Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

doi: 10.3791/51725 Published: July 19, 2014
* These authors contributed equally

Summary

שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תרבות איבר מספקת מודל שימושי שמגשר על הפערים בין מורכב, אך רלוונטי מאוד בחקירות vivo וסימולציה הנוחה אבל משוערת של מודלים קו סלולרי. במקרה של הלבלב, אין שורת תאים שווה ערך לחלוטין לאבות לבלב למרות שיש הופכים שורות תאים לדמות תאים האנדוקרינית ואקסוקרינית. כל הלבלב המבוגר לא יכול להיות מתורבת; איונים האנדוקרינית מבודדים יכולים להישמר במשך מספר שבועות ללא התפשטות תאים ויכולים להישמר פרוסות רקמה במבחנה לכמה שעות 5. תרבות לבלב עוברי כבר בשימוש נרחב לא רק ללמוד הפיתוח שלה, אלא גם כדי לחקור אינטראקציות אפיתל-mesenchymal 4,6,7, לתמונה מעבדת 8 או להתערב באופן כימי עימם 9. שתי שיטות תרבות איבר משמשות בעיקר: הראשון מורכב בculturing ניצני לבלב על צלחות פיברונקטין מצופה 2, שהוא convenient למטרות הדמיה; האפשרות השנייה היא תרבות האיברים במסננים בממשק האוויר הנוזלי 3,4 השומר הכי טוב המורפוגנזה. למרות שמאוד שימושי, שיטות אלה יביאו למידה מסוימת של השטחה; ההתרחבות של אבות היא מוגבלת מאוד בהשוואה להתפתחות התקינה ולאוכלוסייה מתחילה מורכבת הכוללת את כל הסוגים של תאי לבלב ותאי mesenchymal.

יכולת התרבות ולהרחיב את התאים ראשוניים מפוזרים היא בעל ערך ללמוד יחסי שושלת ולחשוף את התכונות הפנימיות של סוגי תאים מבודדים 10. סוגיאמה ואח' 11. יכול לשמור על אבות לבלב ואת אבות האנדוקרינית שמרה על כמה דמויות פונקציונליות ל3-5 ימים בתרבות בשכבות מזין. Pancreatospheres, בדומה לneurospheres 12 וmammospheres 13, הורחב מאיונים למבוגרים ותאי ductal למרות שטבעו של האבות / תאי גזעשיוצרים תחומים אלה אינו ברור. בנוסף, בניגוד להתפתחות פיזיולוגית, pancreatospheres הכיל כמה נוירונים 14,15. התחומים גם הופקו לאחרונה מאבות עובריים לבלב 16,17 והתחדשות pancreata 18 עם התרחבות אב טובה והבחנה שלאחר מכן, אך לא הצליחו לשחזר המורפוגנזה.

המודלים 3D מהתאים מפוזרים ולעתים קרובות מוגדרים שעצמי לארגן את האיברים מוקטנים פרחו לאחרונה ולדמות את מחזור הפיתוח או מבוגר של איברים מרובים כגון המעי 19,20, הקיבה 21, הכבד 22, הערמונית 23 וקנה הנשימה 24. במקרים מסוימים, המורפוגנזה והתמיינות התפתחותיים כבר סכמו ב3D מתאי גזע עובריים, כמו במקרה של כוסות אופטיות 25, מעי 26 או מוח 27.

כאן, אנו describe שיטה להרחיב אבות לבלב multipotent ניתק בפיגום 3D Matrigel בו הם יכולים לבדל ולארגן את עצמו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה נועד לגדול organoids לבלב שמקורם E10.5 העכברי ניתק תאי לבלב אפיתל.

הפרוטוקול דורש אישור אתי לניסויים בבעלי חיים.

