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Biology

In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori

doi: 10.3791/51725 Published: July 19, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Il metodo di coltura tridimensionale descritto in questo protocollo ricapitola sviluppo pancreas dispersi da progenitori topo pancreas embrionali, compresa la loro notevole espansione, differenziazione e morfogenesi in un organo ramificato. Questo metodo è suscettibile di immagini, interferenze funzionali e manipolazione della nicchia.

Introduction

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Cultura Organ fornisce un modello utile che colma il divario tra il complesso, ma di grande rilevanza nelle indagini vivo e conveniente, ma approssimativa simulazione di modelli di linee cellulari. Nel caso del pancreas, non vi è alcuna linea cellulare perfettamente equivalente a progenitori pancreas anche se ci si trasformano linee cellulari che simulano cellule endocrine ed esocrine. L'intero pancreas adulto non può essere coltivato; isolato isolotti endocrini possono essere mantenuti per poche settimane senza proliferazione cellulare e fette di tessuto possono essere tenuti in vitro per alcune ore 5. Cultura pancreas embrionale è stato ampiamente utilizzato non solo per studiare il suo sviluppo, ma anche per indagare interazioni epitelio-mesenchimale 4,6,7, all'immagine processi 8 o interferire chimicamente con essi 9. Due organi metodi di coltura sono utilizzati principalmente: la prima consiste nella coltura gemme pancreatiche su piastre rivestite di fibronectina 2, che è conveutile per gli scopi di imaging; la seconda opzione è quella di cultura organi sui filtri all'interfaccia aria-liquido 3,4 che meglio conserva morfogenesi. Sebbene molto utile, questi metodi portano ad un certo grado di appiattimento; l'espansione di progenitori è molto limitato rispetto al normale sviluppo e la popolazione di partenza è complesso comprendente tutti i tipi di cellule pancreatiche e cellule mesenchimali.

La capacità di cultura ed espandere cellule primarie disperse è prezioso per studiare le relazioni lignaggio e scoprire le proprietà intrinseche dei tipi di cellule isolate 10. Sugiyama et al 11. Potrebbe mantenere progenitori pancreas e progenitori endocrini che hanno conservato alcuni caratteri funzionali per 3-5 giorni di coltura su livelli di alimentazione. Pancreatospheres, simile a neurospheres 12 e mammospheres 13, sono stati espansi da isolotti adulte e cellule duttali sebbene la natura dei progenitori / cellule staminaliche generano queste sfere non è chiaro. Inoltre, in contrasto con sviluppo fisiologico, i pancreatospheres contenevano alcuni neuroni 14,15. Spheres sono stati recentemente realizzati da progenitori pancreas embrionale 16,17 e rigenerante pancreas 18 con buona espansione progenitrici e la successiva differenziazione, ma non è riuscito a riepilogare morfogenesi.

Modelli 3D da cellule disperse e spesso definiti che l'auto-organizzano in organi miniaturizzati hanno recentemente fiorito e simulare lo sviluppo o adulto fatturato di più organi quali l'intestino 19,20, 21 stomaco, il fegato 22, la prostata 23 e la trachea 24. In alcuni casi, la morfogenesi di sviluppo e differenziazione sono stati riassunti in 3D da cellule ES, come è il caso di tazze ottiche 25, 26 o intestino cerebrali 27.

Qui, desCRIBE un metodo per espandere dissociate progenitori pancreatici multipotenti in un ponteggio 3D Matrigel dove possono differenziarsi e di auto-organizzarsi.

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Protocol

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Questo protocollo mira a far crescere organoidi pancreatiche derivate da E10.5 murino dissociate cellule pancreatiche epiteliali.

Il protocollo richiede l'approvazione etica per la sperimentazione animale.

