer Bedeutung für die Pankreasentwicklung in vivo 28 verstanden. ROCK-Inhibitor kann durch blebbistatin ersetzt werden und zeigt so, dass die Hyperaktivierung des microfilament Dynamik bei der Dissoziation führt sowohl zu erhöhten Zelltod, einer starken Hemmung des Transkriptionsfaktor-Vorläufer Pdx1 und ein Mangel an Expansion. Interessanterweise wurden viele zusätzliche Komponenten des organoiden Medium nachgewiesen individuell unnötig sein, aber ihre Kombination Abwesenheit führte zum Verlust von Epithelzellen Verzweigung 28. Neben einigen wesentlichen Komponenten des Mediums, ist es wichtig, den Grad der Dissoziation von Vorläuferzellen zu steuern. Tatsächlich sind Vorläufer Proliferation und Pdx1 Wartung deutlich in Gruppen von mehr als 4 Zellen befördert. Eine Verdichtung kann innerhalb der ersten 12 Stunden und die Nicht kompakte, führt dazu Pdx1 halten und ausbauen zu beachten. Die ROCK-Hemmer ist für dieseProzess.

Im Moment Organoide bilden keine nach FACS-Sortierung, aber die Effizienz des Systems potentiell von reaggregating eine kontrollierte Anzahl von Vorläuferzellen verbessert werden. Ein weiterer wichtiger Bestandteil des Kultursystems ist die 3D-Matrix. Die Zellen setzen auf Matrigel oder im Matrigel zu nahe an der Unterseite der Platte verteilt und verlieren Pdx1 Ausdruck. Matrigel wahrscheinlich bietet biochemischen Komponenten, insbesondere Laminin sowie mechanische Signale 28. Tatsächlich spielt die Steifigkeit der Matrix eine wichtige Rolle. Stiff Hydrogele sind nicht permissive für Pankreas-Vorläuferzellen Wartung und Erweiterung 28 und verdünnt Matrigel auch nicht. Wenn Matrigel wird 1:10 Bauchspeicheldrüse Vorläufer kann nicht kultiviert werden.

Die organoiden System kann verwendet werden, um die Auswirkungen von kleinen Molekülen und rekombinante Proteine ​​auf Bauchspeicheldrüsenvorläuferzellen in Bezug auf das Überleben, die Proliferation, Differenzierung, Polarisationstest und Verzweigungs28. Es kann auch verwendet werden, um das Zusammenwirken verschiedener Zelltypen während der Pankreasentwicklung 28 zu testen. Wir sind zuversichtlich, dass die Zugänglichkeit von Pankreas-Vorläuferzellen werden auch genetische Manipulationen, wie virale Targeting, wie in anderen Systemen Organoid 17,27 gesehen zu ermöglichen. Dies könnte zum Screenen 17 mit einem System, das die Morphogenese im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen sowie hier 16,17,28 Kugeln können verwendet werden. Die Kulturbedingungen entwickelten wir auch präsentieren den Vorteil, dass Serum-freien, Feeder-frei und frei von Mesenchym und Blutgefäße, wodurch die zelluläre und biochemische Komplexität reduziert wird. Jedoch gibt es eine Beschränkung der Fähigkeit, die Passage Organoiden und somit große Mengen an Vorläuferzellen zu erhalten. Dies könnte in der Zukunft durch Anpassungen des Protokolls zum späteren Stadien der Entwicklung, bei der Vorläuferzellen sind häufiger umgangen werden können, zu den Quellen der Pankreas-Vorläuferzellen aus Embryo erzeugtic Stammzellen (ES-Zellen) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). Dies ebnet den Weg für ein 3D-Modell der menschlichen Bauchspeicheldrüse Entwicklung.

Dieses System kann auch potentiell für die Herstellung von Pankreaszellen in der Zukunftsperspektive der Therapie verwendet werden. In diesem Zusammenhang würde die Herstellung von Funktions Beta-Zellen für die Transplantation potentiell in der Diabetestherapie zu helfen. Die Anpassung des Systems an menschlichen ES-oder IPS-Zellen wäre für diesen Zweck. Es ist noch unklar, ob die Organoid oder Kugel Bedingungen verwendet werden soll. Die organoiden Bedingungen ermöglichen die Herstellung von Zellen, die mehrere Merkmale der reifen Beta-Zellen haben, aber ihre Funktion bleibt zu prüfen. Jedoch sind diese Zellen noch nicht zahlreich und werden unter anderen Zellen gemischt. Es ist auch wahrscheinlich, dass das frühe Auftreten von Heterogenität in der organoiden System führt zu unkontrollierten Signalisierung zwischen Zellen und ist daher nachteilig auf die Produktion.