1. Dissection של גב הלבלב באד מE10.5 עוברי עכברים

  1. מדיום חיוני להקריב את העכברים בעיתוי בהריון ביום עוברי (E) 10.5, פתח את הבטן עם זוג מספריים, להסיר את שתי קרנות הרחם ומניח אותם בצלחת פטרי 10 סנטימטר מלא מלוח פוספט הקר חיץ (PBS) או שונה Dulbecco (DMEM) שמר על קרח. הניסוי הכולל מההקרבה לזריעת תאים נעשה ב60-90 דקות על מנת למנוע נזק לתאים.
  2. הפרד את הרחם למקטעי עובר בודדים באמצעות מספריים קטנים. העבר את העובר אחד לצלחת 35 מ"מ פטרי עם PBS הקר ולדמיין אותו תחת מיקרוסקופ לנתח עם תאורה מלמעלה. עם מלקחיים נתיחה להסיר את sa שרירים, decidua וחלמון מסביבג ולחשוף את העובר. מניחים את העובר חזרה למדיום DMEM קר. בקלות ניתן להעביר עוברים באמצעות פיפטה / טפטפת העברת פלסטיק 3 מיליליטר. לבודד את כל עובר בודד בצורה דומה לפני שתמשיך.
  3. הנח לעובר 35 מ"מ צלחת פטרי נקי ב-PBS.
    1. שימוש במלקחיים דקים (0.05 רוחב מ"מ) כדי להסיר את forelimb. הכניסו בעדינות את המלקחיים בפתיחה לנתק את מערכת עיכול מאזור חוט השדרה (איור 1). אופציונלי: כדי לראות בצורה נוחה יותר בבטן, להסיר את החלק העליון של גופו של העובר, עד ללב ובאזור הזנב מתחת לגבעול החלמון.
    2. אתר את הקיבה, הכבד ומעי. באמצעות המלקחיים, לבודד את מערכת העיכול מהקיבה למעי ולמקם אותו בDMEM הקר על קרח (איור 1). ניצן הלבלב הגבי מצורף dorsally, אחורי אל הקיבה (איור 1).
    3. לבודד כל אדם מערכת עיכול בסימיאופן lar לפני שתמשיך. אם העוברים צריכים להיות genotyped, לאסוף את הזנב בעת הנתיחה ולשמור על כל מערכת עיכול בודדת בבאר שונה בצלחת 24 גם עם DMEM הקר על קרח.
  4. הנח בדרכי עיכול באחד 35 מ"מ צלחת פטרי נקייה בקור PBS. עכשיו להשתמש בתאורה מלמטה בשדה בהיר כדי לחזות ולנתח את ניצן הלבלב הגבי תחת מיקרוסקופ לנתיחה. תנאים אלה יהיו לייעל את ההדמיה של כרכים. באמצעות מחטי טונגסטן חדדו אלקטרוליטים או 20 מחטי מזרק G, לבודד את ניצן הלבלב עם mesenchyme מעט ככל האפשר סביב אפיתל (איור 1).
    1. העבר את הניצן המבודד לתוך צלחת פטרי שמכילה תמיסה קרה dispase (1.25 מ"ג / מיליליטר) ל2-3 דקות. מנקודה זו, העברה יכולה ביותר נוחות להיעשות עם 50 נימי זכוכית μl-משך להבה מחוברת לצינור גמיש שבשליטת פה. לחלופין, אבל עם יותר ריsk לאבד הניצן, השתמש פיפטה אוטומטית 10 μl (Pipetman) עם טיפים פלסטיק מתאימים.
    2. בצע שאיפת ניצן לבלב ופליטה תחת שליטה מיקרוסקופית. שים ניצן הלבלב בחזרה ב-PBS. בהמשך לנקות את ניצן הלבלב המבודד מmesenchyme עם המחטים ושאיפה עדינה באמצעות נימי הזכוכית (איור 1).
    3. כאשר כל mesenchyme מוסר, יש לשטוף את ניצן הלבלב בקור PBS; להעביר את כל ניצן לDMEM הקר בבארות בודדות (60 היטב מיני מגשים מלא ב10 μl של DMEM הקר). חשוב שלא להסיר את mesenchyme בdispase, מה שהופך את הרקמה דביקה מאוד.