1. Dissezione della gemma dorsale del pancreas da E10.5 embrioni di topo

  1. Sacrifica il topo gravide temporizzata a giorno embrionale (E) 10.5, aprire l'addome con un paio di forbici, rimuovere le due corna uterine e metterli in un piatto di 10 centimetri di Petri riempita con fosfato freddo tampone salino (PBS) o Dulbecco modificato mezzo essenziale (DMEM) tenuta in ghiaccio. L'esperimento totale dal sacrificio di semina delle cellule avviene in 60-90 min per prevenire danni cellulari.
  2. Separare l'utero in singoli segmenti di embrioni utilizzando piccole forbici. Trasferire un embrione di un piatto 35 millimetri Petri con PBS freddo e visualizzare sotto un microscopio da dissezione con illuminazione dall'alto. Con una pinza dissezione rimuovere il muscolo, decidua e tuorlo circostante sac ed esporre l'embrione. Posizionare l'embrione di nuovo in mezzo DMEM freddo. Gli embrioni possono essere facilmente trasferiti utilizzando 3 ml di trasferimento di plastica pipetta / contagocce. Isolare ogni singolo embrione in modo simile prima di continuare.
  3. Inserire un embrione in un 35 millimetri piatto pulito Petri in PBS.
    1. Utilizzare pinze sottili (0,05 mm di larghezza) per rimuovere la zampa anteriore. Inserire delicatamente la pinza nell'apertura per staccare il tubo digerente dalla regione del midollo spinale (Figura 1). OPTIONAL: Per vedere più comodamente lo stomaco, rimuovere la parte superiore del corpo dell'embrione, fino al cuore e la regione di coda sotto il gambo tuorlo.
    2. Individuare lo stomaco, il fegato e l'intestino. Utilizzando le pinze, isolare il tratto gastrointestinale dallo stomaco all'intestino e trasferirla in DMEM freddo su ghiaccio (Figura 1). Il germoglio pancreatico dorsale è attaccato dorsalmente, posteriormente allo stomaco (Figura 1).
    3. Isolare ogni individuo tratto gastrointestinale in un Similar modo prima di continuare. Se devono essere genotipizzati gli embrioni, raccogliere la coda al momento della dissezione e mantenere ogni singolo tratto gastrointestinale in un ben diverso in una piastra da 24 pozzetti con DMEM freddo sul ghiaccio.
  4. Posizionare un tratto gastrointestinale in un 35 millimetri piatto pulito Petri in PBS freddo. Ora usate l'illuminazione dal basso in campo chiaro di visualizzare e analizzare il bocciolo pancreatico dorsale sotto il microscopio di dissezione. Queste condizioni di ottimizzare la visualizzazione dei volumi. Usando aghi di tungsteno elettroliticamente-affilati o 20 aghi da siringa G, isolare la gemma pancreatica con il minor mesenchima possibile intorno l'epitelio (Figura 1).
    1. Trasferire il germoglio isolato in una capsula petri contenente una soluzione dispasi fredda (1,25 mg / ml) per 2-3 min. Da questo punto, trasferimento può più convenientemente essere fatto con-tirato fiamma 50 capillari di vetro microlitri collegati ad un tubo flessibile bocca controllato. In alternativa, ma con più risk di perdere la gemma, utilizzare un 10 microlitri pipetta automatica (Pipetman) con appropriati consigli di plastica.
    2. Eseguire pancreatica aspirazione nascere ed espulsione sotto controllo microscopico. Mettere la gemma pancreatica nel PBS. Ulteriori pulire la gemma pancreatica isolato dal mesenchima con gli aghi e aspirando delicatamente utilizzando la capillare di vetro (Figura 1).
    3. Quando l'intero mesenchima viene rimosso, sciacquare la gemma pancreatica in PBS freddo; trasferire ogni germoglio di DMEM freddo nei singoli pozzetti (60 pozzetti mini-vaschette riempite con 10 ml di DMEM freddo). È importante non rimuovere mesenchima in dispasi, che rende il tessuto molto appiccicoso.