Ter Kugel-System, das Vorläuferhält grundsätzlich bevorzugt kontrollierten Expansion und Passage von Vorläufern, aber ihre nachfolgende Differenzierung bleibt gesteuert werden. Andere haben vor kurzem hergestellt pancreatospheres, die effizient unterschieden werden können. Es ist wichtig, die Art der in dem aktuellen Protokoll ohne Feeder und Serum zu Kugeln mit den anderen Protokollen 16,17 erhaltenen Kugeln zu vergleichen. Aus therapeutischer Sicht kann die Komplexität und biologische Ursprung der Matrigel ein Problem der Reproduzierbarkeit, Gesundheit und Skalierbarkeit bilden. Erste Ergebnisse haben gezeigt, dass mit weichen Hydrogele Laminin funktionalisiert sind permissiv für Pankreas-Vorläufer Expansion in vitro. Weitere Optimierung erforderlich ist, da diese Gele sind noch nicht so effizient wie Matrigel 28.

Die Produktion von Beta-Zellen in ihrem natürlichen Kontext könnte auch potentiell nützlich, um Medikamente, die Beta-Test zu steigernZellaktivität oder erhöhen ihr Überleben oder Proliferation, aber für diesen Zweck ist es wichtig, zuerst den Reifegrad der Beta-Zellen zu testen, um die Effizienz zu erhöhen und ihre Differenzierung zu testen, ob die Kulturbedingungen hier vorge besser halten als die aktuelle Inseln Suspensionskulturen. Die Herstellung der exokrinen Pankreas könnte auch nützlich, um Drogen, um Bauchspeicheldrüsenkrebs und Pankreatitis Ziel zu entwickeln. Auch hier der Grad der Reife der exokrinen Zellen produziert muss gründlich untersucht werden.

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Acknowledgments

Diese Arbeit wurde nacheinander von einem NFS Frontiers in Genetics Pilot Auszeichnung, Juvenile Diabetes Research Foundation Grants 41-2009-775 und Grant 12-126875 von Det Frie forskningsråd / Sundhed og Sygdom finanziert. Die Autoren danken der Spagnoli Labor für die Ausrichtung der Videoaufnahmen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
KnockOut Serum replacement (supplement) Gibco 10828-028 Stock kept at -20 °C
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich 3148-25ML Stock kept at 4 °C
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Calbiotech 524400-1MG Stock kept at -20 °C
Y-27632 (ROCK inhibitor) Sigma Aldrich ab120129 Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems.
EGF Sigma Aldrich E9644-2MG Stock kept at -80 °C
Recombinant Human R-spondin 1 R&D 4645-RS-025/CF Stock kept at -80 °C
Recombinant Mouse R-spondin 1 R&D 3474-RS-050 Stock kept at -80 °C
Recombinant Human FGF1 (aFGF) R&D 232-FA-025 Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin) Drossapharm Stock kept at 4 °C
Recombinant Human FGF10 R&D 345-FG-025 Stock kept at -80 °C
DMEM/F-12 Gibco 21331-020
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
B27 x50 (supplement) Gibco 17504-044 Stock kept at -20 °C
Recombinant Human FGF2 (bFGF) R&D 233-FB-025 Stock kept at -80 °C
Matrigel Corning 356231 Stock kept at -20 °C
Trypsin 0.05% Gibco 25300-054 Stock kept at 4 °C
RNAlater - RNA stabilizing reagent Qiagen 76104 Store at RT
Dispase  Sigma Aldrich D4818-2MG Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C
BSA for reconstitution Milipore 81-068 For reconstituition of cytokines  - stock kept at -20 °C
Fetal calf serum (FCS) Gibco 16141079 Stock kept at -20 °C
60-well MicroWell trays Sigma Aldrich M0815-100EA
4-well plates Thermo Scientific 176740
95-well plates F bottom Greiner Bio 6555180
Glas bottom plates Ibidi 81158
Disposal glass micropipettes Blaubrand 708745
Microscope Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box.
Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface.
Objective Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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<em>In-vitro-Pankreas</em> Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer
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Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).More

Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).

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