2. ציפוי ותרבות של תאים מפוזרים

  1. העבר האפיטל גזור מכל העוברים עם נימי זכוכית משכה להבה לתוך בארות חרוטי של 60 היטב מיני מגשים מלא ב10 μl PBS לשטיפה.
    1. העבר את הניצן ל10 μl של 0.05% טריפסיןnd לתת לו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. להשבית טריפסין על ידי העברת הניצן להיטב עם 10 DMEM μl 10% עוברי עגל בסרום + (FCS).
    2. לנתק את ההשעיה התא על ידי שאיפה דרך נימים דקות משכו עם חולץ פיפטה. זה חשוב כדי למנוע בועות בשלב זה תוך pipetting למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. organoids הלבלב להתחיל בצורה אופטימלית מקבוצות קטנות של 5-15 תאים ולכן ניתוק חלקי מומלץ (איור 1).
  2. בריכת תאים מכמה עוברים לתוך צינור Eppendorf על מנת למזער את ההבדלים בשל עיבוד פרט. לדלל את ההשעיה התא בMatrigel המצונן ביחס 1:3. Aliquot את התערובת לצלחת 96 היטב, 8 μl / טוב או בצלחת מותאמת להדמיה (ראה להלן).
  3. דגירה את הצלחת ב-C ° 37 למשך 5 דקות, ומאפשרת Matrigel להתעבות. למלא את הבארות עם 70 μl של מדיום של בחירה (organoid או כדור, ראה לשוניתles 1 ו -2) ולהשאיר בסביבת humidified המכילה 5% CO 2 ו95% אוויר ב37 ° C.
  4. החלף את המדיום בכל יום 4 ה. לפקח על מושבות לבלב גדלה מדי יום ולתעד את התהליך על ידי הדמיה.
  5. ניתן להוסיף מולקולות או חלבונים קטנים של עניין למדיום בשלב זה לניסויי הפרעה, כפי שדווחו בעבר 28.

טבלה 1: בינוני Organoid.

שמו של חומר ריכוז מניות ריכוז במדיום סופי נפח של המניה
פניצילין, סטרפטומיצין 100% 1% 50 μl
החלפת סרום נוקאאוט (תוסף) 100% 10% 500 μl
2-mercaptoethanol 14.3 M 0.1 מ"מ 1 μl
Phorbol Myristate אצטט (PMA) 16 מיקרומטר 16 ננומטר 5 μl
Y-27632 (מעכב ROCK) 50 מ"מ 10 מיקרומטר 1 μl
EGF 50 מיקרוגרם / מיליליטר 25 ng / ml 2.5 μl
האנושי רקומביננטי R-spondin 1 250 מיקרוגרם / מיליליטר 500 ng / ml 10 μl
- או -
רקומביננטי עכבר 1 R-spondin 250 מיקרוגרם / מיליליטר 500 ng / ml 10 μl
FGF1 האנושי רקומביננטי (aFGF) 100 מיקרוגרם / מיליליטר 25 מיקרוגרם / מיליליטר 1.25 μl
הפרין (Liquemin) 2500 U / ml 2.5 U / ml 2 μl
מלFGF10 אדם binant 100 מיקרוגרם / מיליליטר 100 ng / ml 5 μl
DMEM/F-12 4,412.25 μl
סך הכל 5,000 μl

טבלה 2: בינוני כדור.

שמו של חומר ריכוז מניות ריכוז במדיום סופי נפח של המניה
פניצילין, סטרפטומיצין 100% 1% 50 μl
x50 B27 (תוסף) 100% 10% 100 μl
FGF2 האנושי רקומביננטי (bFGF) 100 מיקרוגרם / מיליליטר 64 ng / ml 3.2 μl
Y-27632 (מעכב ROCK) 50 מ"מ 10 מיקרומטר 1 μl
DMEM/F-12 4845.8 μl
סך הכל 5000 μl