2. Placcatura e la coltura di cellule dislocati

  1. Trasferire gli epiteli sezionato da tutti gli embrioni con un bicchiere capillare tirato fiamma nei pozzetti conici di 60 pozzetti mini-vassoi riempiti con 10 microlitri di PBS per il risciacquo.
    1. Trasferire il germoglio in 10 ml di tripsina 0,05% and lasciate incubare a 37 ° C per 4 min. Inattivare la tripsina trasferendo il germoglio in un pozzo con 10 microlitri DMEM + 10% di siero fetale bovino (FCS).
    2. Dissociare la sospensione cellulare per aspirazione attraverso una capillare sottile tirato con un estrattore pipetta. È importante evitare bolle in questa fase mentre pipettando su e giù per dissociare le cellule. Organoidi pancreas in modo ottimale a partire da piccoli gruppi di 5-15 cellule e quindi la dissociazione parziale è raccomandata (Figura 1).
  2. Si riuniscono le cellule da diversi embrioni in una provetta Eppendorf per minimizzare le differenze dovute al trattamento individuale. Diluire la sospensione cellulare in refrigerate Matrigel in un rapporto 1:3. Aliquotare questa miscela in una piastra a 96 pozzetti, 8 microlitri / pozzetto in una piastra o ottimizzato per l'imaging (vedi sotto).
  3. Incubare la piastra a 37 ° C per 5 minuti, consentendo al Matrigel per addensare. Riempire i pozzetti con 70 ml di mezzo di sua scelta (organoide o sfera, vedi Tables 1 e 2) e lasciare in un ambiente umidificata contenente il 5% di CO 2 e il 95% aria a 37 ° C.
  4. Sostituire il mezzo ogni 4 ° giorno. Monitorare le crescenti colonie pancreatiche quotidiana e documentare il processo di imaging.
  5. Piccole molecole o proteine ​​di interesse possono essere aggiunti al mezzo in questa fase per esperimenti di interferenza, come riportato in precedenza 28.

Tabella 1: media organoide.

Nome del materiale Archivio Concentrazione Concentrazione nel mezzo finale Volume di magazzino
Penicillina-Streptomicina 100% 1% 50 microlitri
Sostituzione Serum KnockOut (supplemento) 100% 10% 500 microlitri
2-mercaptoetanolo 14.3 M 0,1 mm 1 ml
Phorbol Myristate acetato (PMA) 16 micron 16 Nm 5 microlitri
Y-27632 (inibitore ROCK) 50 mM 10 pM 1 ml
EGF 50 mg / ml 25 ng / ml 2,5 microlitri
Ricombinante umana R-spondina 1 250 mg / ml 500 ng / ml 10 microlitri
- O -
Ricombinante mouse R-spondina 1 250 mg / ml 500 ng / ml 10 microlitri
FGF1 ricombinante umano (aFGF) 100 pg / ml 25 mcg / ml 1.25 microlitri
Eparina (Liquemin) 2500 U / ml 2,5 U / ml 2 microlitri
Recombinant FGF10 umano 100 pg / ml 100 ng / ml 5 microlitri
DMEM/F-12 4,412.25 microlitri
Totale 5.000 pl

Tabella 2: Sphere medie.

Nome del materiale Archivio Concentrazione Concentrazione nel mezzo finale Volume di magazzino
Penicillina-Streptomicina 100% 1% 50 microlitri
B27 x50 (supplemento) 100% 10% 100 microlitri
FGF2 ricombinante umano (bFGF) 100 pg / ml 64 ng / ml 3.2 microlitri
Y-27632 (inibitore ROCK) 50 mM 10 pM 1 ml
DMEM/F-12 4.845,8 ml
Totale 5000 microlitri

3. Imaging della progressione dello Sviluppo organoide

  1. Organoidi fotografia sia giornaliero o mediante microscopia time lapse utilizzando un microscopio a fluorescenza time-lapse. Per l'imaging lasso di tempo, utilizzare un XY (Z) microscopio a fluorescenza invertito automatizzato.
  2. Deposito piccole goccioline di 3 ml in piastre 4 pozzetti o piastre con fondo di vetro riempiti con 2-5 ml di media. Immagine con un obiettivo 10x lunga distanza. Nota: I topi transgenici che esprimono traccianti fluorescenti possono essere utilizzati. Movie 1 mostra per esempio l'espansione iniziale di organoidi da Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + mouse 4. La GFP nucleare consente all'utente di monitorare le cellule come singoli oggetti ma principi simili possono essere applicati per monitorare le cellule con membrana fluorescenza talecome mT / mG topi 29.
  3. Inizia time-lapse imaging 3 ore dopo la semina delle cellule per evitare derive di messa a fuoco e impostare l'automazione di controllo software di prendere 1 foto / h per 3 o più giorni in posizioni definite manualmente. Per ogni posizione, acquisire un contrasto interferenziale immagine (DIC), nonché il segnale GFP, notifica espressione marcatore fluorescente.