3. הדמיה של ההתקדמות של פיתוח Organoid

  1. organoids תמונה אחת ביום, או על ידי מיקרוסקופ הזמן לשגות באמצעות מיקרוסקופ הזמן לשגות ניאון. עבור זמן לשגות הדמיה, השתמש XY מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההפוך אוטומטי (Z).
  2. טיפות קטנות פיקדון של 3 μl בצלחות 4 היטב או צלחות זכוכית תחתונה מלאות ב2-5 בינוני מיליליטר. תמונה עם מטרה למרחקים ארוכים 10x. הערה: ניתן להשתמש בעכברים מהונדסים מבטא קליעים נותבים ניאון. סרט 1 מופעים למשל ההתרחבות הראשונית של organoids מPdx1-Ngn3-ER עכברי TM-ires-nGFP + 4. GFP הגרעיני מאפשר למשתמש לעקוב אחר תאים כיכולים להיות מיושמים אובייקטים בודדים אבל עקרונות דומים כדי לעקוב אחר תאים עם הקרינה קרום כזהכמו עכברי MT / מיליגאוס 29.
  3. להתחיל זמן לשגות הדמיה שעה 3 לאחר זריעת התאים, כדי למנוע סחף להתמקד ולהגדיר האוטומציה שליטה בתוכנה כדי לצלם את 1 / שעה למשך 3 ימים או יותר בעמדות שהוגדרו באופן ידני. לכל תפקיד, לרכוש התערבות ההפרש לעומת זאת תמונה (DIC), כמו גם את אות ה-GFP, דיווח ביטוי סמן פלואורסצנטי.

4. שחזור של Organoids להיסטולוגיה

  1. מניחים את צלחת 96 היטב על קרח ולהסיר את המדיום, והחלפתו עם PBS הקר כקרח. זה depolymerizes חלקית Matrigel.
  2. לשאוב בעדינות כל organoid פרטני, הסרת Matrigel מקיף באמצעות קצה 1,000 μl על מנת שלא לשבש את הארכיטקטורה הכוללת. העבר כל organoid להיטב עם קרח הקר PBS. שמור את הצלחת על קרח. קיבעון ישיר בMatrigel הוא גם אפשרי.
  3. תקן organoid במשך 15 דקות paraformaldehyde 4% (PFA), cryopreserve זה בסוכרוז ולשבץ אותה בג'לטין. לעבד כלorganoid לcryosectioning והיסטולוגיה כמתואר (ג'והנסון et al. 2007) 4 בעבר.

5. שחזור של Organoids לPCR וביוכימיה

  1. מניחים את צלחת 96 היטב על קרח ולהסיר את המדיום. הוסף 60 μl של RNAlater בכל טוב על מנת לייצב ולהגן על RNA התאי.
  2. לשבש את הג'ל בכל אחד גם באופן מכאני על ידי באופן חלקי depolymerizing אותו על קרח. כך או לשחזר organoids הבודד באמצעות טיפ 1,000 μl על מנת שלא לשבש את הארכיטקטורה הכוללת או לשחזר גם כולו (עם Matrigel) ע"י שיבוש ג'ל מכאני עם טיפ μl 200. השתמש קצה 1,000 μl להעביר את התוכן גם לתוך צינור Eppendorf חופשי לא דביק RNAse שמר על קרח.
  3. לשטוף את הבארות עם 60 RNAlater μl ולהוסיף תוכן שנותר לאותו הצינור Eppendorf.
  4. ספין הצינורות במשך 5 דקות ב500-1,000 XG ב 4 ° C.
  5. הסר את supernatant, רק עוזב 20-30 μlשל RNAlater בצינור יחד עם גלולה. לביוכימיה, לאחסן דגימות יבשות ככל האפשר.
  6. אין להקפיא דגימות בRNAlater באופן מיידי; חנות ב 4 ° CO / N (כדי לאפשר RNAlater לחדור את הרקמה ביסודיות). הרקמה יכולה להיות מאוחסנת ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך ובהמשך יכולה להיות מעובד לשיבוש והפקה של כמויות קטנות של RNA ברקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אבות לבלב הגבי E10.5 ניתקו וזורעים ב3D Matrigel לסכם פיתוח לבלב. יכולים בקלות להיות בעקבות אבות עם כתבי ניאון. במקרה שלנו השתמשתי בעכבר מהונדס המבטא את חלבון ה-GFP הגרעינית הנשלט על ידי אמרגן Pdx1 (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (סרט 1) בהעדר טמוקסיפן ובכך ללא הפעלת Neurog3 4 (איור 2).

עם מדיום organoid, דחיסה ראשונית של אשכולות קטנים של תאים מתרחשת בשעות הראשונות. התרחבות אז יכולה להיות מזוהה על ידי הגדלה של האשכולות ב4 הימים הראשונים (איור 2 א). מיום 5, סניפים להיווצר בorganoids הגדול 20%. תאים בודדים לא להרחיב ולאבד את ביטוי Pdx1 אילו האשכולות הגדולים לשמר ביטוי Pdx1 28.

בתנאים אלה, אבות עוברים מפרטהמורפוגנזה tacular עם הופעתה של מבני אפיתל מסועפים. תהליך זה מתרחש רק כאשר האבות הם זורעים ב≥ אשכולות 4 תאים, מה שמעיד על דרישה חזקה לאותות קהילה. ניתוח היסטולוגית מגלה כי לאחר יום 7 בתרבות, מיני איברים וכתוצאה מכך מורכבים של אבות לבלב (SOX9 + / HNF1B + / Pdx1 + תאים: איור 3 ב) ותאים מובחנים להביע או אקסוקרינית (עמילאז +) או האנדוקרינית (או אינסולין + סמני גלוקגון +) (איור 3 א, ג). הבידול לתאים האנדוקרינית הוא נמוך יותר מאשר בלבלב אנדוגני (סביב 0.1%) אך עלה ל -1% כאשר FGF1 לא הוסיפה למדיום התרבות 28. למרבה הפלא, לא רק שאבות seeded להתמיין שושלות לבלב הצפויות, אבל הם גם באופן ספונטני לאמץ את ארכיטקטורת הלבלב הנורמלית. למרות E10.5 אבות לבלב multipotent אינם מקוטבים, התאים בתרבית לקטב כפי שהודגמו על ידי הפרדה של Mucin1 וaPKC בקרום מול לומן המרכזי והם מארגנים לרשת צינורי קנים. תחומים "קצה ותא מטען" Regionalized לצוץ: HNF1B אבות + ותאים האנדוקרינית הם מקומיים באזור המרכז, ואילו תאי acinar ממוקמים בפריפריה ככתר חלקי או מלא של תאים. יכול להישמר organoids בתרבות ל10 ימים; לאחר תקופה זו, הם בדרך כלל להפסיד הארגון הארכיטקטוני שלהם ולהפוך לפיברוזיס (לא מוצג). Passaging יכול להיעשות לאחר ניתוק חלקי אבל במהירות מובילה להיווצרות ציסטה, תופעה שהוא מופחת על ידי התוספת של BMP מעכב Noggin 28.

עם מדיום הכדור, התרחבות היא תכופה יותר והוא ראה מ 2% של תאים בודדים; אף על פי כן את היעילות של היווצרות כדור בקורלציה עם הגודל של seedeאשכולות ד 28. ביום 2/3, לומן הוא זוהה בקבוצות קטנות ומתרחב לאחר מכן, מה שמוביל למידה רבה תחומים חלולים מונו שכבתיים עם אזורים מזדמנים מקומיים רב שכבתיים (איור 2). תחומים אלה יקרסו כאשר נאספו מMatrigel (איור 3D-H). בתנאים אלה, וכתוצאה מכך המבנים מורכבים בעיקר מאבות לבלב, עם אחוז קטן של תאים אקסוקרינית ואנדוקריניות מובחנים ביום 7 (איור 3D-H). אבות בתחומי גם להיות apically מקוטבים, כפי שהודגמו על ידי הפרדה של aPKC בקרום מול לומן של כל התאים (איור 3F) המרכזי. ניתן passaged Pancreatospheres לפחות פעמיים (לא מוצג).