4. Recupero di organoidi di Istologia

  1. Posizionare la piastra a 96 pozzetti su ghiaccio e rimuovere il mezzo, sostituendolo con ghiaccio PBS freddo. Questo depolimerizza parzialmente Matrigel.
  2. Aspirare delicatamente ogni singolo organoide, rimuovendo il Matrigel circostante con una punta di 1.000 ml, al fine di non perturbare l'architettura complessiva. Trasferire ciascun organoide a un pozzo con ghiaccio freddo PBS. Mantenere la piastra su ghiaccio. Fissaggio diretto in Matrigel è anche possibile.
  3. Fissare la organoide per 15 minuti a 4% paraformaldeide (PFA), criopreservare in saccarosio e incorporarlo in gelatina. Elaborare ogniorganoide per criosezionamento e istologia come precedentemente descritto (Johansson et al., 2007) 4.

5. Recupero di organoidi per la PCR e Biochimica

  1. Posizionare la piastra a 96 pozzetti su ghiaccio e rimuovere il supporto. Aggiungere 60 ml di RNAlater per pozzetto per stabilizzare e proteggere RNA cellulare.
  2. Interrompere il gel in ogni pozzetto meccanicamente da parte depolimerizzante su ghiaccio. O ripristinare singoli organoidi con una punta di 1.000 ml, al fine di non perturbare l'architettura generale o recuperare l'intero bene (con Matrigel) interrompendo il gel meccanicamente con una punta di 200 microlitri. Utilizzare una punta di 1.000 microlitri di trasferire il contenuto e in un libero non appiccicosa provetta Eppendorf RNAsi tenuto in ghiaccio.
  3. Lavare i pozzetti con 60 microlitri RNAlater e aggiungere il resto del contenuto alla stessa provetta Eppendorf.
  4. Centrifugare le provette per 5 min a 500-1000 xga 4 ° C.
  5. Rimuovere il surnatante, lasciando solo il 20-30 microlitridi RNAlater nel tubo insieme al pellet. Per biochimica, conservare i campioni più asciutto possibile.
  6. Non congelare i campioni in RNAlater immediatamente; conservare a 4 ° CO / N (per consentire RNAlater di penetrare a fondo il tessuto). Il tessuto può essere conservato a -20 ° C per una conservazione a lungo termine e può essere successivamente trattati per frammentazione del tessuto e l'estrazione di piccole quantità di RNA.

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Representative Results

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E10.5 dorsali progenitori pancreatici dissociate e seminate in 3D Matrigel ricapitolano sviluppo del pancreas. Progenitori possono essere più facilmente seguiti con i giornalisti fluorescenti. Nel nostro caso abbiamo utilizzato un topo transgenico che esprime una proteina GFP nucleare controllata dal promotore Pdx1 (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (film 1) in assenza di tamoxifene e quindi senza attivare NEUROG3 4 (Figura 2).

Con il mezzo organoide, una compattazione iniziale di piccoli gruppi di cellule si verifica nelle prime ore. Espansione può quindi essere rilevato dall'allargamento dei cluster nei primi 4 giorni (Figura 2A). Dal giorno 5, i rami formano nei 20% più grandi organoidi. Singole cellule non si espandono e perdono l'espressione Pdx1 mentre i grandi gruppi mantengono espressione Pdx1 28.