איור 1
איור 1. ייצוג סכמטי של procedurדואר. דרכי העיכול תחילה גזור מן העובר ולאחר מכן ניצן הלבלב הגבי מבודד. Mesenchyme מוסר ואבות הלבלב הם ניתקו באמצעות טריפסין. לאחר מכן התאים באופן חלקי פיזור וכתוצאה מכך הם זורעים בצפיפות נמוכה בMatrigel מדולדל גורם גדילה. שינוי קנה מידה של ברים:. 1.00 מ"מ פרט לתמונת organoid התוצאה שבו סרגל קנה המידה הוא 200 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. התקדמות של התרבות לאורך זמן. מקבץ קטן של אבות לבלב גדלו עם מדיום organoid ואחריו עם מיקרוסקופיה זמן לשגות מ3 שעות לאחר ציפוי, ל60 שעה (). בboלוחות ttom, organoid לאחר 7 ימים של התרבות. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר; חל על כל הפנלים בא (ב) דוגמא של כדור ואחריו בזמן לשגות 60 שעות ונתפסה ביום 7 של התרבות. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר; חל על כל הפנלים בB. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. היסטולוגיה. סעיפים סידוריים (AC) של 7 ימים organoid מוכתמים לאב (ב - HNF1B) ובידול סמנים (- אינסולין - עמילאז, C). Organoid מורכב מאפיתל (- E-cadherin) וapically מקוטב (ב - mucin1) תאים. הקו המקווקו מתאים לאזור המרכז אינו acinar (א '), שבותאי HNF1B (ב ') ומערכת האנדוקרינית (C) מזוהים סעיפים (DH) של תחומים 7 ימים מוכתמים עבור אב. (G - HNF1B; H - SOX9) ומערכת האנדוקרינית - סמנים (D אינסולין וגלוקגון). תחומים מורכבים apically מקוטב (D, F - aPKC) אפיתל (ה - E-cadherin) תאים. בר סולם:. 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ייצור בקנה מידה גדולה של תאי הבטא תפקודיים במבחנה הוא עדיין לא יעיל 1. בהקשר זה מאתגר, לימודי ביולוגיה התפתחותית עשויים לעזור בפענוח האותות המדויקים הנדרשים להתמיינות של תאי הבטא תפקודיים. פרוטוקול זה מאפשר לתחזוקה, ההתרחבות וההתמיינות של תאי אב עובריים בלבלב במבחנה. זה כולל את היווצרותם של תאי הביתא המייצר אינסולין שאינו שיתוף להביע הורמונים אנדוקריניות אחרים, יש רמות גבוהות של Pdx1, להביע הפרו convertases שיבשיל לאינסולין ויש לי אינסולין מעובד 28. גורמי מפתח חשובים במערכת הם פעילותה של FGF (מגורה אקסוגני ידי FGF הוסיף potentiated ידי הפרין) וNotch (אנדוגני) איתות מסלולים, כמו גם ROCK-עיכוב על ידי Y-27632: בהעדר הגורמים אלה, אין או מאוד מספר מוגבל של organoids והתחומים נוצרו 28. הדרישה לFGF ולאפעילות פרק בקלות הבינה מבוססת על חשיבותם לפיתוח לבלב in vivo 28. מעכב ROCK ניתן להחליף על ידי blebbistatin, ובכך חושף היפר שדינמיקת microfilament על דיסוציאציה מובילה לשניהם מוות המוגבר של התאים, עיכוב חזק של Pdx1 גורם שעתוק אב ומחסור בהרחבה. מעניין לציין, שרבי מרכיבים נוספים של מדיום organoid הוכחו להיות בנפרד מיותר, אבל היעדר שילובם הביא להפסד של אפיתל הסתעפות 28. בנוסף לרכיבים חיוניים מסוימים של המדיום, חשוב לשלוט ברמה של דיסוציאציה של אבות. ואכן, ריבוי אב ותחזוקת Pdx1 מקודמים באופן משמעותי בקבוצות של יותר מ 4 תאים. דחיסה ניתן להבחין בתוך שעה הראשונה 12 וכישלון לתוצאות קומפקטיות בכישלון לשמור על Pdx1 ולהתרחב. מעכב ROCK הוא חיוני לכךתהליך.