In queste condizioni, progenitori subiscono una specificatacular morfogenesi con l'emergere di strutture epiteliali ramificate. Questo processo avviene solo quando i progenitori vengono seminate in ≥ 4-celle cluster, indicando una forte esigenza per i segnali della comunità. L'analisi istologica rivela che dopo la 7a giornata della cultura, risultanti mini-organi sono composti da cellule progenitrici del pancreas (SOX9 + / HNF1B + / Pdx1 + cellule: Figura 3B) e le cellule differenziate che esprimono sia esocrina (amilasi +) o endocrine (insulina + o glucagone +) marcatori (Figura 3A, C). La differenziazione in cellule endocrine è inferiore nel pancreas endogeno (circa 0,1%), ma viene aumentata a 1% quando FGF1 non viene aggiunto al mezzo di coltura 28. Sorprendentemente, non solo i progenitori teste di serie si differenziano in lignaggi pancreatici attesi, ma anche adottare spontaneamente normale architettura del pancreas. Anche se E10.5 progenitori multipotenti pancreas non sono polarizzati, le cellule in coltura polarizzano come dimostrato dalla segregazione di Mucin1 e aPKC nella membrana rivolta verso il lume centrale e si organizzano in una rete tubolare ramificata. Regionalizzate "punta e del tronco" domini emergono: HNF1B + progenitori e cellule endocrine sono localizzate nella regione centrale, mentre le cellule acinose si trovano alla periferia come una corona parziale o completa delle cellule. Le organoidi possono essere mantenute in coltura per 10 giorni; dopo questo periodo, generalmente perdono la loro organizzazione architettonica e diventano cistica (non mostrato). Passaging può essere fatto dopo dissociazione parziale ma rapidamente porta alla formazione di cisti, un fenomeno che si riduce con l'aggiunta del BMP inibitore Noggin 28.

Con il mezzo sfera, l'espansione è più frequente ed è visto dal 2% di singole cellule; tuttavia l'efficienza di formazione di sfera correla con la dimensione del seeded cluster 28. Al giorno 2/3, un lume viene rilevato in piccoli gruppi e si espande, successivamente, portando a gran parte sfere cave mono-strato con occasionali aree multistrato locali (Figura 2b). Queste sfere collassano quando viene recuperato da Matrigel (Figura 3D-H). In queste condizioni, le strutture risultanti sono costituite principalmente da progenitori pancreatici, con una piccola percentuale di cellule esocrine ed endocrine differenziate al giorno 7 (Figura 3D-H). Progenitori nelle sfere diventano apicalmente polarizzata, come dimostra la segregazione di aPKC alla membrana rivolta verso il lume centrale di tutte le cellule (Figura 3F). Pancreatospheres possono essere diversi passaggi almeno due volte (non mostrato).

Figura 1
Figura 1. Rappresentazione schematica della immissioe. Il tratto gastro-intestinale è inizialmente sezionato dall'embrione e successivamente il germoglio pancreatico dorsale è isolato. Il mesenchima viene rimosso e le cellule progenitrici del pancreas sono dissociate con tripsina. Le risultanti cellule parzialmente disperse vengono poi seminate a bassa densità fattore di crescita-impoverito Matrigel. Scala: bar. 1,00 millimetri, tranne per l'immagine organoide risultante in cui la barra della scala è di 200 micron prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Progresso della cultura nel tempo. (A) Un piccolo gruppo di cellule progenitrici del pancreas cresciuti con il mezzo organoide e seguite con la microscopia time-lapse da 3 ore dopo la placcatura, per 60 ore. Nel bopannelli ttom, un organoide dopo 7 giorni di coltura. Scala bar: 200 micron; si applica a tutti i pannelli in A. (B) Esempio di una sfera seguita in un 60 hr time-lapse e catturato al giorno 7 della cultura. Scala bar: 200 micron; si applica a tutti i pannelli in B. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Istologia. (AC) Sezioni seriali di un giorno 7 organoide colorate per progenitore (B - HNF1B) e differenziazione (A - amilasi, C - insulina) marcatori. Il organoide è composto epiteliale (A - E-caderina) e apicale polarizzata (B - mucin1) cellule. La linea tratteggiata corrisponde alla regione centrale non acinose (A), doveVengono rilevati HNF1B (B) ed endocrino (C) cellule (DH) Sezioni di sfere di 7 giorni colorate per progenitore. (G - H - HNF1B; SOX9) ed endocrine (D - insulina e glucagone) marcatori. Le sfere sono composte da apicalmente polarizzata (D, F - aPKC) epiteliale (E - E-caderina) cellule. Barra della scala:. Di 50 micron , cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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La produzione su larga scala delle cellule beta funzionali in vitro è ancora inefficace 1. In questo contesto impegnativo, studi di biologia dello sviluppo possono aiutare decifrare i segnali esatti che sono necessari per la differenziazione delle cellule beta funzionali. Questo protocollo consente per la manutenzione, l'espansione e la differenziazione di progenitori pancreatici embrionali in vitro. Ciò include la formazione di cellule beta produttrici di insulina che non co-express altri ormoni endocrini, hanno alti livelli di Pdx1, esprimere le pro-convertasi che maturano insulina e l'insulina hanno elaborato 28. Fattori chiave rilevanti del sistema sono l'attività di FGF (esogenamente stimolato da FGF aggiunto potenziato da eparina) e Notch (endogena) vie di segnalazione, nonché ROCK-inibizione da Y-27632: in assenza di tali elementi, nulla o molto numero limitato di organoidi e sfere sono stati generati 28. Il requisito per FGF e Nonattività ch è facilmente comprensibile in base alla loro importanza per lo sviluppo pancreas in vivo 28. Inibitore ROCK può essere sostituito da blebbistatin, rivelando così che iperattivazione della dinamica microfilamenti upon dissociazione conduce sia aumento della morte cellulare, una forte inibizione del fattore di trascrizione progenitore Pdx1 e una mancanza di espansione. È interessante notare che molti componenti aggiuntivi del mezzo organoide sono rivelate essere singolarmente inutile, ma la loro assenza combinato provocato la perdita di epiteliale ramificazione 28. Inoltre, per alcuni componenti essenziali del mezzo, è importante controllare il livello di dissociazione dei progenitori. Infatti, la proliferazione progenitore e manutenzione Pdx1 sono significativamente promossi in gruppi di più di 4 celle. La compattazione può essere osservato entro il primo 12 ore e la mancata risultati compatti in caso di insufficienza di mantenere Pdx1 ed espandersi. L'inibitore ROCK è essenziale per questoprocesso.

Al momento organoidi non formano dopo FACS cernita ma l'efficienza del sistema potrebbe potenzialmente essere migliorata riaggregazione un numero controllato di progenitori. Un altro componente critico di questo sistema di coltura è la matrice 3D. Cellule messo su Matrigel o nel Matrigel troppo vicino alla parte inferiore della piastra di diffusione e perdono espressione Pdx1. Matrigel più probabile che fornisce componenti biochimici, in particolare laminina nonché spunti meccanico 28. Infatti, la rigidità della matrice gioca un ruolo fondamentale. Stiff idrogel non sono permissive per progenitori pancreatici mantenimento e l'espansione 28 e Matrigel diluito non è neanche. Quando Matrigel viene diluito 1:10 pancreas progenitore non può essere coltivato.

Il sistema organoide può essere utilizzato per testare gli effetti di piccole molecole e proteine ​​ricombinanti su progenitori pancreatici in termini di sopravvivenza, la proliferazione, la differenziazione, la polarizzazione e la ramificazione28. Può anche essere usato per testare la cooperazione di diversi tipi cellulari durante lo sviluppo pancreas 28. Siamo fiduciosi che l'accessibilità delle cellule progenitrici del pancreas consentirà anche manipolazioni genetiche, come ad esempio il targeting virale, come si è visto in altri sistemi organoide 17,27. Questo potrebbe essere utilizzato per lo screening 17 con un sistema che permette morfogenesi in contrasto con le sfere descritte precedentemente e qui 16,17,28. Le condizioni di coltura abbiamo sviluppato presentano anche il vantaggio di essere privo di siero e privo di mesenchima e vasi sanguigni riducendo così la complessità cellulare e biochimica senza alimentatore. Tuttavia, vi è una limitazione nella capacità di passaggio le organoidi e quindi di ottenere grandi quantità di progenitori. Questo potrebbe essere aggirato in futuro adattamenti del protocollo di fasi successive di sviluppo in cui progenitori sono più abbondanti, a fonti di cellule progenitrici del pancreas prodotti da embryonic staminali (ES), le cellule o indotte pluripotenti staminali (cellule iPS). Questo spiana la strada a un modello 3D di sviluppo pancreas umano.

Questo sistema può anche potenzialmente essere utilizzato per la produzione di cellule pancreatiche in prospettiva futura di terapia. In questo contesto, la produzione di cellule beta funzionali per trapianto sarebbe potenzialmente aiutare nella terapia del diabete. Gli adattamenti del sistema di ES umani o cellule iPS sarebbe importante per questo scopo. Non è ancora chiaro se devono essere utilizzate le condizioni organoide o sfera. Le condizioni organoide consentono la produzione di cellule che hanno diverse caratteristiche delle cellule beta mature ma la loro funzione rimane da testare. Tuttavia, queste cellule non sono attualmente numerosi e sono mescolati tra le altre cellule. È anche probabile che la comparsa precoce di eterogeneità nel sistema organoide conduce alla segnalazione incontrollata tra cellule ed è quindi dannosa per la produzione.

Tegli sfera sistema che mantiene progenitori in linea di principio preferibile per espansione controllata e passaging di progenitori ma loro successiva differenziazione rimane da controllare. Altri hanno recentemente prodotto pancreatospheres che possono essere differenziati in modo efficiente. Sarà importante confrontare la natura delle sfere ottenute nel protocollo corrente privo di alimentatori e siero a sfere ottenute con altri protocolli 16,17. Da un punto di vista terapeutico, la complessità e l'origine biologica di Matrigel possono costituire un problema di riproducibilità, la salute e scalabilità. I risultati preliminari hanno dimostrato che idrogel morbide funzionalizzati con laminina sono permissive per l'espansione progenitrici del pancreas in vitro. Ulteriore ottimizzazione è richiesto come questi gel non sono ancora efficienti come Matrigel 28.

La produzione di cellule beta nel loro contesto naturale potrebbe anche potenzialmente essere utile per testare farmaci che amplificano betaattività delle cellule o aumentare la loro sopravvivenza o proliferazione ma per questo scopo sarà importante per testare prima il grado di maturazione delle cellule beta, per aumentare l'efficienza della loro differenziazione e per verificare se le condizioni di coltura presentate qui meglio mantenere isolotti quello attuale colture in sospensione. Produrre il pancreas esocrino potrebbe anche essere utile per sviluppare farmaci a bersaglio i tumori del pancreas e pancreatite. Anche in questo caso, il grado di maturazione delle cellule esocrine prodotte deve essere accuratamente studiato.

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Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato in sequenza da un PRN Frontiere della genetica premio pilota, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant e Grant 41-2009-775 12-126875 da Det Frie forskningsråd / Sundhed og Sygdom. Gli autori ringraziano il laboratorio Spagnoli per ospitare le riprese video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
KnockOut Serum replacement (supplement) Gibco 10828-028 Stock kept at -20 °C
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich 3148-25ML Stock kept at 4 °C
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Calbiotech 524400-1MG Stock kept at -20 °C
Y-27632 (ROCK inhibitor) Sigma Aldrich ab120129 Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems.
EGF Sigma Aldrich E9644-2MG Stock kept at -80 °C
Recombinant Human R-spondin 1 R&D 4645-RS-025/CF Stock kept at -80 °C
Recombinant Mouse R-spondin 1 R&D 3474-RS-050 Stock kept at -80 °C
Recombinant Human FGF1 (aFGF) R&D 232-FA-025 Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin) Drossapharm Stock kept at 4 °C
Recombinant Human FGF10 R&D 345-FG-025 Stock kept at -80 °C
DMEM/F-12 Gibco 21331-020
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
B27 x50 (supplement) Gibco 17504-044 Stock kept at -20 °C
Recombinant Human FGF2 (bFGF) R&D 233-FB-025 Stock kept at -80 °C
Matrigel Corning 356231 Stock kept at -20 °C
Trypsin 0.05% Gibco 25300-054 Stock kept at 4 °C
RNAlater - RNA stabilizing reagent Qiagen 76104 Store at RT
Dispase  Sigma Aldrich D4818-2MG Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C
BSA for reconstitution Milipore 81-068 For reconstituition of cytokines  - stock kept at -20 °C
Fetal calf serum (FCS) Gibco 16141079 Stock kept at -20 °C
60-well MicroWell trays Sigma Aldrich M0815-100EA
4-well plates Thermo Scientific 176740
95-well plates F bottom Greiner Bio 6555180
Glas bottom plates Ibidi 81158
Disposal glass micropipettes Blaubrand 708745
Microscope Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box.
Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface.
Objective Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
  2. Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
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<em>In Vitro</em> Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori
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Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).More

Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).

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