בorganoids הרגע לא יוצר לאחר FACS מיון, אבל היעילות של המערכת עלולה להיות משופרת על ידי reaggregating מספר מבוקר של תאי אב. עוד מרכיב קריטי של מערכת זו התרבות הוא מטריצת 3D. תאים לשים על Matrigel או בMatrigel הקרוב מדי לתחתית התפשטות הצלחת ולאבד את ביטוי Pdx1. Matrigel סביר להניח שמספק רכיבים ביוכימיים, בעיקר laminin כמו גם רמזים מכאניים 28. ואכן, את הנוקשות של מטריקס משחקת תפקיד מרכזי. הידרוג נוקשה אינו מתירנית לתחזוקת אבות לבלב והרחבה 28 וMatrigel המדולל הוא לא. כאשר Matrigel מדולל 1:10 אב לבלב לא יכול להיות מתורבת.

מערכת organoid יכולה לשמש כדי לבדוק את ההשפעות של מולקולות קטנות וחלבונים רקומביננטיים על אבות לבלב במונחים של הישרדות, התפשטות, התמיינות, קיטוב והסתעפות28. זה יכול לשמש גם כדי לבדוק את שיתוף הפעולה של סוגי תאים שונים במהלך התפתחות לבלב 28. אנו בטוחים כי הנגישות של תאי לבלב תהיה גם לאפשר מניפולציות גנטיות, כגון מיקוד נגיפי, כפי שניתן לראות במערכות organoid אחרות 17,27. זה יכול לשמש לסינון 17 עם מערכת המאפשרת המורפוגנזה בניגוד לתחומים שתוארו לעיל, כמו גם כאן 16,17,28. תנאי התרבות שפיתחנו גם להציג את היתרון של להיות חופשי בסרום, ונטול mesenchyme וכלי דם ובכך להפחית את המורכבות והסלולריות ביוכימי ללא מזין. עם זאת, קיימת מגבלה ביכולת מעבר organoids ובכך להשיג כמויות גדולות של אבות. זה יכול לעקוף בעתיד על ידי התאמות של הפרוטוקול לשלבים מאוחרים יותר של התפתחות שבו אבות הם שופעים יותר, למקורות של אבות לבלב המופקים מembryonגזע ic (ES) תאים או גזע pluripotent מושרה תאים (iPS). זו סוללת את הדרך למודל 3D של פיתוח לבלב אנושי.

מערכת זו יכולה גם עלולה לשמש לייצור של תאי לבלב בפרספקטיבה העתידית של טיפול. בהקשר זה, את הייצור של תאי הבטא תפקודיים להשתלה היה פוטנציאל לסייע בטיפול בסוכרת. ההתאמות של המערכת לES אדם או תאי iPS תהיה חשובות למטרה זו. זה עדיין לא ברור אם יש להשתמש בתנאי organoid או כדור. תנאי organoid יאפשרו הייצור של תאים שיש להם כמה מאפיינים של תאי הבטא בוגרים אבל תפקידם עדיין לא נבדק. עם זאת, תאים אלה הם כיום לא רבים ומעורבבים בין תאים אחרים. כמו כן סביר להניח כי ההופעה המוקדמת של הטרוגניות במערכת organoid מובילה לאיתות בין תאים בלתי מבוקרת ולכן הוא מזיק לייצור.

Tהוא מערכת ששומרת על כדור אבות היא בעיקרון עדיפה להרחבה וpassaging מבוקרים של תאי אב אבל הבידול הבא שלהם עדיין לא בשליטה. אחרים לאחרונה הפיקו pancreatospheres שיכול להיות מובחן ביעילות. זה יהיה חשוב כדי להשוות את האופי של הספירות שהושגו בפרוטוקול הנוכחי נטול מתקני האכלה וסרום לתחומים שהושגו עם הפרוטוקולים האחרים 16,17. מנקודת המבט טיפולית, את המורכבות ואת המקור ביולוגי של Matrigel עלולות להוות בעיה של שחזור, בריאות ויכולת רחבה. תוצאות ראשוניות הראו שהידרוג רך פונקציונליות עם laminin הם מתירנית להתרחבות אב לבלב במבחנה. נדרשת אופטימיזציה נוספת כמו ג'לי אלה עדיין אינו יעילים כמו Matrigel 28.

הייצור של תאי הביתא בהקשר הטבעי שלהם גם עלול להיות שימושי לתרופות בדיקה שלהגביר בטאפעילות תא, או להגדיל את ההישרדות או התפשטותם, אלא למטרה זו חשוב יהיה קודם כל לבדוק את מידת הבשלות של התאים בטא, כדי להגביר את היעילות של הבידול שלהם וכדי לבדוק אם תנאי התרבות שהוצגו כאן טובים יותר לשמור על איים יותר מזו נוכחית תרבויות השעיה. ייצור הלבלב אקסוקרינית יכול להיות שימושי גם לפיתוח תרופות ליעד סרטן ודלקת לבלב לבלב. כאן, שוב, את מידת הבשלות של התאים אקסוקרינית הופקו צריכה להיחקר ביסודיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה ברצף על ידי גבולות NCCR בפרס טייס גנטיקה, Juvenile Diabetes Research Foundation גרנט 41-2009-775 וגרנט 12-126875 מDet Frie Forskningsråd / עוג Sundhed Sygdom. המחברים מודים המעבדה Spagnoli לאירוח וידאו הירי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
KnockOut Serum replacement (supplement) Gibco 10828-028 Stock kept at -20 °C
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich 3148-25ML Stock kept at 4 °C
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Calbiotech 524400-1MG Stock kept at -20 °C
Y-27632 (ROCK inhibitor) Sigma Aldrich ab120129 Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems.
EGF Sigma Aldrich E9644-2MG Stock kept at -80 °C
Recombinant Human R-spondin 1 R&D 4645-RS-025/CF Stock kept at -80 °C
Recombinant Mouse R-spondin 1 R&D 3474-RS-050 Stock kept at -80 °C
Recombinant Human FGF1 (aFGF) R&D 232-FA-025 Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin) Drossapharm Stock kept at 4 °C
Recombinant Human FGF10 R&D 345-FG-025 Stock kept at -80 °C
DMEM/F-12 Gibco 21331-020
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
B27 x50 (supplement) Gibco 17504-044 Stock kept at -20 °C
Recombinant Human FGF2 (bFGF) R&D 233-FB-025 Stock kept at -80 °C
Matrigel Corning 356231 Stock kept at -20 °C
Trypsin 0.05% Gibco 25300-054 Stock kept at 4 °C
RNAlater - RNA stabilizing reagent Qiagen 76104 Store at RT
Dispase  Sigma Aldrich D4818-2MG Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C
BSA for reconstitution Milipore 81-068 For reconstituition of cytokines  - stock kept at -20 °C
Fetal calf serum (FCS) Gibco 16141079 Stock kept at -20 °C
60-well MicroWell trays Sigma Aldrich M0815-100EA
4-well plates Thermo Scientific 176740
95-well plates F bottom Greiner Bio 6555180
Glas bottom plates Ibidi 81158
Disposal glass micropipettes Blaubrand 708745
Microscope Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box.
Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface.
Objective Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
  2. Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
  3. Attali, M., et al. Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme. Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).
  4. Johansson, K. A., et al. Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types. Dev Cell. 12, 457-465 (2007).
  5. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).
  6. Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Dev Biol. 4, 242-255 (1962).
  7. Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development. Development. 125, 1017-1024 (1998).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. 3979 (2012).
  9. Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).
  10. Hope, K., Bhatia, M. Clonal interrogation of stem cells. Nat Methods. 8, 36-40 (2011).
  11. Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).
  12. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  13. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
  14. Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).
  15. Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
  16. Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
  17. Sugiyama, T., et al. Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).
  18. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. (2013).
  19. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. (2009).
  20. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  21. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
  22. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
  23. Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).
  24. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).
  25. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  26. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
  27. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 10, (2013).
  28. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
  29. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
<em>במבחנה</em> הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).More

Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter